基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计.docx

基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计.docx

《基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计.docx（35页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计

武汉轻工大学

毕业设计（论文）

设计（论文）题目：

基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计

姓名王梦博

学号101204307

院（系）电气与电子工程学院

专业电子信息科学与技术

指导教师李鸣

2014年6月15日

目录

摘要I

AbstractII

第1章：

绪论1

1.1拉曼效应1

1.2拉曼技术的发展1

1.3国内外研究现状及本课题研究的意义2

1.4论文结构及各章节内容3

第2章：

拉曼光谱基本理论4

2.1光散射与拉曼效应的原理4

2.2拉曼散射的量子解释5

2.3拉曼位移6

2.4拉曼光谱分析的技术特点7

2.5拉曼光谱仪的分类8

2.6拉曼光谱仪工作要求10

2.7光纤与光纤拉曼探针10

2.8精确扫描系统12

第3章激光拉曼光谱仪的设计13

3.1光学系统的设计13

3.1.1拉曼光纤探针14

3.1.2激光器14

3.1.3分光光谱仪15

3.2三维运动平台16

3.3辅助系统：

温度控制系统16

3.4CCD图像定位系统设计17

3.5仪器中精确扫描系统的硬件设计17

3.6实验检测与结果分析19

3.6.1表面增强效果及自动对焦验证实验19

3.6.2三聚氰胺检测实验21

结束语23

谢辞24

参考文献25

摘要

基于分子振动的拉曼光谱被认为是研究分子结构的一种重要研究方法，可以反映出试样中某些特定分子的特性，其特征振动“指纹”可以作为分子身份与结构识别的重要信息。

拉曼光谱能够对待检测物品进行定性分析及对相似物进行区分并通过浓度进行定量分析，因此拉曼光谱分析技术凭借其优越的功能成为分析测试领域的研究热点。

本课题设计的拉曼光谱仪主要用于一般生物反应及药物筛选。

主要简述了拉曼光谱基本原理及拉曼光谱仪的工作原理，然后进行仪器构架的总体设计。

包括光学系统的设计、三维运动平台、辅助系统的设计、CCD图像定位系统设计、仪器中精确扫描系统的设计等过程。

采用了光纤拉曼探针以提高了仪器系统稳定性，并对仪器中精确扫描系统进行基本设计。

进行了表面增强效果以及自动对焦验证实验、三聚氰胺检测试验，实验结果表明，所设计的分子检测系统可以实现表面增强拉曼光谱采集，自动焦点位置寻找及对芯片进行逐点扫描的功能，能够用于生化反应的定性分析。

关键词：

拉曼荧光光谱；分子检测系统；光纤拉曼探针；

Abstract

Ramanspectrumwhichisbasedonmolecularvibrationshasbeenrecognizedasaimportantmethodofmolecularstructure.Itcanreflectthecharacteristicsofcertainmoleculesinthesample.Thevibrationcharacterized"fingerprint"canbeusedasimportantinformationandstructureidentityrecognitionofmolecule.Ramanspectroscopyhasthequalitativeofanalysisanddistinguishbetweensimilarobjectsbyquantitativeanalysisoftheconcentrationfunction,soRamanspectroscopywithitsuniqueadvantageshasbecomeahottopicinthefieldofanalyticaltesting.

ThepaperoutlinesthebasicprinciplesofRamanspectroscopyandtheworkingprinciplesofRamanspectroscopy,thendesignstheinstrumentarchitecture.Thedesignincludestheopticalsystem,three-dimensionalmotionplatform,auxiliarysystems,CCDimagepositioningsystemdesign,instrumentprecisionscanningsystemandotherprocesses.Usingafiber-opticRamanprobeinstrumenttoimprovesystemstability,anddesignsthebasicsystemofprecisioninstrumentscanning.

Conductedasurface-enhancedeffectsandtheAFverificationexperiment,melaminetesting,experimentalresultsshowthatmoleculartestingsystemisdesignedtoachieveasurface-enhancedRamanspectroscopyacquisition,automaticfocuspositiontofindandthechip-by-pointscanningfeature,whichcanbeusedasqualitativeanalysisofbiochemicalreactions.

Keywords:

Ramanfluorescencespectroscopy;MolecularDetectionSystem;OpticalfiberRamanprobe;

第1章：

绪论

1.1拉曼效应

当光照射到介质（气体、液体或透明的样品）的时候，除了会被介质所吸收、反射和透过之外，光子与物质分子进行碰撞时，总会有一小部分光会按照不同的角度被散射开来，分为弹性散射和非弹性散射两种方式。

弹性散射的散射光是与激发光源波长相同的成分，光子的能量没有变化，只是改变了方向，这种散射包括丁达尔散射（TyndallScattering）和瑞利散射（RayleighScattering）；非弹性散射的散射光不仅改变了光的传播方向，而且也改变了光波的频率，即在碰撞的过程中，物质分子吸收了光子的一部分能量，使散射光频率小于入射光的频率，或者光子吸收了物质分子的部分能量，使得散射光频率大于入射光的频率，这两种碰撞都得到了与入射光频率不同的散射光，包括布里渊散射（BrillouinScattering）和拉曼散射（RamanScattering）[]。

1928年，印度物理学家拉曼（C.V.Raman）在进行水银灯照射苯溶液的实验时发现了与入射光频率不同且强度非常微弱的散射光现象，这种现象被称为拉曼散射，散射光的光谱称为拉曼光谱（RamanSpectra）。

拉曼的实验发现被英国皇家学会评为“20年代实验物理学中最杰出的发现之一”[]。

1930年，因发现这一新的散射现象和其所取得的光散射研究成果，拉曼获得了诺贝尔物理学奖。

1.2拉曼技术的发展

自拉曼现象被发现后的近30年，拉曼光谱技术的发展进度都十分缓慢，这是因为当时的拉曼光谱仪是使用汞弧灯作为灯源，而其所产生的拉曼散射光十分微弱，只相当于入射光强度的百万分之一左右，想要被很好的检测到十分困难，这就极大地限制了拉曼光谱技术的应用与发展[]。

20世纪60年代激光器问世，这种激光的功率高、能量集中、单色性好、方向性强，成为新的拉曼激发光源。

与此同时，光谱技术、光电信号转换技术也有了飞速发展，高分辨率，低杂散光的双联和三联的光栅单色仪[]也相继被开发出来。

这些技术的革新都给拉曼光谱带来了新转机，极大的推动了拉曼光谱技术的发展。

20世纪70年代科学家们以激光器和光栅单色仪为基础，选择不同的激光波长，拓展光谱仪探测的范围，发展了共振激光拉曼技术。

1974年，Fleishmann等通过实验发现，当在经过适当氧化还原处理的银电极表面吸附吡啶分子时，该分子的拉曼散射截面增加了106倍，这也就是后来的表面增强拉曼技术[]。

不久以后，出现了显微系统和拉曼分析相结合的显微拉曼技术。

1983年，Jessings等成功进行了傅里叶变换拉曼实验，它能够分离出荧光效应以提高拉曼光谱的分辨率。

此后，人们又研究制作出了各种型号的傅里叶变换拉曼光谱仪。

1987年，第一台近红外激发傅里叶变换拉曼光谱仪由PE公司研发制出。

20世纪90年代后期，为满足社会活动的需求，人们不断突破探索多项新技术，并将其应用在拉曼光谱仪上。

例如：

使用光纤对距离较远或者对未知威胁的样品进行安全检测，引入声光调制器[]（AOTF）取代光栅作为分光元件，用以测量拉曼光谱；采用全息带阻滤光片以便更好的消除瑞利散射干扰问题等。

此后，拉曼技术得到了广泛应用，开始走出实验室，进入了生物化学、精密加工、安防检查、考古发掘、文物珠宝鉴定、化妆品鉴定、医药检测等众多领域。

1.3国内外研究现状及本课题研究的意义

近年来，因为拉曼光谱对物质检测与分析所具有的重要意义，国外许多国家与组织都在积极进行拉曼光谱仪的研制与开发，在拉曼光谱研究方面也积累了丰富的研制经验。

目前，国外的各种类型的拉曼光谱仪凭借其优良的仪器性能，在中国拥有垄断性的市场[]。

其中美国的尼高力（Nicolet）公司[]、海洋光学（OceanOptics）公司、英国的雷尼绍（Renishaw）公司和法国的JY（JobinYvon）公司凭借其领先的技术在中国乃至全球具有很高的市场占有率。

其他一些公司如法国的KaiserOpticalSystem公司，ISA公司，Mot公司，北爱尔兰的Andor公司，德国的斯派克（Spectra）分析仪器公司，荷兰的Mantes公司，日本分光公司等，都有拉曼光谱仪产品[]。

这些国外厂家的拉曼光谱仪性能较好，已广泛的应用到了实际科研和测试工作中，垄断了国内的市场份额。

同时进口拉曼光谱仪的价格也比较昂贵，一般在100~160万元人民币左右。

而国内在激光拉曼光谱仪的领域里，研究开发起步较晚，发展相对发达国家来说比较落后。

目前国内尚无拉曼光谱仪的商品生产厂家。

在某些高校中都是出于科研和教学的目的，自行组装了教学用拉曼光谱仪，如苏州大学信息光学研究所制作的拉曼光谱测试仪[]，浙江大学光电与科学仪器系自行设计研制的LRZ.1型拉曼光谱仪，四川大学和成都科技大学组装的脉冲激光器激发的用于光多道分析器OMA（OpticalMulti-channelAnalyzer）控制与探测的激光共振拉曼光谱系统[]，还有北京卓立汉光仪器有限公司和中国科学院大连化学物理研究所共同研发的大型紫外共振拉曼光谱仪等，另外北京大学所属工厂也曾经尝试制作了少量供教学实验用的拉曼光谱仪。

拉曼光谱可使用可见光或者近红外光激光器进行激发，其拉曼位移在不同类型的物质对应着不同的“指纹”拉曼光谱，并且其强度与物质浓度在一定的条件下表现出线性关系，根据这一特点，可以对物质结构、成分、浓度等进行检测。

拉曼光谱作为一个研究振动跃迁和转动跃迁的方法，具有一些重要的特点，如制样简单、水的干扰少、拉曼光谱分辨率较高等[]。

所有的转动能级和几乎所有的振动能级的拉曼频移通常都在25~4000cm-1（最小可以测10cm-1）范围内，简单的计算表明，当采用400~600nm范围内的任一激光器照射样品时，拉曼散射光均处于可见光谱区内。

拉曼光谱对样品进行无损分析己广泛应用到如石油化工、酒类分析、医药学、宝石鉴定、环境保护、文物的考古鉴定、公安与法学样品的鉴定、工业生产监测与控制、商品检验等各个领域之中[]。

综上所述，考虑国内外拉曼光谱技术的研究发展现状，立足于我国国情，实现拉曼光谱仪的国产化，降低制造成本，制造具有优良性能，价格相对较低的用于样品微区分析的新型激光拉曼光谱仪，具有十分重要的意义。

1.4论文结构及各章节内容

本课题所研制的拉曼光谱仪利用了拉曼光谱作为物质分子结构的“指纹”，设计的光谱仪用于一般生物反应及药物筛选。

第二章从不同方面介绍了拉曼光谱的特点，分别介绍了拉曼散射原理，拉曼效应的量子力学解释，拉曼位移，详细分析了拉曼光谱仪原理，还介绍了拉曼光谱仪的种类以及每种拉曼光谱仪的体系结构。

第三章详细的讨论了拉曼光谱仪的总体设计过程。

包括光纤拉曼探针的采用、仪器原理构架、光学系统的设计、三维运动平台、辅助系统：

温度控制系统、仪器中精确扫描系统的硬件设计、CCD图像定位系统设计等。

并进行了表面增强效果及自动对焦验证实验、三聚氰胺检测试验，实验结果表明，所设计的分子检测系统实现了表面增强拉曼光谱采集，自动焦点位置寻找及对芯片进行逐点扫描的功能，可以用于生化反应的定性分析。

第2章：

拉曼光谱基本理论

2.1光散射与拉曼效应的原理

当一束频率为v0的单色光入射到透明介质（如气体、液体或透明的样品）时，除了会被介质所吸收、反射和透过之外，还有一小部分光会出现向四面八方辐射的散射现象。

光的散射现象可大致分为以下四种：

丁达尔散射、瑞利散射、布里渊散射以及拉曼散射。

丁达尔散射的散射光频率与入射光频率v0相同，它是由于不均匀介质或介质中存在尘埃等原因引起的；瑞利散射是由于入射光电场的作用而使得介质发生极化而造成的。

1871年，英国物理学家瑞利在研究物质粒子（微粒粒径远小于光波长）对入射光造成的散射问题后指出，当光线入射到如乳状液、胶体溶液等不均匀的介质中时，介质就会因为不均匀的折射率而产生散射光，而即使是光入射到均匀介质时，因为介质中的物质分子的无规则热运动，分子间的固定位置关系被破坏，从而也产生一种分子散射，这就是瑞利散射，散射强度和入射光波长λ的四次方有反比关系。

瑞利散射光频率也与入射光频率ν0相同，其强度和数量级约为入射光强的10-4~10-3；布里渊散射[]是光波与声波在传播时相互作用而产生的光散射过程，布里渊散射光的频率与入射光v0不同，但其频率变化并不明显。

拉曼散射是由于介质内部物质分子的振动与转动而造成的，拉曼散射光的频率变化程度较大，情况比较复杂，即ν=ν0±|Δν|，其强度数量级约为瑞利散射的10-8~10-6，最强的也只是瑞利散射的10-3。

根据经典电动力学理论，可以推导出散射光的散射公式。

当单色光源（电矢量为E）入射到物质上时，电子的位移会产生电偶极矩，在某一入射光范围内，单位体积的感生偶极矩P与入射电矢量E成正比，即：

（2-1）

式中α是极化率张量。

其数量级为

。

电场强度是取决于单色光束光子频率ν0的振动函数：

（2-2）

将式（2-2）代入式（2-1）可得：

（2-3）

系统中电荷的分布决定了极化率α的取值，即

若振动期间原子配位发生改变，则表征电荷分布的参量ρ会发生变化，那么α的取值也要发生变化。

在某一特定条件被满足时，振动着的电偶极子会辐射出电磁波，成为散射光。

散射光的频率、波矢都与入射光的频率、波矢不同，这可以被理解是电偶极矩被机械或声子“调制”的结果[]。

因此，光散射就是一种电磁辐射，是在很小范围的不均匀性引起的衍射，且在4π立体角内都可以检测得到。

2.2拉曼散射的量子解释

拉曼效应起源于分子振动（点阵振动）与转动，散射物质的内部信息可由拉曼光谱中的拉曼频率、强度及偏振等反映出来，因此从拉曼光谱中可以得到分子振动能级（点阵振动能级）与转动能级结构的信息，得到物质结构及物质组成成分的相关数据。

拉曼散射的完善解释还需用量子力学理论，不仅可解释散射光的频率差，还可解决强度和偏振等问题。

当处于基电子态的散射物微粒分子受到入射光照射时，可以将激发光与微粒分子发生作用而引起的极化看作为虚的吸收，称作电子跃迁到虚态（Virtualstate），虚能级上的电子立即跃迁到下能级而发光，即成为散射光。

设仍回到初始的电子态，则有如图2.1所示的三种情况。

散射光中既有与入射光频率相同的瑞利谱线，也有与入射光频率不同的拉曼谱线。

在拉曼谱线中，把频率小于入射光频率的谱线称为斯托克斯（Stokes）线，又称为红伴线；而把频率大于入射光频率的谱线称为反斯托克斯（anti-Stokes）线，又称紫伴线。

斯托克斯线比反斯托克斯线通常要强一些。

图2.1瑞利、拉曼散射过程中量子跃迁

由图2.1可知：

在入射光（量）子（

）被吸收后，使电子和晶格振动初态（）跃迁到一个虚中间态（）；然后辐射出散射光子（

）由中间虚态回到终态（），同时产生（或湮灭）了一个频率为

而波矢为

的元激发[]。

分子振动的感生电偶极矩PG的跃迁矩阵元为：

（2-4）

其中

和

都是波函数，引入符号[α]nk上式中的极化率跃迁矩阵元

（2-5）

由于极化率α是实数，因此α是对称矩阵。

从电偶极矩的跃迁矩阵元

的公式和极化率矩阵元的式（2-5）可以看到，若极化率α为常数C，就可以将它们提到积分号前面,由波函数

和

的正交性，则有：

或（2-6）

n=k表示跃迁出现在同一能量的能级间，n≠k表示跃迁出现在不同能量的能级间，若出现光散射现象，则分别对应于瑞利散射（入射光能量不变）和拉曼散射（入射光能量发生变化）。

这也意味着，原子或分子要产生拉曼散射的条件为电子的波函数分布位置r和分子的极化率α发生改变，而这种改变就是源于原子中电子或者分子中原子在平衡位置附近存在振动。

于是量子力学就在微观运动的层面上解释了拉曼散射效应。

斯托克斯拉曼散射或反斯托克斯拉曼散射分别对应于从低能级到高能级的跃迁或高能级到低能级的跃迁。

因此，拉曼散射的斯托克斯线的光强

为：

（2-7）

反斯托克斯线的光强

为：

（2-8）

其中

为波尔兹曼常量，T为绝对温度。

二者的强度比是：

（2-9）

一般情况下，

比1大许多，因此量子理论正确地说明了斯托克斯散射强度大于反斯托克斯散射强度的问题，并且能够很容易获得斯托克斯和反斯托克斯散射强度的比值。

2.3拉曼位移

所谓拉曼位移（RamanShift），即斯托克斯散射光与反斯托克斯散射光的频率与激发光源频率v0之差Δν，表示为v0±Δν。

最简单的拉曼光谱如图2.2所示。

图2.2拉曼光谱图

在光谱图中出现了三种谱线，位于中间的是瑞利散射线，或者叫激发谱线，它的频率为v0.，也就是激发光的频率，它的强度最强。

斯托克斯线在瑞利线的低频一侧，斯托克斯线的强度约为瑞利线强度数量级的10-2~10-4。

反斯托克斯线在瑞利线的另一边，反斯托克斯散射光的强度要比斯托克斯散射强度弱得多，因此拉曼光谱分析技术[]中常采用斯托克斯散射光线。

分子振动能级间跃迁决定了拉曼位移，不同的化学键或基态有不同的振动方式，决定了其能级间的能量变化，与之对应的拉曼位移是特征的，也是分子振动能级的直接量度，这成为运用拉曼光谱进行分子结构定性分析的理论依据。

附加频率值与振动能级有关的称作大拉曼位移，与同一振动能级内的转动能级有关的称作小拉曼位移：

大拉曼位移：

（

为振动能级带频率）：

（2-10）

小拉曼位移：

（其中B为转动常数）:

（2-11）

利用转动常数：

（2-12）

转动能级：

（2-13）

能级的选择为：

（2-14）

因此有：

（2-15）

2.4拉曼光谱分析的技术特点

通过测定拉曼光谱的强度与位置，可鉴定试样的分子结构，并可分别进行定性分析和定量分析。

拉曼光谱可提供有关样品分子中存在何种功能团的结构信息，所以可用于鉴别试验和结构解析。

将样品与对照品的拉曼光谱在相同的测定条件下进行比对，若两者光谱相同，即鉴定为同一化合物。

拉曼光谱的优点[]：

（1）、快速，准确，样品制备简单甚至不需要制备，测量时通常不会破坏样品（固体，半固体，液体或气体）；

（2）、处于可见或近红外光范围的谱带信号可以有效地与光纤联用。

这也意味着谱带信号可以从包封在任何对激光透明的介质，比如玻璃、塑料之内，或将样品溶于水中获得；

（3）、现代拉曼光谱仪分析速度快（仅需几秒到几分钟），使用操作简单，性能真实可靠。

因此，可将拉曼光谱与其他分析技术联用，这比起与其他光谱联用技术从某种意义上说会更加简便（可以使用单变量和多变量方法以及校准）。

除常规的拉曼光谱外，还有一些较为特殊的拉曼技术。

它们是共振拉曼，表面增强拉曼光谱，拉曼增益或减失光谱以及超拉曼光谱等。

其中，共振拉曼和表面增强拉曼光谱法在药物分析应用相对较多。

荧光、样品的热效应和基质或样品自身的吸收是影响拉曼光谱测量的主要干扰因素[]。

在拉曼光谱中，荧光干扰的表现为一个典型的倾斜宽背景。

测量固态物质前，用激光照射样品一定时间，则荧光干扰可以被减弱。

样品测定中另一个需要考虑的重要因素是光谱的污染，拉曼效应很弱，可以被许多外源影响掩蔽。

普通的污染源包括样品支持物（容器或基质）和周围光线。

通常，这些问题可以通过细致的实验方法来识别和解决。

2.5拉曼光谱仪的分类

按照仪器将来自试样的拉曼散射光随频移分散开的方式不同，拉曼光谱仪可分为三种类型：

单色型，分光光谱仪型和迈克尔逊干涉型光谱仪[]。

（1）、单色型拉曼光谱仪的组成结构最简单，它是由单色光源，一个仅允许通过单一波长拉曼光的滤光器和一个光学检测器所组成。

这种仪器虽然结构简单，但对给定波长拉曼光波的光通量能达到与其他任何类型的光谱仪一样高甚至更高。

然而，单滤光器拉曼仪仅能检测到拉曼光谱的一个波长（实际上是一个很窄的波段），它阻挡了来自试样的绝大部分拉曼散射而只允许很狭窄的光谱段进入检测器，造成光能量分散。

对大多数试样而言，这意味着绝大部分拉曼散射光波被浪费掉了，因此它的使用具有局限性。

（2）、分光光谱仪则很好的克服了单色型光谱仪的这个缺点。

分光仪中使用的光栅几乎都是反射式光栅，它的优点是能将单缝的中央最大值的位置从没有色散的零级光谱转移到其他色散的光谱级上。

分光光谱仪能将不同波长的光分散开并在平面的不同位置上成像。

来自入射狭缝的光照射衍射光栅，然后衍射光聚焦在光谱仪输出平面上。

为了能够同时测得不同波长光束的强度，可以在该平面上安置多元件探测器（例如CCD）。

分光光谱仪光路如图（2.3）所示。

图2.3分光光谱仪光路示意图

入射光由狭缝进入，经反射镜准直入射于平面反射光栅，来自光栅的衍射光被另一个反射镜聚焦于探测器上，也就是像平面上。

为了减小各种像差，两个反射镜是独立安置的。

如果用复曲面代替球面反射镜，也能有效地降低像散差。

分光光谱仪使用了几个探测元件，可以同时检测几个不同波长，因而使得检测时间获得显著缩短。

多通道检测的最大好处，从理论上讲，是其检测时间在相同光谱分辨率下，比单色仪快了500~2500倍，使用阶梯衍射光栅或全息光栅的光谱仪还能将光谱叠加。

（3）、迈克尔逊干涉仪型拉曼光谱仪

拉曼光谱仪中很重要的一类是使用了傅里叶变换的干涉仪型光谱仪。

干涉仪收集来自试样的拉曼散射光，进入探测器后获得干涉图，对干涉图进行傅里叶变换就能得到拉曼光谱。

迈克尔逊干涉仪光路如图2.4所示。

图2.4迈克尔逊干涉仪光路示意图

入射光进入分光镜被分为两束，一束作为透射光入射于固定反射镜，另一束作为反射光入射于移动反射镜。

两束相干光来自同一光源，因此探测器检测到的结果是两束光干涉所