动态响应调节蛋白依赖G蛋白调节细胞极性.docx

动态响应调节蛋白依赖G蛋白调节细胞极性.docx

《动态响应调节蛋白依赖G蛋白调节细胞极性.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动态响应调节蛋白依赖G蛋白调节细胞极性.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

动态响应调节蛋白依赖G蛋白调节细胞极性

在黏细菌中调节G蛋白依赖极性的动态响应调节蛋白

1摘要

迁移细胞使用复杂的信号转导系统，以响应环境并向引诱来源两极化。

细菌细胞也动态地调节自己的极性来改变其运动方向。

在黏细菌中，一种GTP结合的Ras-G-蛋白，MglA，激活在主导细胞极的运动机械。

MglA的极对极开关造成逆转，这是类似化学感受信号控制下的转导级联反应（Frz）。

众所周知，在细胞一极MglA的非对称本地化受MglB监管，MglB是一种GTP酶激活蛋白（GAP）。

在此过程中，MglB具体定位在相反滞后的细胞极并在这极阻止MglA的本地化。

然而,MglA如何定位到主导极，FRZ如何同步切换MglA和MglB的本地化仍未知。

在这里，我们显示，MglA，需要RomR，一种已知的响应调节蛋白，高效的定位于细胞的主导极。

具体来说，RomR-MglA和RomR-MglB的复合物被形成并建立互补的极性轴，分离MglA和MglB到细胞的相反极点。

最后，我们提出的证据表明，FRZ信号可能通过RomR调节MglA的本地化，这表明RomR构成了FRZ信号和MglAB极性模块之间的连接。

因此，在黏细菌中，响应调节蛋白支配小G-蛋白的本地化，增加了对极化机制的进一步了解，并建议结合现有的不同来源的信号模块演变蠕动调节。

2引言

在生物体中，细胞极化存在于许多发育过程和细胞过程中，如出芽酵母中，细胞迁移和细菌分化中[1–3]。

在真核细胞中，极化机制确保了细胞分裂过程中亚细胞器的非对称定位及其运输[4]。

由于发现细菌细胞也包含亚细胞结构和微结构，一直认为小细菌细胞是无组织的结构的观念被证明是一个错误[5,6]。

特别是，细菌细胞极编排工序繁多，例如趋化作用，鞭毛装配，甚至染色体分离[5,7–10]。

靶向极经常驻留在骨架蛋白或复合物通过几种可能的机制定位到极：

互动的形成分工隔[7,8]，识别特定的脂质极性微结构域[11,12]甚至直接几何识别极曲率[13,14]。

在某些情况下极性定位必须是一个动态的分离细胞分裂抑制剂[9,10]，降低细胞周期调节[15]，或反转细胞运动的方向[16,17]。

在这项研究中，我们识别指导调节黏细菌中一种特异性激活动态极的活力复合物。

黏细菌是一种棒状的δ-变形细菌，两个不同的大分子驱动蠕动机。

第一个系统，一个IV型菌毛（T4P）发动机在领先的细胞柱结合到邻近的细胞或拉的细胞的细胞外基质退出（S-蠕动，[18]）。

第二个系统，最近的特点是Agl-Glt复合物，它集结在细胞主导极，主要分布在细胞体形成粘着复合物来推动细胞（A蠕动，[19〜21]）。

黏细菌细胞引导他们的运动性通过周期性的改变他们的的运动方向，在这个过程中，极点交换角色，使细胞恢复运动中的相反的方向。

这些倒退需要同步转换A-和S-分子发动机的方向性。

最近的细胞学实验表明，预组装的的T4P存在于这两种细胞两极，由于不对称菌毛相关的蛋白质，如FrzS，TGL，PilB和PilT的存在，只有一个电池电极[22–24]。

菌毛方向性的切换，发生以下的极极切换的这些因素，已通过FrzS和PilT被实验观察[22,24]。

这种机制，使方向开关的A-运动系统目前还不太清楚，但似乎涉及到同步极极开关的基本AGL-GLT复杂的蛋白质，这已被证明为AglZ和AglQ[21,25]。

是什么驱动动态行为的A（AglZ，AglQ）和S的运动性的蛋白质（FrzS，的pilT）逆转？

最近的研究作为中央监管机构的确定了MglA和MglB的蛋白质反转周期。

MglA是一组的创始成员之一，细菌G-蛋白的Ras超家族[16,17,26]。

至于其他所有RAS-G-蛋白中，MglA是一个核苷酸（GTP）依赖的分子开关的蛋白质，循环于有效（与GTP结合）和无效（与GDP结合）的状态[26]。

在蠕动，MglA-GTP基本上是定位在细胞主导极，同时激活T4P和AGL/GLT系统。

确切的激活机制尚不清楚，但可能涉及到与FrzS和AglZ的直接互动[27]。

MglAGTP水解活性本质上很低，是用于协助体内的MglB，一个GTP酶激活蛋白[16,17]。

MglB是调节MglA的一个空间，并定位在相对落后的细胞极，在这极抑制MglA的约束力[16,17]。

因此，可以形成一个极性MglA和MglB轴由MglA和MglB的极极开关同步反转，从而引起了反转[16,17,28]。

切换MglAB是一个涉及FRZ信号转导途径的信号活性的调节过程，这是一种化学感受样装置[16,17,28]。

然而，FRZ如何在分子水平上调节MglAB的开关，仍然是未知之数。

综上所述，粘球菌逆转通过切换能动性系统（A和S）的活性在MglA和FRZ信号转导通路控制下的电池极引起。

这项研究中，我们研究MglA如何定位于细胞极点。

我们发现MglA的极性定位需要RomR。

在此之前，它表明，RomR，其中一个重要Amotility蛋白，在FRZ控制的细胞两极，它主要是积累在双极非对称模式落后的细胞极[29]。

由于RomR包含一个响应调节器域，其FRZ蛋白激酶（FrzE）的磷酸化可直接为调控A-运动性做出贡献[29]。

重新审视RomR的作用，我们发现RomR功能不仅为A-和S-运动性而且为上游MglA聚集到细胞极起作用。

结果进一步表明，建立从RomRMglA和RomR-MglB复合物的形成，导致强大的不对称蛋白定位在两极的极性轴。

最后的证据表明RomR，可能构成了FRZ和MglAB的极性控制系统之间的联系。

3材料与方法

3.1菌株，质粒，生长条件，和基因构建

请参阅表S1，S2菌株及其建设模式的质粒和表。

引物序列和质粒的构建方案中所提供的表S3和S4。

黏细菌株生长在CYE丰富的媒体32uC，如前所述[45]。

质粒用电穿孔法引入在M.xanthusby。

突变体和转化子，获得了同源重组，根据以前报道的方法[45]。

互补的融合和突变蛋白的表达，而这些基因的异位整合MX8-噬菌体附着位点[16]在适当的删除背景或表达自己的启动子控制下的内源性基因（表S2）。

使用前面描述的定位研究FrzS-YFP，AglZ-YFP，MglB-mCherry/YFP功能融合[16]。

在MglA-YFP的情况下，本地化的研究进行了在一个部分二倍体背景下MglA-YFP和MglA的表达，表达的MglA-YFP背景下是不相关的检测蠕动缺陷[16]。

一个功能性RomR-MCH融合蛋白的构建本研究的的内源性romR轨迹（表S1，S2，S3，S4和图S1）表示。

细胞表型分析，发现CYE板在浓度1.5％或0.5％的琼脂浓度时含有4×109cfu·ml-1，在32℃培养48h后，与奥林巴斯SZ61双筒望远镜或尼康的Eclipse（型号TE2000E）显微镜照片绘制。

3.2Westernblotting

Westernboltting如前所述[16]用1/10，000稀释的戊-His的（QIAGEN公司），MglA或MglB抗血清。

3.3荧光成像和荧光强度的测量

如前所述的时间推移进行实验[46]。

进行使用的自动化和显微分析倒落射荧光显微镜TE2000-E-PFS（尼康，法国）。

显微镜配备了“完美的对焦系统”（PFS），自动保持焦点，因此，在标本的兴趣点始终保持在任何时候都在大家关注的焦点，尽管任何机械或热扰动。

用CoolSNAPHQ2（罗珀科学罗珀科学SARL公司，法国）和406/0.75DLL“计划Apochro垫”或1006/1.4的DLL目标图像被记录。

所有荧光图像被收购的最小的曝光时间，以尽量减少漂白和光毒性反应

平均荧光强度分布计算如下。

一个二维图形的像素强度沿首先被计算为每个小区的小区轴。

单元格边界然后，定义使用阈值，并且将所得限制个人资料被剪接在15段的长度相等。

群集概率分布直方图，如下制得：

在一个段内的发生的荧光群集通过定义一个最小群集强度阈值检测值和相同的阈值被用于所有条件。

3.4细胞跟踪和延时荧光显微镜

细胞进行跟踪自动使用先前描述宏观[46]MetaMorph软件（分子设备）;在适当的时候，手动测量，也被内置到软件中的工具进行正确的跟踪误差。

图像进行处理，同时根据ImageJ的1.40克（国立卫生研究院，美国）的MetaMorph。

测得的单细胞移动距离指扣除行驶距离由一个给定的小区，而不论其方向运动。

因此，逆转或任何形式的来回运动，在这些测量中不占。

作为行驶距离的总和计算的值由细胞的质心像素在10分钟的参考时间框架。

先前进行统计分析的细胞逆转30逆转细胞的每个测试的菌株[16]描述的。

时间推移电影是由30秒的时间框架，以避免光毒性和光漂白。

由于拨回，这是很难捕捉到平均30秒之间的初始暂停和运动恢复暂停的确切时间和荧光开关，在我们的电影，制造噪音的分析。

尽管如此，反转时间只要在相反的方向运动检测得分。

MglA-YFP和RomR-MCH开关的进行评分时的最大荧光达成新的领导极。

用下面的公式计算的交叉相关系数（RXY）得分逆转和荧光极磁极性转换之间的延迟时间（米）：

在这些条件下，尽管时间分辨率低时间的推移，显着Rxy值（RXY理论值很好的相关性为1），可以得到接近0的时间延迟值（630秒），允许相关荧光极性倒置（X（T））和细胞逆转（Y（T））的信心。

3.5共纯化分析

联合净化实验进行表达它的内源启动子的功能RomRHis6从在MX8网站在romR突变（充分突变的补充，图S1）中，分别为WT，mglA和mglB突变背景。

作为对照，共纯化特异性实验进行平行，，使用WT，mglA和mglB单突变体的表达标签RomR，显示，MglA及MglB时，只恢复了RomRHis6表示。

共同净化后，进行重新接种细胞到1L瓶中至OD600为0.4〜0.8。

通过纺丝，在5000rpm，20分钟，收集细胞。

弃去上清液，将沉淀物在洗涤缓冲液洗涤两次（NAH2PO450mM的，Nacl100，氯化镁5mM的，pH8.0）中，然后被再悬浮于20毫升裂解缓冲液（NAH2PO450毫米氯化钠100mM，氯化镁5mM，MLB-ME（Bio-Rad公司），3200毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC，Clontech公司），10μΜ，3BENZONASEGDP（Sigma公司），20毫米咪唑pH8.0）中。

细胞，然后中断与法国媒介和降速转速18,000rpm，4℃，1h。

然后将上清液转移入50mlFalcon管中，在冰上与预平衡的镍珠（Biorad公司）并混合。

珠和溶胞产物随后在4℃孵育2小时，在25的转速的旋转轮上。

通过低速离心（1分钟，以2500rpm的转速）的珠绑定RomR的络合物，然后收集，并在50毫升的裂解缓冲液洗涤三次。

通过添加100毫升的蛋白上样缓冲液进行洗脱（Leammli）直接的珠子和沸点在100℃，10分钟。

Western印迹进行超过20mL的总洗脱体积在标准条件下，来检测RomRHis6，MglA和MglB。

4结果

4.1分析开关运动性蛋白定位依存的网络

图1A＆B概括了以前研究的交换和运动蛋白的定位模式，MglA，MglB，FrzS，AglZ和RomR。

以前的工作提出一个有序的途径，FRZ激活MglAB极对极开关切换本地化的下游运动系统具体的监管机构，如FrzS（S-运动性），AglZ和RomR的（A蠕动）[16,17,27,29]。

为了证实这些研究中一个确切的方式，并确定这些蛋白的定位之间的相互依存关系，我们系统地分析了本地化功能YFP/mCherry（MCH）融合到MglA，MglB，FrzS，AglZ和RomR（[16]，图S1，S2，S3）在所有的单突变体（总结于图1C和S2，S3，S4，S5）。

多数结果与以前的研究是一致的，并确认需要建立一个极性轴的运动性MglA和MglB：

在mglA突变体，AglZ-YFP扩散和未能积累在极点和在周期性的位点;FrzS-GFP，RomRMCH和MglB的的-YFP本地化的只有一个细胞极（图1C[16,17,27,29]）。

在mglB突变，所有四个蛋白MglA-YFP，FrzS-YFP，AglZ-YFP和RomR-MCH显示双极性对称图案（图1C，图S2[16,17]）。

FrzS或AglZ本地化对任何其他的四个蛋白质没有影响，因此，必须是MglA和MglB下游的支链调节S-和Amotility，（图1C，S3，S4和[27]）。

在romR突变体，MglA-YFP和AglZ的-YFP表现为严重的本地化缺陷：

AglZ-YFP的是完全弥散反射（图1C和S5）和MglA-YFP的定位在很大程度上呈弥散性的图案，只是偶尔有轻微的极性，在某些细胞中的病灶中形成（图1C和图2A）。

FrzS-YFP和MglB-YFP的本地化受到较小影响：

这两种蛋白定位于一个细胞极，但没有表现出动态的极对极振荡（图1C，S5和数据不表明）。

4.2RomR需要MglA极性定位

在romR突变体，MglA的非本地化不会导致蛋白质的表达和/或稳定性的缺陷，因为MglA积累到WT稳态水平的突变所确定的Westernblot分析（图六）。

因此，我们进一步研究了MglA极性定位依赖RomR的机制。

在没有RomR时，MglA的错误定位可以在极目标直接或间接造成缺陷因为MglB的动态影响，干扰MglBGAP活动的空间调控。

为了区分这些可能性，我们测试了删除mglB是否恢复MglA-YFP本地化。

在野生型细胞中，MglA-YFP主要聚集在细胞主导极，并倒转之间逐步积聚在相反的细胞极[16,17]。

其结果是，荧光快照MglA-YFP的表达细胞与单极（60％）或与双极MglA-YFP的群集（40％，图2A）示出了混合细胞。

MglA-YFP在一个romR和一个romR的mglB突变体的比较显示，MglA-YFP本地化扰动的突变体的水平相当：

在这两种突变体，MglA-YFP主要是弥散性的，只有积累在不到一个小的单极集群20％的细胞（图2A）。

因此，在romR突变体，MglA-YFP的错误定位在很大程度上独立于MglB，可能直接导致RomR缺乏。

在romR突变体，MglA错误本地化可干扰MglB的动态。

为了测试这一点，我们提出MglB-YFP的动态是否在一个romR和mglA双突变体中恢复。

符合MglB-YFP极到极的动力学表明单极（75％）或双极性模式（25％）在野生型细胞（图2B）的混合。

在都romR和romRmglA的突变体，严格单极的MglB-YFP表明，在romRmglA突变体，MglB-YFP动力学没有显著恢复。

因此，极点到极点的MglB-YFP动态在romR突变的情况下是不能简单地由MglA-介导干扰的，但可能从全局MglA功能损失结果引起的。

与此相一致，任何缺乏MglA的突变体（mglA突变体）或非本地化突变体（romR突变）受MglB和其他运动蛋白切换的影响，例如FrzS（图1C和S5）。

4.3MglB需要在落后的细胞极优先积累RomR

在WT细胞，RomR定位在双极性不对称的模式并大量积存在落后的细胞极（图3A）。

这种不对称是怎么产生的？

它是如何涉及到RomR功能？

RomR-MCH本地化的对称的两个细胞两极的双重mglAB突变，显示出RomR不需要MglA和MglB绑定到细胞两极（图3A）。

由于在mglB突变体RomR定位在双极性对称图案（图1C），但在mglA突变体仅一个细胞的极点存在（图1C和图3B），这些结果表明，RomR-MglB的相互作用捕获RomR到滞后细胞极。

与此相一致，双标记实验表明在mglA突变体RomR-MCH和MglB-YFP融合定位于相同的细胞极（图3B）。

值得注意的是，FrzS-GFP，通常累积大多是在细胞主导极[22]，同时也和MglB-MCH（一个功能MglBmCherry融合，[16]）共同本地化和在MglA中没有RomR-MCH（图如图3B所示，数据未示出，见讨论）。

总的来说，这些研究结果表明，RomR不加区别地结合到细胞两极，其不对称WT细胞源于在细胞主导极MglA的本地化和MglB在落后的细胞极的相互作用。

4.4RomR分别与MglA和MglB形成单独的复合物

接下来，我们在细胞两极测试MglA、MglB和RomR的本地化依赖关系是否直接阻遏nteractions蛋白。

为了测试RomR-MglA和RomR-MglB潜在的相互作用，我们补充的romR的突变株与允许表达RomR稠合到在其C-末端六组氨酸基序（His6的），染色体整合的romR启动子的控制下从一个结构在MX8噬菌体附着部位[16]。

表达RomR-His6的互补来实现romR删除标记的蛋白质是全功能（图S1）。

然后通过黏水溶性提取物对镍柱亲和层析（查看方法）测试RomR，MglA和MglB之间的相互作用。

在这些条件下，RomR容易与MglA和MglB共同纯化，表明MglA和MglB与RomR（图4）进行互动。

为了进一步测试RomR是否可以与MglA和MglB形成一个复杂的独立物，我们进行，在mglA或mglB的遗传背景中含有RomR-His6表达的可溶性提取物的亲和层析。

在每一种情况下（图4），RomR-His6再次与MglB和MglA共同纯化，这表明RomR在细胞两极与MglA和MglB形成独立的配合物。

4.5RomR作用于MglA下游和MglB上游来控制蠕动

接下来，我们测试了romR突变影响A-和S-蠕动。

我们首先在固体琼脂上分析了单一A-运动型细胞的行为，其中S-运动是低效的[30]。

在这个实验中，romR突变的细胞表现出严重的运动性缺陷，只表现出有限的来回运动（图5A和短片S1）。

这可以归因于在A-运动系统的运动独立性，因为它仍然是在romRpilA（S）突变体检测到，但完全没有从romRaglQA型蠕动电动机双突变体检测到（图5A和数据未示出）。

强的romR突变型A型运动性缺陷与来自Leonardy等人的结论是一致的[29]，在这种突变所观察到的MglA-YFP和AglZ-YFP的错误定位。

为了测试romR和mglB之间的上位性关系，我们比较了蠕动缺陷的romR突变体与mglB和romRmglB突变体。

据此前报道，mglB突变的细胞具有类似于野生型细胞移动的效率，但高度反转（图5A和短片S2）。

相比之下，romRmglB突变的细胞表现出严重运动减弱，与romR突变体表现的运动性相媲美（图5A和动态摄影S1和S3）。

因此，我们的结论是MglB下游RomR的行为控制A-蠕动。

要确定是否是mglA上游的romR的作用，我们也比较mglA、mglAmglB、romRmglA和romRmglBmglA突变体的表型活力。

所有菌株是区分完全非运动型和mglA突变株（及aglQ突变株），表明MglA来自RomR和MglB的下游作用（图5A和短片S4）。

由于MglA对S-蠕动也是重要的，romR突变预期也影响S-蠕动。

事实进一步证明，在romR突变体的细胞两极中一个重要的S-蠕动蛋白质，FrzS失败本地化（图3B和S5）。

S-运动性大细胞群，并涉及到运动被测试的软琼脂0.5％（W/W），基质A-运动是有效的[30]。

在该测定中，在野生型细胞中，S-蠕动产生的特征径向耀斑出现的菌落（图5B）。

此模式是不变在aglQ突变，软琼脂上确认还没有激活的A-蠕动（图5B）。

相反，romR的突变体显示出严重缺陷群图案（图5B）。

这种模式的结果，从一个真正的S-运动性缺陷，因为romRaglQ（A2）双突变体是有相似程度的缺陷（图5B）。

在这个高度定性分析，比较的romR与mglB和romRmglB突变体的突变体并没有显示信息，因为所有突变体类似的缺陷表型（图5B）。

然而，明显的互作关系，可确定与突变：

mglAmglA，mglAB，romRmglAromRmglAmglB突变体都完全S2，显示出MglA的作用，下游，从RomR和MglB控制S-运动（图5B）。

总体而言，这些数据有力地表明，RomR行为从MglB和上游从MglA到下游对照组，A-和S-运动性。

蠕动的结果是一致的定位结果与一个场景，其中RomR作为极性定位因子MglA，最下游的蠕动稳压器。

最后，蠕动表型之间的相关性和本地化缺陷建议，极性本地化MglA其功能是必不可少的。

4.6RomR调节FRZ下游MglA本地化

来自动态的发现，黏细胞极性之间的相互作用RomR，MglA和MglB，提出了一种可能性，RomR作用立即从FrzE组氨酸激酶的下游触发的极性开关。

一些证据表明，RomR是一个可能的FRZ输出稳压器。

首先，RomR是一个模块化的含有的N-末端的反应调节域（RR）和富含脯氨酸的C-末端结构域的蛋白质，[29]，因此是一个候选基板FrzE。

与此相一致，RomR极极开关受FrzE，这特别要求RomR的接收域[29]。

此外，保守的磷酸化Asp53残基已被取代的谷氨酸（预计模仿组成性激活状态的突变）的要求FrzE绕过触发逆转的一个RomRD53E的变体的表达[29]。

最后，有证据显示，FRZ信令仍然发送到MglA在没有MglB，FRZ-信号可直接输送到MglA（图6A，请参阅[16]）。

因此，可以想象的是，RomR是该分支的一部分将FrzE到MglA。

为了检验这种可能性，我们的理由是，一类增益为功能，FRZ的突变（frzCDc，[16]），frzCD受体基因的突变可能会恢复RomR和MglA极极的动态在缺席的MglB。

，FRZ上的突变被认为是激活FRZ途径组成[31,32]，从而可能过度激活的信号从FrzE来MglA通过RomR（图6A）。

，在一个mglB的突变体，都MglA-YFP和RomR的-MCH积累在细胞两极对称lated没有切换时，细胞的逆转（图6B中，S2和[16,17]）。

引人注目的是，RomR极极开关恢复成反比FRZmglB突变的细胞：

RomR从细胞极杆领先的细胞，而不是野生型细胞中落后电池电极切换到以落后电池电极（图6C和[29]）。

正如所预期的，如果RomR是主要的MglA的本地化因素，巧合的是恢复MglA-YFP极极开关FRZ上mglB细胞（图6D）。

30个细胞，每一株的交叉相关分析表明，一个0-1分钟的时间延迟值附近的显著的RXY成绩（.0.4）只获得RomRMCH和MglA的YFP在FRZmglB背景，确认RomRMCH和极性MglA-YFP荧光动力学与物理的逆转mglBFRZ突变的细胞，但不是在mglB突变的细胞（图6E，见方法）。

为了测试是否RomR的上游从MglA在这调控，我们构建了一个mglBromRFRZ应变。

突变细胞mglBromRFRZ显示romR状蠕动缺陷（图5A）。

因此，romR的基因突变是上位超过FRZ突变，建立，RomR行为下游的控制的MglA动态FRZ。

最后，研究结果表明，FRZ信号不需要MglB被运送到MglA的。

5讨论

5.1MglA定义了细胞主导极

MglA极性定位的作用是什么？

在所有测试romR中突变，严重的错误的MglA本地化与一个深刻的蠕动缺损反映极性MglA对激活A-和S-蠕动系统是必不可少。

这可能由于MglA以不同的方式调节A-和S-蠕动。

S-蠕动的的蛋白质，FrzS和的pilT，仍然定位于极在mglA突变体（这项工作[16,17,27,29]）。

重要的是，FrzS和MglB/RomR，通常给不同的两极，共同定位于mglA突变的细胞。

因此，MglA本身并不是一个S-蠕动蛋白极性的局部化因子，而是作为一个S-蠕动极性交换系统的功能。

相反，MglA为AglZ本地化（本工作和[27]）是绝对必需的。

因此，RomRMglA-AglZ的分支能够确定本地化的A-蠕动机械，，而MglB和FrzS可能是部分的A-（MglB）和S-蠕动（MglB和FrzS）极性开关途径。

在黏细菌中，MglA需要区分一个领先的细胞极，类似其他的Ras家族蛋白在chemotaxing真核细胞[33]中定义的领先优势。

Mg