副溶血性弧菌标准的检验方法.docx

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副溶血性弧菌标准的检验方法

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。

在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。

为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。

第一节副溶血性弧菌标准的检验方法

一、检验方法

（一）操作步骤

1.分离培养：

首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。

2.涂片镜检：

将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。

3.嗜盐性试验：

将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。

4.生化试验：

分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。

5.动物试验：

将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。

（二）检验程序

图6-1　副溶血性弧菌检验程序

二、结果分析判定及注意事项

（一）样品处理

采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。

对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。

样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。

（二）形态与染色

为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列，一般大小为0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。

（三）培养特性

在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长，在无盐的条件下不生长，在含2％~3％氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10％以上时不繁殖。

在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长，需氧性强，常在液体表面形成菌膜，在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。

在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。

在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些副溶血性弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长，在0.7％以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛）。

一般在20~25℃培养生长的周鞭毛较为稳定，而在37℃培养或24h以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株，在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。

培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对扩散生长有所影响，菌落形态也容易受条件的影响有所改变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落，不易挑起。

在血平反上生长快可出现溶血环，在BCBS（硫代硫酸盐，柠檬酸盐，胆盐，蔗糖）和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。

一般由腹泻病人初期分离者多为典型菌落，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙，形状不整齐或菌落出现解离，有的在液体培养时呈沉淀生长现象。

pH生长范围为5~10，最适pH为7.2~8.2，发育最适温度为30~37℃。

（四）生化特性

本菌对葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，产生靛基质，不产生硫化氢，甲基红阳性，V-P阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，主要生物化学性状见表6-1。

近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识，对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。

表6-1　副溶血性弧菌的主要生物化学性状

项　　目

项　　目

　耐盐性0％

　－

　甲基红

　＋

　　　7％

＋

v╟p

－

　　　10％

－

靛基质

＋

葡萄糖产酸

＋

赖氨酸

＋

葡萄糖产气

－

鸟氨酸

＋/－

蔗糖

－

精氨酸

－

甘露醇

＋

溶血性

＋/－

硫化氢

－

注：

＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性。

表6-2　副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别

菌名

氧化酶

葡萄糖产气

赖氨酸

精氨酸

鸟氨酸

靛基质

明胶液化

v！

p

乳糖

蔗糖

甘露醇

肌醇

阿拉伯糖

甘露糖

鼠李糖

β半乳糖苷

硝酸盐

泳动

盐胨水，％

0

6

8

10

副溶血性弧菌v.parahaemoly-ticus

＋

－

＋

－

＋

＋

＋

－

－

－

＋

－

d

＋

－

－

＋

d

－

＋

＋

－

溶藻弧菌v.alginolyicus

＋

－

＋

－

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

－

－

＋

－

－

＋

＋

－

＋

＋

d

o1霍乱弧菌v.choleraeo1

＋

－

＋

－

＋

＋

＋

d

（d）

＋

＋

－

－

＋

－

＋

＋

－

d

－

－

非o1霍乱弧菌v.choleraenono1

＋

－

＋

－

＋

＋

＋

d

（d）

＋

＋

－

－

d

－

＋

＋

d

＋

d

－

－

拟态弧菌v.mimicus

＋

－

＋

－

＋

＋

＋

－

（d）

－

＋

－

－

＋

－

＋

＋

－

＋

d

－

－

河弧菌v.fluialis

＋

d

－

＋

－

d

＋

－

－

＋

＋

－

＋

d

d

＋

＋

－

＋

＋

d

创伤弧菌v.ｖulnificus

＋

－

＋

－

＋

＋

＋

－

＋

d

d

－

－

＋

－

＋

＋

－

－

d

－

－

梅氏弧菌v.metschnikouii

－

－

d

＋

－

d

＋

＋

d

＋

＋

d

－

d

－

d

－

－

－

d

－

－

霍利斯弧菌v.hollisae

＋

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

－

＋

＋

－

－

＋

－

－

d

－

－

v.damsela

－

－

d

＋

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

＋

－

－

＋

－

－

d

－

－

注：

＋90％以上为阳性；－90％以上为阴性；（＋）迟缓阳性；d　11％~89％为阳性；（d）

11~89％迟缓阳性。

（五）溶血性试验

我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。

此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。

有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。

（六）动物试验

经上述检验的可疑菌株，用小鼠测定毒力，将16~18h的蛋白胨水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔0.3~0.5mL，有毒力者可在5~10h发病死亡，长者有24h左右发病死亡。

发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。

将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检出试验菌的纯培养。

对照动物观察2~3d无异常现象。

但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述毓的检验后，进行毒力证实，综合判定结果。

三、培养基

（一）氯化钠结晶紫增菌液

　　成分：

蛋白胨

20g

　　　　　氯化钠

40g

　　　　　0.01％结晶紫溶液

5mL

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH9.0

制法：

除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加3％氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH，加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管，121℃高压灭菌15min。

（二）氯化钠蔗糖琼脂

　　成分：

蛋白胨

10g

　　　　　牛肉膏

10g

　　　　　氯化钠

50g

　　　　　蔗糖

10g

　　　　　琼脂

18g

　　　　　0.2％溴麝香草酚蓝溶液

20mL

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH7.8

制法：

将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入指示剂，分装烧瓶100mL，121℃高压灭菌15min备用。

临用前在100mL培养基内加入蔗糖1g，加热溶化，冷至50℃倾注平板。

（三）嗜盐菌选择性培养基

　　成分：

蛋白胨

20g

　　　　　氯化钠

40g

　　　　　琼脂

17g

　　　　　0.01％结晶紫溶液

5mL

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH8.7

制法：

除结晶紫和琼脂外，其他按上述成分配好，校正pH，加入琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶100mL。

（四）3.5％氯化钠三糖铁琼脂

　　成分：

蛋白胨

20g

　　　　　牛肉膏

5g

　　　　　乳糖

10g

　　　　　蔗糖

10g

　　　　　葡萄糖

1g

　　　　　氯化钠

35g

　　　　　硫酸亚铁铵

0.2g

　　　　　硫代硫酸钠

0.2g

　　　　　琼脂

12g

　　　　　酚红

0.025g

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH7.4

制法：

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入0.2％酚红溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）

　　成分：

酵母膏

3g

　　　　　蛋白胨

10g

　　　　　氯化钠

70g

　　　　　磷酸氢二钠

5g

　　　　　甘露醇

10g

　　　　　结晶紫

0.001g

　　　　　琼脂

15g

　　　　　蒸馏水

1000mL

制法：

调pH8.0，加热30min（不必高压），待冷至45℃左右时，加入新鲜人或兔血（5％~10％），混合均匀，倾注平皿。

（六）嗜盐性试验培养基

　　成分：

蛋白胨

2g

　　　　　氯化钠

按不同量加入

　　　　　蒸馏水

100mL

　　　　　　　　　　　　　pH7.7

（七）3.5％氯化钠生化试验培养基

　　成分：

牛肉膏

5g

　　　　　蛋白胨

10g

　　　　　氯化钠

35g

　　　　　磷酸氢二钠

2g

　　　　　0.2％溴麝香草酚蓝溶液

12mL

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH7.7

制法：

将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，葡萄糖发酵管可按0.5％葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。

其他培养基可分装为每瓶100mL，121℃高压灭菌15min，另将各糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌后，取5mL糖液，加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

（八）葡萄糖食盐胨水（MR-VP试验用）

　　成分：

多胨

5g

　　　　　葡萄糖

5g

　　　　　磷酸氢二钾

5g

　　　　　氯化钠

30g

制法：

加入1000mL蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121℃高压灭菌15min。

（九）食盐胨水（靛基质试验用）

　　成分：

蛋白胨

20g

　　　　　氯化钠

30g

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH7.4

制法：

按上述分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。

（十）运动性试验培养基

　　成分：

牛肉膏

3g

　　　　　蛋白胨

10g

　　　　　氯化钠

30g

　　　　　琼脂

4g

制法：

将全部成分加入1000mL蒸馏水，加热溶解，分装试管，121℃15min高压灭菌，最终pH7.4。

第二节　副溶血性弧菌参考检验方法

一、日本食品微生物检验方法

（一）分离、菌数测定

图6-2　分离、菌数测定程序

（二）鉴定

将TCBS平板上生长典型或可疑的菌落挑取2个以上，接种以下培养基：

图6-3　鉴定程序

（三）检查用培养基

1.3％氯化钠蛋白胨稀释液：

蛋白胨10g、氯化钠30g溶于1000mL蒸馏水中，校正pH7.0，121℃15min高压灭菌。

2.TCBS

　　　成分：

酵母膏

5g

　　　　　蛋白胨

10g

　　　　　蔗糖

20g

　　　　　硫代硫酸钠

10g

　　　　　柠檬酸钠

10g

　　　　　牛胆酸钠

3g

　　　　　牛胆汁粉

5g

　　　　　氯化钠

10g

　　　　　柠檬酸铁

1g

　　　　　溴麝香草酚蓝（2％溶液）

20mL

　　　　　草酚蓝（1％溶液）

4mL

　　　　　琼脂

15g

　　　　　　　　　　　　　pH8.6

制法：

将上述成分加蒸馏水至1000mL，混合，使全部溶解，校正pH为8.6，加热煮沸，不需高压灭菌，倾注平皿15~20mL。

不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培养基上生长呈蓝绿色菌落，分解蔗糖的细菌呈黄色菌落。

3.我妻氏琼脂（改良）培养基

　　成分：

酵母膏

5g

　　　　　蛋白胨

10g

　　　　　氯化钠

70g

　　　　　甘露醇

5g

　　　　　结晶紫（0.1％酒精溶液）

1mL

　　　　　琼脂

15g

制法：

将全部成分溶于1000mL蒸馏水中，调正pH为7.5，至完全溶解后，加热煮沸数分钟，不需高压灭菌，冷却至50℃时，加入洗净的20％浓度的人红血球悬液100mL，混合均匀后倾注平皿。

红血球悬液的制备：

将人的脱纤维血液，离心沉淀的血球，用0.85％灭菌生理盐水洗3次，最后沉淀的红血球，用生理盐水制成1:

4的悬液。

4.亚硫酸铋肉汤

　　成分：

蛋白胨

10g

　　　　　氯化钠

25g

　　　　　氯化钾

0.7g

　　　　　氯化镁

5g

制法：

加蒸馏水950mL溶解，调pH为9.1，121℃高压灭菌15min，室温冷却，加亚硫酸铋溶液100mL及95％酒精1mL，混匀，无菌手续加入灭菌试管，每管100mL，不需加热。

亚硫酸铋溶液配制：

①热水100mL，加亚硫酸钠20g；②热水100mL加柠檬酸铋铵0.1g；③将①加②溶解甘露醇20g，煮沸1min，最终成白色混浊的混合物，使用前摇匀。

于冷库贮存，可使用1个月。

5.食盐碳水化合物肉汤基础液

　　成分：

蛋白胨

2g

　　　　　硫酸钠

2.5g

　　　　　氯化铵

5g

　　　　　磷酸二氢钠

0.5g

　　　　　磷酸氢二钠

1.5g

　　　　　0.2％溴麝香草酚蓝溶液

12mL

制法：

将全部成分溶于1000人工海水中，分装试管，每管5mL，121℃15min高压灭菌，冷却后分别加碳水化合物10％灭菌溶液0.5mL。

碳水化合物溶液需过滤或115℃10min高压灭菌。

人工海水的配制：

氯化钠23.4g，氯化钾0.66g，硫酸钠3.91g，重碳酸钠0.19g，氯化镁4.96g，将上述全部成分溶于1000mL蒸馏水。

6.Hugh-Leifson食盐培养基

　　成分：

蛋白胨

2g

　　　　　氯酸钠

30g

　　　　　磷酸氢二钾

0.3g

　　　　　葡萄糖

10g

　　　　　琼脂

4g

　　　　　0.2％溴麝香草酚蓝溶液

12mL

　　　　　蒸馏水

1000mL

　　　　　　　　　　　　　pH7.4

制法：

将上述成分溶解，调pH后加指示剂，分装试管，每管3mL，121℃高压灭菌15min。

试验方法：

穿刺接种两种，一管加矿物油覆盖表面，于35~37℃培养，两管同时变黄为葡萄糖发酵，只有不加矿物油的培养管变黄时为葡萄氧化。

二、耐热溶血毒检验方法

根据试验证明，神奈川现象阳性菌株，多数对人的致病性有密切关系，神奈川现象的阳性物质称“耐热性溶血素”，检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒，可参考下述方法：

（一）Sahuria（樱井氏）法

用副溶血性弧菌肉汤培养物上清液为抗原，与制备的精制耐热性溶血毒的抗血清进行琼脂扩散试验，观察沉淀线。

（二）Elek法（本田改良法）

以微研No.1琼脂（Difco胨30g，磷酸氢二钠30g，氯化钠40g，葡萄糖5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.3）培养37℃过夜，在平板上菌落旁约为5mm处放一小滤纸片（上吸有抗血清），室温放一夜，观察滤纸旁有无沉淀红。

（三）液体培养检验法（饭田民）

用2％氯化钠肉汤，加入少量新鲜红血球，倾斜培养，神奈川现象阳性菌株能引起溶血，而阴性菌株不溶血。

（四）反相被动血球凝集法（太田氏）

用吸附抗体的红血球测定抗原（溶血毒），此方法极为敏感，可查出微量耐热性溶血毒。

并发现神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。

三、至病性试验方法

（一）兔肠袢结扎试验

选用正常健康家兔，首选使家兔断食24h，用乙醚麻醉，将腹壁切口，露出小肠，选取肠段约5cm左右，于两端结扎，注入检菌的肉汤培养物，同时另选两段作阳性和阴性对照，然后迅速缝合，24h后由耳静脉注入空气杀死，开腹检查，有致病性者注菌肠段可见肿胀积液，出现坏死现象。

一般认为神奈川现象阳性菌株，兔肠袢结扎试验多数为阳性反应，神奈川现象阴性菌株多数为阴性，但亦有少数为阳性者。

（二）新生兔经口试验

选用1~2日龄的新生家兔，将检菌的培养物经口喂入1~2mL，有致病性者一般可在10~20h发病，初期症状蜷缩不动，随后呈极度疼痛状，翻滚嚎叫，呼吸急促，痉挛，多数在24h左右死亡，解剖可见内脏充血现象。

无毒株不发病，可对致病性副溶血性弧菌与非致病性溶藻弧菌进行鉴别。

四、血清学检验

进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3％食盐水作成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集试验，同时用无菌生理盐水作对照，如O凝集反应阳性时，可用不经加热的菌悬液进行Ｋ抗血清玻片凝集反应分型判定。

副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），Ｋ抗原（荚膜抗原）及Ｈ抗原（鞭毛抗原），日本泷川氏和坂崎氏，根据对本菌血清学特性的研究，经逐年的进展，将副溶血性弧菌分出11个O群，60个K型，63个血清型。

关于Ｈ抗原，因与其他弧菌有共同性，至今在血清型别的分类上没有利用。

副溶血性弧菌的抗原组合见表6-3。

表6-3　副溶血性弧菌的抗原组合

o群

k　　　　型

1

1，25，26，32，38，41，56，58a，64

2

3，28

3

4a，5，6，7，29，30a，31，33，37，43，45，48，54，57，58a，59

4

4a，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63

5

15，17，30a，47，60，61

6

18，46

7

19

8

20，21，22，39，62

9

23，44

10

19，24，53

11

36，40，50，51

总计11

60k型/63血清型