53种常见缓冲液配制方法及胶体金试剂资料.docx
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53种常见缓冲液配制方法及胶体金试剂资料
53种常见缓冲液配制方法
乙醇-醋酸铵缓冲液(pH3.7)取5mol/L醋酸溶液15.0ml,加乙醇60ml和水20ml,用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7,用水稀释至1000ml,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解,并稀释至1000ml,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解,用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1,加水稀释至100ml,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)取三羟甲基氨基甲烷6.06g,加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g,再加水溶解使成1000ml,调节pH值至9.0,即得。
乌洛托品缓冲液取乌洛托品75g,加水溶解后,加浓氨溶液4.2ml,再用水稀释至250ml,即得。
巴比妥缓冲液(pH7.4) 取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml,用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4,滤过,即得。
巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成2000ml,即得。
巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8) 取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解,另取明胶0.5g加水适量,加热溶解后并入上述溶液中。
然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8,再用水稀释至500ml,即得。
甲酸钠缓冲液(pH3.3)取2mol/L甲酸溶液25ml,加酚酞指示液1滴,用2mol/L氢氧化钠溶液中和,再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25~3.30,即得。
邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6)取邻苯二甲酸氢钾10g,加水900ml,搅拌使溶解,用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml,混匀,即得。
枸橼酸盐缓冲液取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20%乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20%乙醇稀释至100ml,即得。
枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)取2.1%枸橼酸水溶液,用50%氢氧化钠溶液调节pH值至6.2,即得。
枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)甲液:
取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml,置冰箱内保存。
乙液:
取磷酸氢二钠71.63g,加水使溶解成1000ml。
取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合,摇匀,即得。
氨-氯化铵缓冲液(pH8.0)取氯化铵1.07g,加水使溶解成100ml,再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0,即得。
氨-氯化铵缓冲液(pH10.0)取氯化铵5.4g,加水20ml溶解后,加浓氯溶液35ml,再加水稀释至100ml,即得。
硼砂-氯化钙缓冲液(pH8.0)取硼砂0.572g与氯化钙2.94g,加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0,加水稀释至1000ml,即得。
硼砂-碳酸钠缓冲液(pH10.8~11.2)取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml;另取硼砂1.91g,加水使溶解成100ml。
临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml,混匀,即得。
硼酸-氯化钾缓冲液(pH9.0)取硼酸3.09g,加0.1mol/L氯化钾溶液500ml使溶解,再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210ml,即得。
醋酸盐缓冲液(pH3.5)取醋酸铵25g,加水25ml溶解后,加7mol/L盐酸溶液38ml,用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(电位法指示),用水稀释至100ml,即得。
醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)取冰醋酸50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节pH值至3.0,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.6)取醋酸钠5.1g,加冰醋酸20ml,再加水稀释至250ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.7) 取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后,加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60~80ml,至溶液从蓝色转变为纯绿色,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.8) 取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.6)取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解,用冰醋酸调节pH值至4.6,再加水稀释至100ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)取醋酸钠54.6g,加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后,加水稀释至500ml,即得。
醋酸-醋酸钾缓冲液(pH4.3)取醋酸钾14g,加冰醋酸20.5ml,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸铵缓冲液(pH4.5)取醋酸铵7.7g,加水50ml溶解后,加冰醋酸6ml与适量的水使成100ml,即得。
醋酸-醋酸铵缓冲液(pH6.0)取醋酸铵100g,加水300ml使溶解,加冰醋酸7ml,摇匀,即得。
磷酸-三乙胺缓冲液取磷酸约4ml与三乙胺约7ml,加50%甲醇稀释至1000ml,用磷酸调节pH值至3.2,即得。
磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH2.0)甲液:
取磷酸16.6ml,加水至1000ml,摇匀。
乙液:
取磷酸氢二钠71.63g,加水使溶解成1000ml。
取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH2.5)取磷酸二氢钾100g,加水800ml,用盐酸调节pH至2.5,用水稀释至1000ml。
磷酸盐缓冲液(pH5.0)取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0,即得。
磷酸盐缓冲液(pH5.8)取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.5)取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml,用水稀释至100ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.6)取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g,加水使溶解成400ml,即得。
磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L
氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10g,加水适量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.8)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.0)取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml,用水稀释至100ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.2)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml,加新沸过的冷水稀释至200ml,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.3)取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g,加水使溶解成1000ml,调节pH值至7.3,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.4)取磷酸二氢钾1.36g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml,用水稀释至200ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.6)取磷酸二氢钾27.22g,加水使溶解成1000ml,取50ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml,再加水稀释至200ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.8)甲液:
取磷酸氢二钠35.9g,加水溶解,并稀释至500ml。
乙液:
取磷酸二氢钠2.76g,加水溶解,并稀释至100ml。
取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.8~8.0)取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,加水使溶解成1000ml,即得。
体外诊断试剂生产实施细则》第五十三条规定:
应当对每批产品中关键物料进行物料平衡核查。
如有显著差异,必须查明原因,在得出合理解释,确认无潜在质量事故后,方可按正常产品处理。
新版《药品生产质量管理规范》(二次征求意见稿)第一百八十八条规定:
每批产品应检查产量和物料平衡,确保物料平衡符合设定的限度。
如有差异,必须查明原因,在得出合理解释、确认无潜在质量风险后,方可按正常产品处理。
第二百一十五条规定:
在物料平衡检查中,发现待包装产品、印刷包装材料以及成品数量有显著差异或异常时,应进行调查,未得到合理解释前,成品不得放行。
《规范》中多处提到物料平衡的处理,其重要性可见一斑。
物料平衡(massbalance,materialsbalance,reconciliation):
产品或物料实际产量或实际用量及收集到的损耗之和与理论产量或理论用量之间的比较,并适当考虑可允许的正常偏差范围。
物料平衡的计算:
产出量/理论量*100%(产出量=产出合格品量+废弃量+取样量)
收率的计算:
产出的合格品量/理论量*100%。
二者区别:
1.物料平衡与收率均以理论量作为基数,即计算的分母,差别在于物料平衡的计算分子不仅包含了合格品量,还有废弃量与取样量,而收率的分子仅是合格品量,相信大家不难理解。
2.理论上,收率可以>100%;而物料平衡≤100%。
而在实际生产中:
收率大多情况下<100%(100%投料,不低限投料。
),如果装量、含量同时在合格范围又偏下限的话,收率超过100%很有可能。
物料平衡≤100%。
(涉及到印字包材时必须为100%)。
特殊情况下,物料平衡也会>100%,比如物料在车间出现引湿增重时。
而在生产中必须注意收率和物料平衡的范围,一般设定为98%~100.5%(根据验证及多批生产数据而得)合理性,这才是最关键的。
3.物料平衡是GMP要解决是否有混药和差错的质量问题,是防止混药和差错的一项重要举措,而收率是企业生产成本的经济问题。
选取不少于二家同类产品。
要求该产品生产企业是目前国内市场中普遍认可的品牌,以其中最宽线性范围为基础,并征求专家意见,然后确定本公司该产品的线性范围。
同类产品的相关指标为:
北京九强:
2~50umol/L
四川迈克:
3~50umol/L
a.取50ml容量瓶10个,500ml容量瓶1个,取基础液30ml于容量瓶中;
b.准确称取相当于50umol的超纯品Hcy,加入至小烧杯中溶解混匀,溶液倒入容量瓶内,反复用基础液冲洗小烧杯3次,洗液倒入容量瓶内。
用基础液稀释定容至500ml,即得含量为100umol/L的Hcy溶液。
将该溶液用基础液分别稀释至60umol/L、55umol/L、50umol/L、45umol/L、40umol/L、30umol/L、20umol/L、10umol/L、5umol/L、2.5umol/L。
c.将以上配制的各不同浓度的标准品分别平行检测四次,对检测数据进行离群值计算,测定结果大于G值G0.05=1.426的数据进行剔除,测定结果小于G值G0.05=1.426的数据进行保留,将准确度大于20%的浓度值予以舍弃。
以真值为X轴,测定值为Y轴,做标准曲线,舍弃明显偏离直线趋势的数据,取线性良好直线段求得线性回归方程,稀释浓度(Xi)代入求出线性回归方程,计算Yi的估计值及Yi与估计值的相对偏差。
线性偏差大于15%则认为超出线性范围。
本文来自:
医药社区()详细出处参考:
酶联免疫吸附测定的操作要点
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1标本的采取和保存
可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。
一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。
冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。
2试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3加样
在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。
加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。
每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。
也可在板孔中加入稀释液,再在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。
加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,使加液过程迅速完成。
4保温
在ELISA中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。
抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation),有人称之为孵育,在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
以抗体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。
这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。
在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。
这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。
37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时,产物的生成可达顶峰。
为加速反应,可提高反应的温度,有些试验在43℃进行,但不宜采用更高的温度。
抗原抗体反应4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀。
但因所需时间太长,在ELISA中一般不予采用。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外,一般均采用水浴,可将ELISA板置于水浴箱中,ELISA板底应贴着水面,使温度迅速平衡。
为避免蒸发,板上
同型半胱氨酸测定试剂盒(酶法)设计方案
1产品概述、处方及规格
1.1产品概述
本试剂通过测定人体液中同型半胱氨酸(Hcy)的浓度,主要是用于诊断心肌功能疾病。
产品测定原理:
同型半胱氨酸被转化为游离型后,通过与共价底物反应,循环放大,同时产生腺苷。
腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤,氨在谷氨酸脱氢酶的作用下,使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性(NADH)转化为NAD+,样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。
1.2产品处方
1.2.1试剂为液体双试剂。
校准品可使用朗道、罗氏等复合定标液。
1.2.2产品所用主要原材料为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性(NADH)、
三(2羧乙基)磷氯化氢(TCEP)、α-酮戊二酸、Hcy甲基转移酶(HMTase)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶及腺苷脱氨酶(ADA)等。
根据文献资料选用适当的缓冲液和稳定剂。
1.3产品规格
产品包装规格制定要考虑不同适用机型和不同客户需求,根据以往经验,拟制定规格:
R1-8ml、R2-2ml;R1-16ml、R2-4ml;R1-20ml、R2-5ml;R1-32ml、R2-8ml;R1-40ml、R2-10ml;R1-2×40ml、R2-2×10ml;R1-4×40ml、R2-4×10ml;R1-2×40ml、R2-20ml;R1-4×40ml、
R2-2×20ml;R1-8×40ml、R2-8×10ml;R1-80ml、R2-20ml;R1-2×80ml、R2-2×20ml;
R1-4×80ml、R2-4×20ml;R1-8×80ml、R2-8×20ml;R1-60ml、R2-15ml;R1-2×60ml、
R2-2×15ml;R1-3×60ml、R2-3×15ml;R1-8×50ml、R2-2×50ml;R1-6×70ml、R2-3×35ml;
R1-5×40ml、R2-50ml;R1-4×50ml、R2-50ml;R1-3×60ml、R2-45ml;R1-8×20ml、R2-8×5ml。
2产品质量标准
根据《临床化学体外诊断试剂(盒)通用技术要求》,应对试剂外观、净含量、试剂空白、灵敏度、准确度、批内精密性、批间精密性、线性范围和稳定性等做出要求和规定。
应参考已上市产品并满足临床使用要求。
2.1外观
R1、R2均为无色至浅黄色透明液体。
2.2净含量
不少于标示值。
2.3试剂空白
2.3.1试剂空白吸光度变化率
以蒸馏水为检测样本时,每分钟吸光度变化值(△A/min)的绝对值应不大于0.100A。
2.3.2试剂空白吸光度
以蒸馏水为检测样本时,吸光度应不小于0.800A。
2.4准确度
以质控血清(如Roche公司生产的质控血清)为检测样本时,测定值在质控血清规定的可接受范围内。
或用比对试验,相关系数r≥0.975,每个浓度点的相对偏差R≤20%。
2.5线性范围
Hcy试剂在线性范围0-50umol/L内,
a)回归系数r应不小于0.990;
b)线性偏差应不大于15%。
2.6分析灵敏度
Hcy含量为10umol/L时,测定吸光度变化率(减掉试剂空白吸光度变化率)△A≥0.002Abs/min。
2.7重复性
2.7.1测量精密度
同一个试剂盒分别测定高低两个样本值所得的结果,变异系数CV≤8.0%。
2.7.2批间差
连续三批生产的不同批号的试剂测定同一样本,相对偏差R≤20%。
2.8稳定性
Hcy试剂贮存于2℃-8℃、避光环境中,有效期为12个月。
3研制要求
3.1对试剂所用原料进行选择,试剂配方进行优化,确定所用原料的浓度,在保证产品质量的前提下尽量降低成本。
3.2对反应体系进行研究,选择最佳加样方案,兼顾反应的灵敏度和线性范围,并适合在全自动生化分析仪上应用。
3.3对生产工艺进行研究,以使研制的产品能够顺利进入生产程序。
3.4对试剂的分析性能进行评估,对产品质量标准中的各项进行实验评价并确定最终要求,据此拟定注册产品标准。
3.5实验确定该项目的正常参考值。
3.6稳定性研究:
试制至少三批样品,在实际储存条件下保存至成品有效期后,检测各项性能指标是否仍能达到产品质量标准的要求。
3.7进行临床研究,确定临床适用性和符合性。
4生产工艺流程(见附页)
5生产过程及工艺条件
5.1.1称量
5.1.1.1根据产品处方计算待配溶液所需各试剂成分量,用适当的称、量工具按顺序依次准确称量或量
取各试剂成分。
5.1.1.2称量过程要求控制称量试剂成分的正确性和精确性,需根据所要称、量试剂的量选用适当的称、量工具。
称量过程应有复核人复核。
5.1.2配制
在配液桶中加入预定体积90%左右的纯化水,然后依次加入准确称量的各试剂成分,注意在加入下一成分前,之前加入的试剂成分要已搅拌溶解。
所有试剂成分加完并溶解后,用纯化水定容至预定体积。
5.1.3过滤
5.1.3.1试剂配制完成后,用≤10um孔径的滤膜过滤。
根据液量多少,可采用蠕动泵过滤,液量过少时采用针头过滤器过滤。
5.1.3.2为减少酶或其他较大分子生物成分损失,可在加入这些成分之前进行过滤。
5.1.3.3过滤过程要避免溶液受污染,与溶液接触的器具应尽量专用,不能专用应保证洗涤彻底,以免造成试剂间的交叉污染。
5.1.4配液检验
配制完成的液体静置2小时以上,即可通知质检部取样进行性能检测,检测合格的试剂方可进入分装程序。
如配液量很少,配制后即分装,此步检验可省却。
5.2分装
可用蠕动泵调整液量后分装,也可采用称重法、量取体积法分装。
5.2.1装量控制
分装程序要求对装量进行控制,不得低于标示装量。
分装过程中对装量进行抽检,为避免损失溶
液和增加污染机会,建议采用称重法进行装量检验。
5.2.2分装后检验
分装完成后,通知质检部取样检验。
检验合格的试剂方可进入下一生产程序。
如分装和包装程序连续进行,在溶液配制后已进行检验的前提下,此步检验可省却。
5.3组装
5.3.1组装程序
5.3.1.1领取半成品、包装盒、瓶签、盒签、说明书。
5.3.1.2标签打印
在通用瓶签和盒签上打印相应内容:
瓶签在绿色区域内打印产品名称和半成品规格;
盒签在绿色区域内打印产品名称和试剂盒包装规格,并将注册号和产品注册标准部分打印完整。
5.3.1.3贴签
瓶签贴到半成品瓶身指定位置,端正、居中;
盒签贴于包装盒正面,端正,居中。
5.3.1.4叠说明书
将说明书横向对折两次后再纵向对折一次,折好后的说明书边缘应整齐。
5.3.1.5装盒
将包装盒折好,依次放入半成品组分和说明书,各组分位置应整齐有序。
5.3.2成品检验
试剂组装好后,通知质检部抽样检验。
质检部检验合格后按批生产量发合格证给生产部,生产部将合格证贴于包装盒指定位置,
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