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campetris利用HOCl自由基介导提高黄原胶量
通过Xanthomonascampetris利用HOCl自由基介导提高黄原胶量
及其机制研究
Y.ManjulaRao,G.K.Sureshkumar
BiochemicalEngineeringGroup,DepartmentofChemicalEngineering.
IndianInstituteofTechnology,Bombay,Powai,Mumbai400076,India;
telephone:
91-22-576-7208;fax:
91-22-572-3480;E-mail:
gksuresh@che.iitb.ernet.in
Received6September1999;accepted29June2000
(周鑫翻译)
摘要:
自由基介导已经被利用在生物反应生产中,特别是在Xanthomonascampestris生产黄原胶的产量和品质提高中体现的尤为突出。
HOCl(氧化剂)处理带来了产量增长210%,产物黏度(品质)提高20%。
另外,醋酸在产物中的质量比下降了42%,丙酮酸的质量比增加了63%。
生长率几乎未受HOCl处理的影响。
解释自由基介导的高产黄原胶的机制的假设也已提出。
SoxS蛋白与gum基因的启动子结合提高mRNA的转录水平是这个假说的重要内容,并且得到了实验证实。
©2001JohnWiley&Sons,Inc.BiotechnolBioeng72:
62–68,2001
关键词:
自由基;适应反应;Xanthomonascampestris;SoxS-DNA结合;黄原胶
1.简介
自由基可以用来调节一些重要的细胞周期,如细胞凋亡和癌变(FeigandLoeb,1994;Feigetal.,1994;Okunoetal.,1998;ReidandLoeb,1993)。
并且,自由基也通常被认为在温度、渗透压和营养水平起到了调节子的作用(Nagarathnammaetal.,1997;Osbournetal.,1990),这些也是生物反应器中的重要环境参数。
因此,自由基可以被认为在决定生物反应产量中有重要的角色。
氧自由基和氧分压是植物抵抗如Xanthomonascampestris这种植物病原微生物入侵的重要因子。
黄原胶是由Xanthomonascampestris在入侵时分泌的,并且这种粘液(黄原胶液)的分泌程度与致病性直接相关(Thoreneetal.,1987;Weissetal.,1994)。
从工业角度看,Xanthomonascampestris用来生产有商业价值的黄原胶,可以广泛利用于食品、医药、石油等其他行业(Lee,1996)。
如果自由基介导和黄原胶产量的关系可以阐明,就可以用来大大促进黄原胶的产量。
并且,更深入的研究有利于改进通过培养过氧化氢酶分解过氧化氢实现原位供氧的培养方法(Srirametal.,1998)。
我们通过加入自由基和研究菌体生长和黄原胶生产的反应,来调查自由基对生物反应器的反应影响。
目的在于促进黄原胶产量。
自由基促进生物反应产量没有在文献中报道过。
此外,这种方法可以很简单的应用到工业生产中,只不过就是在接种到种子培养瓶之前处理若干小时。
在这次研究中,我们通过一种自由基形成剂(活性氧类,ROS)次氯酸(HOCl)进行胞外处理来实现氧化条件。
就生长和黄原胶生产反面而言,对这种自由基产生剂的适应性反应(如随之产生的应答)已经被研究。
同时,也提出了关于自由基刺激黄原胶过量生产的一种遗传学假说。
假说中关于SoxS蛋白(一种自由基介导的调节蛋白)同DNA结合和高mRNA转录已经由实验证明。
特异性的甲基化研究表明,SoxS同gumB基因启动子区域特定的GCAY序列结合。
SoxS蛋白引起的由于gum基因的转录活性增加了的mRNA也被证明。
2.材料与方法
2.1培养物和其它特殊菌株
实验用微生物为生产黄原胶的Xanthomonascampestris(MTCC2286,IMTECH,Chandigarh,India)。
菌种保存在4℃,含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母浸出物、10g/LCaCO3和20g/L琼脂的斜面上。
生长培养基含有40g/L葡萄糖,3g/L酵母浸出物,5g/LK2HPO4,0.6g/LMgSO4·7H2O和0.4g/L尿素,用自来水溶解(提供痕量元素;培养基接种前不加入葡萄糖进行高压蒸汽灭菌)。
EscherichiacoliXA90(K-12),用来表达SoxS蛋白(LiandDemple,1994)和SoxS的抗体,由Prof.Demple(HarvardSchoolofPublicHealth,USA)惠赠。
SoxS缺失突变(DukanandTouati,1996)的E.coli由法国JacquesMonodInstitute的Prof.Touati提供。
携带有完整的Xanthomonascampestris的gum基因片段的质粒pIZD15-261(Katzenetal.,1996)由UniversityofArgentina的Prof.Ielpi惠赠。
2.2分析方法、试剂和仪器
细胞浓度可以通过分光光度计测量(Jasco,Japan)650nm处吸光值,利用细胞浓度对光密度标准曲线标定。
利用放大镜计数平板上的菌落数目。
黄原胶浓度的测量可以通过10000g离心45min,然后乙醇沉淀分离,测量其干重(Garcia-Ochoaetal.,1993)。
提取出的黄原胶溶解在去离子水中,利用数字黏度计(Contraveslowshear30)在37℃和8s-1的剪切力下测量0.2g/L黄原胶溶液黏度(不是培养液黏度)。
乙酸和丙酮酸的测定依照Blumerkrantz和Hansen(1973)以及Kennedy和Sutherland(1987)的方法。
mRNA表达量可以在乙醇沉淀和纯化除去不反应的核糖后用分光光度计计量(SadasivamandManickam,1996;Wuetal.,1995)。
核糖核苷酸和其他的标准化学物质从SRL,India购买。
次氯酸从次氯酸钠定量合成(SRL,India)并仅仅使用新配制的次氯酸。
自旋标记物前体,2,6-二甲基-4-哌啶酮从德国FlukaChemicals公司购买。
寡核苷酸由印度Genetix购买。
使用的生物反应器是2L搅拌罐(1L工作体积)带有两个Rushton涡轮机叶轮和转速、温度控制装置。
在空气流速为3L/min和叶轮300rpm转速下,利用动态响应(dynamicresponse)测定的容积氧传递系数(KLa)为32.5h-1。
溶氧和pH的数据由一台电脑上的数据获得控制系统(SCRElektroniks,India)通过探头(BelaInstruments,India)实时获得。
一个电子旋转共振(ESR)分光光度计用来获得ESR光谱。
2.3处理过程
简要的说,HOCl对E.coli处理在利用。
然而,HOCl浓度和菌体生长阶段难以界定。
在必需的生长阶段时,细胞浓度达到2g/L,悬浮于0.05M的磷酸缓冲液分装到几个25mL摇菌瓶中。
瓶在使用前,用硫磺酸等彻底清洗。
新配置的次氯酸,浓度用碘滴定法标定,在三个阶段方法加入到培养基中。
每个阶段包括60s的HOCl处理细胞,离心分离细胞,再用普通生长培养基30℃暗处温和震荡培养40分钟。
三个阶段最初用HOCl处理步骤的使用浓度分别为:
0.66mmol/gcell(阶段I),4.65mmol/gcell(阶段II),20mmol/gcell(阶段III)。
在第三次培养后,留在瓶中的自由氯可用无菌硫代硫酸钠除尽。
培养的菌种用LB琼脂平板分析,在培养十小时后计数。
2.4培养研究
活菌分离后用前面提到的生长培养基,在30℃摇床中震荡培养。
生长实验用1L生物反应器30℃下进行。
2.5DNA-蛋白质相互作用研究
2.5.1蛋白分离
从细胞培养物中来进行SoxS蛋白分离的方法是Li和Demple提出的(1994)。
2.5.2自旋标记的SoxS蛋白合成
顺磁性标签2,2,6,6-四乙基哌啶酮-1-氧基,由2,6-二甲基-4-哌啶酮通过H2O2催化氧化,并标记SoxS蛋白。
过程由Wagner和Hsu(1969)提供的自旋标签准备和蛋白标记,不同的是,pH保持在6,防止SoxS不反应并且正确形成希夫碱。
2.5.3寡聚核苷酸合成
同包含有SoxS交感序列和对应的甲基化序列(见结果与讨论)的gumB基因启动子区域类似的寡聚核苷酸,由前面提到的供方获得合成。
2.5.4电子自旋共振(ESR)检测光谱测定SoxS-寡聚核苷酸结合
通过ESR检测SoxS蛋白同核苷酸序列结合,其原理是,当标记的底物被结合时,与之固定的自旋标签颜色变化,导致ESR谱线增宽(Morisett,1976;Smithetal.,1976)。
光谱线的高度减小和吸收曲线高斯分布的标准差增加可以量化光谱增宽的程度。
高斯分布十分接近生物系统中的ESR吸收曲线,并且这种光谱曲线宽度和分布的标准差在数量上的一致性通过它们的数学表达是非常明显的(Boltonetal.,1972;Borg,1976)。
石英测量杯用来盛放样品,在所有ESR分析中,每个不同的样品体积相同(250μL)。
同时注意保持每个测量杯中的样品浓度在要求的范围内。
2.5.5转录活性试验
含有全部gum基因的质粒和分离纯化的SoxS蛋白用作转录活性试验。
程序由Wu等提供(1995),是进行mRNA分析。
所有以不同方式描述的试验至少重复了三次并且是不同时间。
(张琼林翻译)
3.结果和讨论
3.1致死浓度,菌落形态和黏性
次氯酸(HOCl)的处理浓度的确定,是在添加了HOCl的普通生长琼脂平板上,处理组达到同野生细胞相比只有50%存活的剂量(致死浓度[LC50])。
结果表明野生型Xanthomonascampestris细胞能够耐受非常低浓度的HOCl(LC50=9mM或4.5mmol/gcell)。
野生型和HOCl处理过的菌体,在普通的生长平板上的菌落形态和黏度(黄原胶生产能力)在表一中示出。
处理是来自野生型细胞的四个生长时期,名为对数期早期(1h),对数期中期(2.5h),稳定期早期(10h),和稳定期晚期(50h)。
四个时期的野生型细胞都是圆形菌落并表现出黏液样。
HOCl处理组,早期的细胞体现出圆形菌落和黏性,然而生长晚期的细胞形成的菌落呈圆锯齿形。
电镜检查显示,锯齿形菌落的微结构类似于经溶菌酶处理的野生型细胞(结果未显示)。
溶菌酶除掉细胞壁,而圆锯齿形菌落的形成也是由于细胞壁的破坏(Whitfieldetal.,1981)。
不过,同野生型相比,细胞的黏度更大,更多。
表一野生型和HOCl处理的Xanthomonascampestris细胞的菌落形态和黏度
处理方法
对数期早期
对数期中期
稳定期早期
稳定期晚期
无(野生型)
圆形、黏
圆形、黏
圆形、黏
圆形、黏
HOCl
圆形、黏
圆锯齿形、黏
圆锯齿形、黏
圆锯齿形、黏
3.2培养生长
图一表示了HOCl处理的细胞的生长情况。
初浓度保持在0.63±0.02g/L。
HOCl处理组的最大细胞浓度达到5.94±0.03g/L,这个可以和野生型相当。
生长可以通过Riccati公式模拟,这个方法用来模拟细胞生长由来已久(BaileyandOllis,1986):
(1)
这种模拟也在图一中体现。
对应的最大浓度作为公式中的Xs。
野生型和HOCl处理组的细胞生长速率相当(通过最小二乘法分析),分别为0.6和0.65h-1。
图一野生型和HOCl处理组的Xanthomonascampestris细胞生长曲线。
点表明实验数据,线表示模拟的生长趋势。
(○)野生型细胞;(●)HOCl处理细胞。
(李盛兵翻译)
3.3黄原胶性质
图二示出野生型和HOCl处理组的黄原胶生产概括。
50h时,野生型产黄原胶浓度达到3.1g/L,HOCl处理组产物浓度有6.5g/L,这个是相同培养基条件下野生型产量的210%。
因此,HOCl处理显著地提高了Xanthomonascampestris产黄原胶的最大能力。
黄原胶在一定浓度和温度下的水溶液的黏度,是表明其品质的一个重要参数。
黄原胶是由β1-4葡萄糖苷键形成骨架,甘露糖、葡糖醛酸、醋酸、丙酮酸构成侧链的高聚物;它的品质依赖于丙酮酸和醋酸在黄原胶中的质量百分数(HasslerandDoherty,1990)。
因此,我们分析了醋酸和丙酮酸分别在野生型和HOCl处理组的黄原胶产物中的质量分数和黏度。
表二中的结果(到50h时的黄原胶生产)显示出HOCl处理组的丙酮酸质量含量是3.1%,比野生型的多63%。
醋酸质量分数在野生型细胞产物中为5.7%,比HOCl处理组的3.3%高出72.7%。
HOCl处理组细胞产的黄原胶黏度为4.2cP,比野生型的3.5cP多了20%。
据称,黏度增加意味着丙酮酸质量分数增加同时醋酸质量分数减少(HasslerandDoherty,1990),实验结果也证明了这一点。
不同程度的丙酮酸化(丙酮酸质量分数)应该是由两个培养中不同的糖类含量引起的。
胶中的糖类分析从气象色谱分析仪(GCMS)获得,在表三中显示,表明,鼠李糖在HOCl处理组的产物中完全没有,然而在野生型细胞产物中达到24%。
同时,甘露糖质量分数是37.5%,这个比野生型产物明显高很多。
有趣的是,葡萄糖和葡糖醛酸质量分数在HOCl处理组的黄原胶产物中与野生型产物基本一致。
高含量的甘露糖必然引起高水平的丙酮酸化,因为丙酮酸化发生在甘露糖末端(Meltonetal.,1976)而且高的丙酮酸化程度会引起HOCl处理组产物比野生型产物黏度更高。
图二野生型和HOCl处理组的黄原胶产量对比。
(○)野生型细胞;(●)HOCl处理细胞。
表二野生型和HOCl处理组的黄原胶获得的终浓度和性质
细胞类型
50h时胶浓度(g/L)
丙酮酸
(质量分数)
醋酸
(质量分数)
黏度
(cP)
野生型
3.1
1.86
5.7
3.5
HOCl处理组
6.5
3.10
3.3
4.2
表三野生型和HOCl处理组的胶产品中的糖类分析
细胞类型→
糖类↓
野生型
(质量分数)
HOCl处理组
(质量分数)
葡萄糖
46.0
45.0
甘露糖
13.0
37.5
鼠李糖
24.0
0.00
葡糖醛酸
18.0
17.5
3.4自由基介导的黄原胶高产量的机理
HOCl通过Fenton反应和Haber-Weiss反应产生自由基(DukanandTouati,1996),也就能了解到HOCl处理给Xanthomonascampestris带来了自由基(ManjulaRaoandSureshkumar,2000)。
我们发现了通过自由基介导的黄原胶过量生产的机理。
已经研究出,黄原胶基因表达,在一般情况下,是由一个gumB基因上游的强启动子所调节(Katzenetal.,1996)。
因此,可以设想自由基可以激活前面提到的启动子并增加胶产量。
在这个研究中,因为我们已经由HOCl获得了自由基,可以证明HOCl直接产生前面提到的效应,而不是通过自由基。
因此,如果是这样的话,当HOCl处理组细胞生长在痕量HOCl条件下,会有更高浓度的胶产量。
但是,当HOCl处理组细胞在4.6μmol/gcell浓度的HOCl(痕量,初始浓度)下,在50h时,仅仅获得了4.7g/L的黄原胶,与普通培养基中的6.5g/L产量可以做个对比。
然而,生长并没有受到显著影响。
这就印证了这个看法,HOCl的影响并不是直接的,而是通过自由基产生的。
在E.coli中,对氧的衍生物造成的氧化环境的反应,是通过SoxRS调节子调节的(Nunoshibaetal.,1994;Wuetal.,1995)。
对过氧化环境的反应是通过OxyR调节子调节的;然而,因为用H2O2进行了相似的处理没有带来黄原胶浓度的显著增加(结果未显示),这就有理由假设SoxRS调节子在研究中有重要作用。
通过SoxR(敏感蛋白),一个细胞内的氧化条件信号提高了SoxS水平。
SoxS紧接着引起了一连串的几种由调节子控制的基因的表达,应对细胞内氧化条件。
到目前,SoxRS调节子并没有在以往的文献中报道过。
然而,Xanthomonascampestris中的可能用来应对环境压力如搞渗透压培养或者是营养限制的双元件的调节系统还是有一定了解的。
我们怀疑Xanthomonascampestris中自由基介导的黄原胶过量生产的机理,涉及到SoxRS调节子或者是类似的元件。
作为一个适应性反应,SoxRS调节子的蛋白期望在随后的世代中保持在一个高水平上,这可能会带来胶的高表达,甚至是在缺少自由基介导物的条件下。
我们观察到,菌株保持了黄原胶的高表达持续了至少50代——或者说是14次包括3到4个世代的传代培养——在处理后的。
然而,表达量随着传代增加而减少。
举例来说,一次传代后,黄原胶产量达到6.5g/L,二次传代后到了5.4g/L,然而在14次传代后,仅仅有3.3g/L,与之做对比的是野生型3.1g/L的产量。
对SoxRS调节子带来高表达黄原胶的假设如下:
介导的自由基带来了SoxRS调节子激活;调节蛋白SoxS,同gumB基因的强启动子结合,引起黄原胶过量生产。
后面的文字详细介绍了所提出的假设中关于蛋白-DNA结合和转录方面的实验证明。
另外,高浓度的HOCl(对于E.coli:
高于57μM,转换作2.1mmol/gcell),有可能破坏一些抗氧化酶如谷胱甘肽(Dukanetal.,1999)并且这就引起了大量的自由基形成。
这些过量的自由基,紧接着进一步激活了SoxRS调节子,引起黄原胶高产和更高的超氧化物歧化酶(SOD)活性。
超氧化物歧化酶是众所周知的抗氧化酶(HalliwellandGutteridge,1985)并且更高的SOD活性在HOCl处理的Xanthonomascampestris中有发现(ManjulaRaoandSureshkumar,2000)。
(陈家瑞翻译)
3.5SoxS蛋白同GumB启动子结合
SoxS的特异性交感序列由Li和Demple(1996)测出:
AN2GCAYN7CWA
其中,N代表任意碱基,Y是一种嘧啶,W是A或T。
同时,相关的不同基本序列的重要性不同,GCAY是最重要的。
根据SoxS识别片段,几种由SoxRS潜在调节的基因已经由E.coli基因组数据库确定(LiandDemple,1996)。
我们检查Xanthomonascampestris的gumB启动子域(在gumB基因上游的-35区):
CCGGCACGCGTCGGGAT
并且在其中发现最重要的SoxS蛋白识别位点(由斜体标出)。
因此,SoxS蛋白很有可能同gumB基因启动子域结合。
为了深入研究SoxS蛋白同gumB基因启动子的结合,我们合成了一段寡聚核苷酸,同gumB基因启动子包括SoxS交感序列一样。
分离出的SoxS蛋白真实性由SoxS抗体证明,通过ESR检测,如“材料与方法”中所述。
谱线峰高减少了5.6%并且标准差增加了200%,这就表明了结合。
SoxS蛋白同SoxS抗体结合也通过免疫电泳法证明了(数据未显示)。
寡聚核苷酸-蛋白(DNA-蛋白)相互作用也通过ESR研究。
带有自旋标记蛋白的寡聚核苷酸的ESR谱线(图三)显示出高度减少了21.3%,标准差增加了20.1%。
这个结果显示出,蛋白确实同寡聚核苷酸相结合。
相似的结果通过E.coliSoxS蛋白和寡聚核苷酸获得,这证明了在Xanthonomascampestris中的SoxS蛋白可能与E.coli中发现的类似。
图三(A)自旋标记SoxS蛋白的ESR谱线;(B)带有寡聚核苷酸的自旋标记SoxS蛋白的ESR谱线
3.6DNA-蛋白结合的特征
对照组用来排除非特异性蛋白寡聚核苷酸结合。
用作对照组的是自旋标记抗血清,一种包括白蛋白和一种SoxS缺失突变的自旋标记蛋白提取物。
每种对照和寡聚核苷酸结合也通过ESR检测。
可以观察到,当分别同寡聚核苷酸混在一起时,没有明显的光谱特征的变化,因此,SoxS同寡聚核苷酸的结合是高度专一的。
蛋白特异性地结合在gumB启动子的GCAY序列可以通过特殊的甲基化GCAY其中一个碱基并且检测SoxS同甲基化寡聚核苷酸的结合这种实验来证明。
已知,甲基化可以干扰蛋白-DNA结合(LiandDemple,1996)。
我们研究了自旋标记SoxS蛋白和带有一个甲基化G(表示在如下序列中星号标记)的寡聚核苷酸之间的反应:
CCGG*CACGCGTCGGGAT
发现在存在或者缺少甲基化寡聚核苷酸时,没有显著的光谱改变(谱线没有列出)这表明了SoxS蛋白没有同甲基化的寡聚核苷酸结合。
因此,可以得出结论,SoxS蛋白同gumB启动子域的GCAY序列特异性结合。
3.7SoxS引起的一连串gum基因转录激活
在SoxS蛋白结合启动子域后,下一步就是有关mRNA的转录。
确定是否Sox结合会引起下一步合成黄原胶生产相关基因,我们估量了存在和缺少SoxS下的mRNA的获得水平(和其他必需的寡聚核苷酸)。
SoxS存在时的mRNA浓度为比缺少SoxS高很多。
SoxS增加mRNA水平的事实证明了SoxS为一连串gum基因的转录激活子。
4.结论
利用HOCl处理得到自由基提高黄原胶的产量和品质,这样的一个新的方法由此提出。
存在和不存在HOCl的Xanthomonascampestris生长速率基本相同。
同时,HOCl处理带来了黄原胶品质的显著提高。
醋酸、丙酮酸质量分数和胶中糖类的波谱,HOCl处理的菌株同野生型菌株分泌的胶不同。
一个解释自由基介导高产黄原胶的机理也阐述明确,并且得到了实验证实:
SoxS蛋白同gumB基因启动子特异性结合位点;高mRNA通过SoxS存在时gum基因转录表达。
参考文献
BaileyJ,OllisD.1986.Biochemicalengineeringfundamentals.NewYork:
McGraw-Hill.
BjerrumOJ,Bog-HansenTC.1976.Immunochemicalgelprecipitationtechniquesinmembranestudies.In:
MaddyAH,editor.Biochemical
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BoltonJR,BorgDC,SwartzHM.1972.Biologicalapplicationsofelectronspinresonance.NewYork:
WileyInterscience.
BorgDC.1976.ApplicationsofESRinbiology.In:
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AcademicPress.
BlumerkrantzN,HansenAG.1973.Determination
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