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讲稿5食用菌菌种生产
第5章食用菌菌种生产
1、目的
清楚菌种类型、作用及各制种环节所需的相应设备。
掌握各级菌种的培育技术,知道为何及如何对菌种进行保藏和复壮。
2、重点与难点
重点:
菌种分离;母种、原种、栽培种的培育。
难点:
孢子分离
菌种左右着产品的质量及产量。
要获得高产优质的食用菌产品,必须有标准化纯度高的优质菌种。
在相同栽培条件下,良种比一般品种可增产三成以上,甚至成倍增长。
掌握菌种培育技术是成功从事食用菌生产的关键。
第一节菌种的概述
一、菌种的概念
菌种的优劣主要取决于菌株原有的特性及制种技术的高低。
菌种是特殊生产资料,西方国家都有菌种法,生产菌种的单位会受到很多法律的约束,对生产设施、科研设备,操作人员的技术水平要求很高。
我国菌种市场一直未受到法律的有效制约。
1996年7月农业部颁布了《食用菌菌种暂行管理办法》,虽为时十年之久,基本处于菌种质量难把关,菌种技术难规范、菌种市场难管理的状态中。
值得高兴的是2006年6月1日农业部颁布并开始实施了《食用菌菌种管理办法》,虽然在今后的执行中还会存在很多问题,但终归是有法可依了。
菌种生产经销混乱的原因有三:
技术比较简单、成本低、利润丰厚。
因此吸引了很多无营业执照、无生产许可证、无合格技术人员,设备简陋,手工作坊式生产的单位或个人烟熏火燎的操起了菌种生产生意。
不管或根本不懂菌种优良性是否降低甚至丧失,使大量名不符实的菌种或劣质菌种被应用到生产中,导致食用菌产量、质量低劣,生产效益不高,甚至毁灭性的失败。
给菇农造成了巨大的经济损失,严重挫伤了食用菌生产的积极性。
食用菌的菌种如同庄稼的种子。
食用菌的孢子是传宗接代的个体,但在人工栽培时,直接用孢子播种很难成功,而是用其生长在培养基内的菌丝体作为“种子”的。
经人工培养,扩大繁殖后用于生产的纯次生菌丝体,称为食用菌的菌种。
菌种基本要求:
实行纯培养,不含任何杂菌。
菌种来源:
自然选择,育种技术,野生菌驯化。
得到优良菌株后再进行扩大繁殖,共生产所需。
二、菌种类型
按使用目的分为保藏菌种、实验菌种、生产菌种;按物理性状分为固体菌种和液体菌种;按级别分为一级种、二级种和三级种。
(一)菌种的分级
1、一级种(母种)
用孢子分离、组织分离或基质分离法首次得到的纯菌丝体,称为母种。
因用试管斜面培养基培育,又是进行菌种扩大的基础种,故又称为试管种或一级种。
特点:
菌丝弱、量少、不能直接栽培,必须经驯化和扩大才能用于生产。
2、原种
将母种扩大至大口瓶、较粗放的液体或固体培养基形成的菌种,成为原种。
也称二级种。
作用:
扩大栽培种
特点:
菌丝较多而壮、适应性较强
3、栽培种
将原种移扩至菌种袋或瓶中的粗放培养基上,培养成的菌丝体,称为栽培种。
也叫三级种、袋装种或生产种。
作用:
用于栽培(不能再扩繁菌种,易致退化)
特点:
菌丝更多、更健壮、适应性更强
总生产:
子实体→母种→原种→栽培种→栽培
母种、原种、栽培种都是具有统一血缘关系的祖孙三代,品性相同,只是越来越多,越来越健壮。
菌种生产就是从母种开始,到栽培种为止。
若受设备或技术条件限制,可买现成的母种或原种进行繁衍。
(二)状态不同的菌种
1、固体菌种
用固体培养基培养的菌种为固体菌种。
实际生产中最为常见,设备、工艺、技术要求等较简单。
但菌龄长,菌龄不一致,发酵率低等。
2、液体菌种
采用液体培养基培养的菌种,菌丝体在液体中呈絮状或球状。
工艺、设备、技术要求较高。
液体菌种平均制种时间为3天左右,而固体菌种1级到3级的转代培养一般需2-3个月,液体菌种培养时间是固体菌种的1/10。
液体菌种具有生产周期短、发酵率高、菌龄一致、成本低、接种方便等固体菌种所不可比拟的优势,更有利于食用菌生产标准化、工厂化、周年化生产,是菌种生产的一个方向。
目前液体菌种生产主要有两种,一种是液体菌种深层发酵培养(种于罐培养),一种是摇瓶培养。
前者需要的设备复杂、投资大、无菌操作严格,适用于科研机构和大型食用菌菌种厂。
后者比较简单,但生产量少,适合农村和小规模的食用菌菌种厂。
三、菌种生产程序
无论哪种类型的菌种,其生产程序都是一样的,主要是:
制培养基→灭菌→接种→培养。
其设备也因各生产步骤的所需而不同。
第二节菌种生产主要设备
一、配料设备
(一)原料处理设备
切片机(将木材切成小木片)→粉碎机)→过筛机(晒出木屑中的块状木等杂物)
(二)原料配制、分装设备
搅拌机(将各原料及水分混合、搅拌均匀)→装瓶机(将原料装于菌种瓶)→装袋机(将培养料装入塑料膜制的菌种袋)现已有装瓶装袋两用机械。
二、灭菌设备
因培养菌种的容器、培养基等物品都要经过高温蒸煮,所以最有效的工具是高压锅或常压锅。
这些设备,大家在实验中已经用过,知道了它们的功能和用法。
三、接种设备
接种是将菌种接入培养基的过程.必须在无菌环境中进行无菌操作。
接种室和接种箱等是进行接种的场所,和外界空间隔绝,防止空气流动,经过一定的消毒措施后,室内就可达到无菌状态,防止接种时污染杂菌。
若传入杂菌,就会前功尽弃。
能提供无菌空间的设备有:
(一)接种箱(严密)
用法:
清洁、放所需物品→药喷、熏→紫外灯30分钟。
(使用前后用2%来苏擦净,箱温勿超30℃)
特点:
结构简单,造价低廉,消毒彻底,移动方便。
但箱内容量小、操作不便,但工效低。
(二)接种室(无菌操作房)
规格:
7~9m2,高2.2~2.5m2,其中缓冲间2~3m2、接种间5~6m2。
要求:
严密、6个面平滑、两门错开、平拉式、顶有紫外灯。
特点:
工效高、造价高
用法:
物放缓冲间一消毒、开紫外灯一穿拖鞋、2%来苏水浸手2min一移物于接种间,喷5%石碳酸,退至缓冲间5~10min—完后喷5%石碳酸、开紫外灯。
(问题:
为何不直接放物于缓冲间?
)
接种箱及接种室经常用石灰水等碱性消毒剂擦拭,以改变经常熏蒸造成的酸性环境,保证消毒效果。
(三)超净工作台
使一定工作区达到相对无菌、无尘状态的电器。
特点:
操作舒、工效高
用法:
预开机30min(置洁净处,定期清洗)
(四)接种工具
要求:
导热好、冷却快
种类:
环、针,铲、耙、钩、匙、镊、刀
四、菌种培养设备
(一)培养箱
培养少量菌种的恒温电器。
一般在20~40℃任意调节。
用法:
打开电源(红灯亮)→旋至所需温度,待温度表达到所需温度时→定温(反旋至红灯灭、绿灯即亮时止)→菌种长好关闭电源
(二)培养室
培养大量菌种的恒温房。
培养室最重要的是要恒温、恒湿、无尘且空气流通。
温度应维持在25℃左右,相对湿度应在50%~60%。
培养室内有培养架、紫外线灯。
进入培养室最好穿干净拖鞋或穿一次性鞋套。
要求:
光暗、密闭,好、通风性强;能升温,降温;有培养架、空调机。
大小根据生产规模而定。
五、菌种保藏设备
一般用冰箱保藏母种,大量的原种及栽培种可暂时放置于菌种贮存室。
菌种贮存场所应具备远离污染源及有毒药物、清洁、低温(4~8℃)、干燥、通风、遮光等条件。
在存放菌种之前,应进行消毒杀虫处理,为防杂菌污染,地面可经常撒石灰粉。
原料库
配料间
灭菌间
门口
晒料场
接
种
间
缓
冲
间
栽培场
办公室
培养间
六、菌种厂的布局
菌种厂的布局应根据菌种生产流程而进行合理的设置,使各环节成为自然衔接的流水生产线,以便减少污染率,提高生产效率。
第三节菌种培养基
人工配制的,供食用菌生长繁殖的营养基质,称为培养基。
培养基不合适,容易导致菌种退化,失去优良特性。
有无好种在于选,有了好种在于养。
养种的首要环节是制培养基。
一、概述
(一)要求
营养种类、营养比例、水分及PH值适宜;持无菌状态。
(二)类型
常用于培养基配制的琼脂具有96℃以上融化、40℃以下凝固;能反复凝、融;
透明度好,粘着力强;不被微生物分解利用等特点。
是制备固化培养基不可缺少的一种理想凝固剂。
天然培养基与半合成培养基具有营养丰富、原料来源广泛、价格低廉等优点,在生产实践中被广泛采用。
液体培养基的养料分布均匀,菌丝生长快,需特殊设备及较高的技术条件,适于机械化、工厂化生产。
但菌种极易老化和自溶,目前食用菌生产仍以固体菌种为主。
斜面及平板培养基常用于母种培养、分离、保藏等。
二、各级菌种的培养基
(一)母种培养基
1、通用配方(PDA)
马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15~20g,水1000m1。
PDA培养基适于培养绝大多数食用菌母种,是生产中广泛使用的。
2、配制过程
(二)原种和栽培种培养基
原种和栽培种的培育方法基本相同,只是在接种时接的菌种级别不一样。
两菌种培养基的配方可以相同,也可有所区别,由于栽培种经过了母种及原种两次的驯化,其培养基可比原种培养基更粗放些。
1、配方与配制
(1)颗粒培养基(麦粒、玉米粒等)
①配方:
粮食粒98.5%,石膏粉1%,碳酸钙0.5%
②配制将洗净的粮食粒洗净,用1%石灰水泡胀,文火煮沸15~20min(熟而不烂,勿破皮),捞出晾至无明水后拌入余料。
原种多使用颗粒培养基。
(2)棉籽壳麦麸培养基
①配方:
棉籽壳87%,麦麸10%,白糖1%,石灰1%,过磷酸钙1%。
②配制将棉籽壳、麦麸混合为主料,余料溶解于少量水后浇入主料中。
边加清水边翻拌至含水量达60%~65%(紧握料的指缝中有水泌出而不下滴)。
2、调pH与分装
一般用石灰或过磷酸钙调pH至8.0左右(特殊要求除外)。
原种培养基装入菌种瓶(或其他大口瓶),装量约占瓶高的1/2(非颗粒培养基可装至瓶肩,用锥形棒打一料孔),瓶口擦净,堵棉塞后外包牛皮纸或双层报纸。
栽培种培养基一般装入聚丙烯菌种袋,上端套颈圈后如同瓶口包扎法。
两端开口的菌种袋可将两端扎活结。
要求装地外紧内松,培养料需紧贴瓶壁或袋壁。
松散的培养料会导致菌丝断裂及影响对养分、水分的吸收。
三、培养基的灭菌
配制的培养基应随即灭菌,以防杂菌滋生,使其腐败变质。
母种培养基多采用高压蒸汽灭菌。
若无较大高压锅,原种、栽培种培养基可采用常压灭菌。
灭菌温度及灭菌时间因培养基不同而不同。
(一)母种培养基的高压蒸汽灭菌
1、灭菌及摆斜面
排净冷气后,通常在103kpa(1kg/cm2)压力下,温度约达121℃,灭菌时间为20~30min自然降压至“0”略开锅盖,约60℃摆斜面(约占管长的1/2,温度低盖毛巾,以免形成冷凝水。
2、无菌检验
将斜面培养基放于30℃左右条件下空白培养2~3天,若无杂菌生长,方可用其接种。
(二)原种、栽培种培养基的灭菌
原种栽培种培养基的容器大、装量多,应增加灭菌压力及灭菌时间。
若采用高压蒸汽灭菌,一般在152kpa压力(1.5kg/cm2)、温度约128.1℃条件下,保持灭菌时间1~2h。
若采用常压灭菌,需保持最高温度10h左右,再闷1天或1晚。
要求攻头、控中、保尾。
第四节菌种的接种
将少量菌种移接于新培养基中的过程,称为接种。
接种成功的关键是无菌操作。
在移接过程中必须十分谨慎,严防杂菌侵入。
一、无菌操作
(一)概念
在严格消毒灭菌条件下,进行的接种操作。
(二)要求
接种空间、接种工具、操作者的双手都要彻底消毒灭菌
二、母种的接种
简便分离法
1、组织分离(无性繁殖)
将子实体、菌核、菌索等一小块组织放于斜面培养基上,使其萌发为纯菌丝的方法,称为组织分离。
该法具有简便、易成功、能保持原菌种性状等优点,但重复多易退化,应与孢子分离交替进行。
组织分离法适用于绝大多数食用菌(胶质的耳类食用菌除外)。
(1)选种菇选外观典型、大小适中、菌肉肥厚、无病虫害、八成熟、第1~2茬的子实体。
(2)种菇消毒用燃烧的酒精棉球迅速擦拭
(3)取接组织纵剖(撕)菇体,用尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒大组织,放入斜面培养基上。
注意:
种菇含水量及组织块勿大
2、孢子分离(有性繁殖)
孢子分离有单孢分离和多孢分离两种方法。
单孢分离由于手术难度大,主要用于杂交育种的研究,生产上较少采用,一般采用多孢分离法。
多孢分离法:
将许多孢子接种到同一培养基上,使其萌发后自由交配成次生菌丝,从而获得纯菌种的方法,称为多孢分离法。
担孢子或子囊孢子是选育优良新品种或杂交育种的好材料,具有生命力强、菌龄小、生活力旺盛、变率高等优点。
由于孢子个体之间有差异,自然分化现象较严重,变异大,需经出菇试验才能在生产上应用。
(1)种菇的处理
选择八分成熟(有菌膜的子实体应处于其膜即将破裂时)的优质子实体,将菌柄切去2/3。
无菌膜的子实体可用75%酒精棉球擦拭消毒;有菌膜的子实体可洗净表面杂物,置于0.1%升汞或0.25%新洁尔灭中浸泡2~3min,用无菌水冲洗2~3次,再用无菌纱布或滤纸吸干菇体表面水分。
(2)收集孢子
①整菇插种法
是一种将消毒好的种菇插在孢子收集器中,使孢子散落于培养皿内的方法。
A、孢子收集器的准备
孢子收集器使用前须用双层纱布包好,在154kpa压力(1.5kg/cm2)下灭菌45min,或干热灭菌1.5h。
B、采孢子
在无菌环境中用0.1%升汞或无菌水浸湿纱布→种菇插入支架→约25℃、24h现孢子粉→无菌环境中去掉种菇,培养皿盖严后将其取出。
C、接种孢子
用接种环沾取少许孢子粉→斜面或平板培养基上划线涂抹→适温培养→挑健壮尖端菌丝转管→纯化(丝长至斜面1/2时再转管)。
也可用无菌水将孢子稀释成悬浮液,用注射器接种到培养基上。
②钩悬法
是一种特别适用于耳类,也适用于伞菌类的多孢分离法。
用无菌操作法将一小块消毒的耳片或菇片悬挂于无菌三角瓶内(装约1cm厚的培养基)→约25℃、24h现孢子粉→取出分离材料→适温培养→挑健壮尖端菌丝转管→纯化
③孢子印分离法
取成熟子实体经表面消毒后,切去菌柄,将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上,在20~24℃静置一天,大量孢子落下形成孢子印,接种环沾少量孢子在试管培养基上划线培养。
孢子分离得到的母种,必须进一步提纯复壮。
选择菌丝健壮、生长旺盛,无老化、无感染杂菌的母种转管扩大。
再通过出菇试验,鉴定为优质菌种后,才可供生产使用。
(二)转管法(传代、扩大)
将母种移入新斜面培养基上的过程,称为转管。
是一项重要的常规操作,常用的工具是接种环。
无论引进或自己分离的母种,都需要适当传代,使之产生大量再生母种,才能源源不断供应生产。
再生母种的生活力常随传代次数的增加而降低,一般传代5次以后就换分离法。
用接种环取绿豆粒大母种(带一薄片培养基)→放于新斜面中部(1支母种约传30支再生母种)。
注意:
原来的种块及斜面尖端取出弃之,严控传代次数。
三、原种、栽培种的接种
灭菌后的原种及栽培种培养基及时运送至无菌环境中,待料温降至约30℃,进行抢温接种。
(一)接原种
用接种耙取蚕豆大母种(连同培养基)→放于瓶中培养料的孔口处(1支母种约接5~8瓶原种)。
注意:
斜面尖端及原来的母种块勿接入。
(二)接栽培种
用大镊子、接种铲、接种匙取枣大原种→放于瓶或袋中料面上(若两端扎活结的菌种袋,每端都要接入原种)。
1瓶原种约接60瓶或25袋栽培种。
注意:
去弃表面老化菌丝及老种块。
第五节菌种的培养与质量鉴定
一、菌种培养
接种后要精心培养,创造有利于菌丝生长的各种环境条件(主要是温度、空气)。
(一)培养条件
培养场所(培养室)清洁,事先要杀虫消毒;光线暗;空气清新;保持20~25℃、60%~70%空气湿度条件。
(二)技术环节
1、母种培养
将斜面朝下斜置、叠放于瓷盘中,放于培养箱中培养。
(1)及时检查2~3天后每天都要检查菌丝生长情况。
及时挑拣污染试管(出现粘膜或杂色)。
(2)分离的母种一定纯化后做出菇试验。
①纯化试管中的菌丝长至斜面1/2时,挑尖丝转管,培养成再生母种。
②出菇试验:
将再生母种扩成原种、栽培种,使其出菇。
看产量、质量、形态、长势、抗性如何,再决定是否取用。
③菌龄适宜菌丝即将长满斜面(一般7~10天)终止培养。
分别用于菌种保藏或繁衍原种。
2、原种、栽培种培养
(1)勿堆放过挤菌种瓶或菌种袋根据气温可单层或多层叠放,隔4~5天转动或调换位置,以利于受温一致,并避免培养料水分的沉积。
(2)常挑拣及时去除出现杂色、粘液及菌种死亡的瓶或袋。
(3)逐渐降温当菌丝长至料深的1/2时,降温2~3℃,以免料温升高,并有壮丝作用。
(4)注意菌龄原种约30~40天、栽培种约20~30天菌丝长满,再继续培养7~10天是使用的最好菌龄。
二、菌种质量的鉴定
菌种质量的优劣是食用菌生产成败的关键,也关系到成千上万栽培者的经济利益。
引进或分离的菌种必须通过鉴定后方可投入生产。
菌种鉴定可从形态、生理、栽培及经济效益等方面进行综合评价。
经检验符合质量标准的菌种,应在出售时贴明质量合格标签,注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期等。
(一)母种质量的鉴定
1、外观丝白、整齐,粗壮、有弹性、萌发快;丝干燥,收缩或自溶产生红褐色液体的勿用。
2、耐温湿性鉴定
(1)耐温性适温培养1周→高温(30~35℃)培养24h→再适温培养。
恢复快、不发黄、不倒伏、不萎缩,则为良种。
(2)耐干湿性
(3)出菇鉴定扩成原种、栽培种→出菇(最可靠、有效)
(二)原种、栽培种质量的鉴定
菌丝白(符合该菌种的颜色)、均匀、粗壮、整齐、有菇香味,无杂色、黄水、结皮,一般要求无原基,接种后萌发快。
培养基湿润,不干缩脱壁等。
笫六节菌种保藏及复壮
菌种保藏与复壮是生产中不可缺少的重要环节。
选育出的菌种必须进行适当的保藏及复壮,才能减少变异与衰退,确保菌种的优良性能。
一、菌种保藏
不同的物品又不同的保藏方法。
通常用的晒干、腌渍、蜜饯等方法不适用于保藏有生命的,此外保藏的目的也不一样,菌种的保藏目的要求很高
(一)保藏目的及原理
1、目的
使菌种不死亡、不生长、不污染,保持其优良性状,尽可能长时间地在生产上应用。
死亡和生长都是保藏失败的结果。
2、原理
创造低温、干燥、缺氧、少营养等不利于菌种生长的一切条件,使其代谢降到休眠状态。
(二)保藏方法(只适于母种)
1、斜面低温法
即将长满的斜面种,换胶塞或齐管口剪掉棉塞→蘸腊→放4~6℃冰箱保藏(3~6个月)。
特点:
简便,可随时取用。
但保藏时间短,易污染及退化。
冰箱是保藏菌种的基本设备,靠它的低温降低菌种的代谢。
冰箱只能降温,却不能升温。
注意:
一般每3个月转管一次,用时适温培养12~24h再转管。
草菇不耐低温,须在10~15℃下保藏,或注入防冻剂(10%甘油)再放入冰箱。
2、矿油保藏法
无色透明、粘稠、不被微生物分解的矿油灌注入菌种管中,淹没斜面,以隔绝空气、防止水分散失、抑制菌种代谢,达到菌种保藏目的。
矿油装三角瓶在147kpa压力(1.5kg/cm2)下灭菌30min→40~50℃培养箱中烘至由浑变清(去水)→无菌检验后,注入种管,高出斜面1cm,→一口堵胶塞(保藏2年,用时转管→再转管)
该法创造的条件是隔绝氧气,防止培养基水分蒸发。
缺点是矿油易燃;只能直立放置。
3、自然基质保藏法
特点:
防衰老、复壮菌丝、保藏时间长、接后生长旺。
但易污染,灭菌要彻底。
(三)注意事项
1、用保种培养基增加有机氮含量;糖降至(2%以下),以防产生能量及酸。
琼脂增至2%~2.5%,以增加持水性。
2、即将长满(2/3)及时保藏。
3、最好换胶塞。
4、用前活化(重新移至新斜面上,活化前应适温放置12~24h)。
5、防止棉塞受潮、琼脂培养基干缩、杂菌污染等现象。
二、菌种复壮
菌种经长期人工培养及保藏,难免引起某些优良性状的减弱或丧失,必须及时进行菌种复壮。
菌种的使用、保藏、复壮应密切结合。
保藏,复壮都是为使用服务的,不会保藏、复壮菌种,就容易使好种退化或者绝种。
确保或恢复菌种优良性能的措施,称为复壮。
菌种复壮是菌种生产中不可缺少的一项重要技术,是防止菌种退化的有效措施。
(一)衰退表现及根源
1、表现
生长慢、抗性差、形态变、产量及质量下降。
2、根源
外因是传代过多,条件不适宜;内因是菌种遗传物质发生了不良变异。
(二)复壮法
1、无性繁殖与有性繁殖交替转管多次的菌种改用组织分离,可有明显复壮作用。
无性繁殖较多的品种应改用孢子分离法,重新获得优良菌株后再进行转管使用。
2、改变培养条件经常变换营养成分或添加酵母膏、氨基酸、维生素等,以提高菌种活力。
反复使用单一配方,易导致菌种退化。
3、挑尖丝转管每当接种时,都要取接年幼的尖端菌丝,以不断淘汰老化菌丝。
(三)防止衰退的有效措施
1、保证菌种的纯培养,不用被杂菌污染的菌种。
2、严格控制菌种传代次数,尽量减少机械损伤,保证菌种活力。
3、菌种不宜过长时间使用,使用适宜菌龄的菌种。
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