分子育种学课件分子标记和 与植物育种.pptx

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分子育种学分子标记与植物育种,遗传标记？

类型与特点？

建立？

应用？

本章主要内容,

（一）、遗传标记概述

（二）、分子标记的类型及其基本原理（三）、分子标记辅助选择（四）、分子标记在植物遗传育种中的应用（五）、存在问题,1、概念遗传标记是指受基因控制的能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特性，并可被用作遗传分析的某种特征。

理想的遗传标记应具备的条件：

多态性高、遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受环境影响、操作经济、简单等,

（一）、遗传标记概述,2、遗传标记的类型,根据建立标记的对象可分为：

形态学标记MorphologicalMarker细胞学标记CytologicalMarker生化标记BiochemicalMarkerDNA分子标记DNAMolecularMarker,*形态标记：

是生物特定的肉眼可见或简单工具可测量的外部形态特征。

影响这一特征的基因及其所在的染色体以及其相邻基因在图谱上的位置都已明确。

孟德尔首先将形态标记作为遗传标记-分离规律和独立分配规律；长期以来植物种质资源鉴定及育种材料选择一般都是根据形态标记进行的。

（1）形态标记,形态标记技术的评价,优点：

简单直观缺点：

数量少、多态性差易受环境条件因素影响显隐关系要通过自交或杂交来检出,细胞学标记：

以染色体结构和数目为基础的标记。

能够与特定的表型结合起来，从而确定控制某些性状的基因所在的染色体或染色体区段连锁遗传和染色体学说,

（2）细胞学标记,水稻IR36初级三体的形态特征（Khushetal.1984）,细胞学标记的核心技术是显微镜技术核型分析把体细胞内染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等将染色体作系统排列，显示染色体的特征染色体分带技术将所有染色体制片用不同手段处理，再用不同染料染色，染色体显示出不同的带数，如G带、C带、N带等，明确鉴定许多物种中任一染色体,普通小麦的N带与C带,玉米染色体荧光核型（9个探针）,小麦-中间偃麦草附加系,黄-A染色体；棕-B染色体红-D染色体；绿-偃染色体,评价：

克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培,养选择，从而限制了细胞学标记的应用。

有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难,生化标记：

建立在生化遗传学基础上的特异性同功酶或蛋白质。

其编码基因的位置及其与其它基因位点的连锁关系也是明确的。

蛋白质是由基因编码的，特定的基因型决定了蛋白质的特定组成，因此蛋白质组成能够反映出其特征或特性主要利用种子蛋白：

数量丰富、稳定、易于提取,（3）生化标记,1941年BeadleWG等提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。

50年代许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。

同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和化学染色剂的使用，使这种酶的多种形式成为肉眼可辩的带型酶谱。

1959年，Markert等提出了用同工酶（isozyme）一词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，并证实同工酶具有组织、发育及物种的特异性。

20世纪60-70年代出现了在蛋白质水平反映生物遗传变异的同工酶标记。

生化标记的发展,水稻的部分同工酶标记,以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映共显性，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性，因此生化标记是一种较好的遗传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。

但仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；局限于反映基因组编码区的表达信息等。

最关键的不足是其标记数量还比较有限不能成为理想的遗传标记,生化标记的评价,DNA分子标记：

根据遗传物质DNA本身的变异而建立的标记。

确定DNA多态性与特定性状或DNA片段的关系。

1980年Botstein等首次提出了DNA限制片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）的概念，并指出RFLP可作为遗传标记，从此开创了利用DNA多态性进行分子标记的新阶段。

1985年Mullis发明了PCR（DNA聚合酶链式反应）技术，推动产生了许多以PCR为基础新型的分子标记随着DNA研究技术的不断发展，分子标记的类型越来越丰富，已广泛用于很多研究领域。

（4）DNA分子标记,DNA分子标记的特点直接对DNA进行标记，在植物体的各种组织、器官，不同发育时期均可检测到，不受环境、季节的限制，不存在表达与否的问题类型丰富，数量多，遍及整个基因组多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要创造特殊的材料许多类型的分子标记表现位共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁关系可对控制任何目标性状的基因进行标记理想的遗传标记,分子标记的多态性,共显性标记（Co-dominantmarker）杂合体显示双亲的带型,显性标记（Dominantmarker）杂合体显示双亲之一的带型,FM,FFHHHHHFMMMMM,FM,F/H,DNA分子标记的显性与共显性,

（二）、分子标记类型及其基本原理,1、分子标记的类型按核心技术分以分子杂交为基础的的标记以PCR为基础的标记其它类型的分子标记（PCR和分子杂交结合、测序）按建立标记的DNA序列来源分以基因组DNA为基础的标记以EST为基础的标记,2、常用分子标记技术简介,1）限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）原理：

生物体在长期的自然选择和进化过程中，由于个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或重排，会造成DNA在核苷酸序列上出现差异，从而导致限制性内切酶识别位点的不同，当用限制性内切酶来消化不同材料的DNA时，会产生数目和大小不同的DNA片段，电泳后经转膜和与探针杂交，就可以得到DNA限制性片段长度多态性。

1980年Botstein等首次提出,RFLP技术流,探针,RFLP产生的原因多态性基础,A）点突变,RFLP产生的原因多态性基础,B）缺失,RFLP产生的原因多态性基础,C）插入,RFLP图例,RFLP标记的优点具有共显性特点，可以区别基因型纯合与杂合，能提供单个位点上较完整的资料；标记无表型效应，不受环境和发育条件影响；在非等位RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰；标记源于基因组DNA的自然变异，数量上几乎不受限制缺陷：

RFLP标记对DNA需要量较大，操作繁琐，花费昂贵其应用受到一定程度的限制；（早期）主要用于遗传连锁图的绘制和目标基因的标记,2）DNA指纹（DNAFingerprinting，DF）实际上是RFLP的一种特殊类型。

其基本原理与RFLP是一致的，不同的是所用的探针，RFLP所用的探针是单拷贝或低拷贝，而DF所用的探针是多拷贝或高拷贝的小卫星、微卫星或人工合成的简单重复序列。

3）随机扩增多态性DNA（RandomAmplified,PolymorphismDNA，RAPD；RP-PCR；AP-PCR）1990年Williams和Welsh原理：

以一个人工合成的随随机的寡核苷酸序列（通常为10个碱基）作引物，以基因组总DNA为模板，利用PCR技术随机扩增基因组DNA的不同位点，再经凝胶电泳分开，得到一系列多态性DNA片段。

RAPD中多态性产生的基础片段数量、大小和有无核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配某个引物结合位点缺失两引物结合位点间的间距过大，因片段太长致使扩增中断（3kb）插入或缺失改变了扩增产物的大小,RAPD中多态性产生,RAPD标记的优、缺点,无需知道有关模板DNA的结构信息；引物没有种属特异性模板DNA用量少，纯度要求不高操作简便快速，可实现自动化操作RAPD标记是显性标记，不能区分纯合型和杂合型扩增产物易受反应条件影响，实验结果重复性较差。

“匿名”及共迁移（同带-同片段？

1带-1片段？

）,4）扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）http:

/,Zabean等于1992年发明的一项专利技术原理：

基因组DNA经2个限制性内切酶酶切后，与特定接头相连接，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测扩增片段的多态性。

由于不同材料的DNA片段存在差异，因而便产生了扩增产物的多态性。

实际上它是RFLP与PCR结合的一种中间产物。

AFLP技术流程,a）酶切和接头连接,双链接头由核心序列和酶切特异性序列组成，通过互补的碱基与酶切序列连接（阻止第2次酶切的发生）,核心序列,酶切特异性序列,核心序列,b）预扩增,所用引物由对酶切序列特异性的核心序列和3端选择性单碱基组成，接头序列和酶切位点作为预扩增的结合位点,c）选择性扩增,选择扩增的引物是在预扩增引物的基础上增加2个碱基（16种组合），用同位素或其它方法标记,d）扩增产物的检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测放射性同位素标记引物荧光标记引物银染技术检测片段数酶切片段数,AFLP的优点AFLP结合了RFLP和RAPD的优点，稳定可靠，重复性好，灵敏度高，快速高效不需要分子杂交，不需要预先知道DNA的序列信息部分为共显性标记，显示的多态性信息量也很高。

标记非常丰富，在多态性低、待测样品也较少的情况下用AFLP能达满意的结果AFLP标记的缺点是一种专利技术，受专利权保护对DNA纯度和内切酶的质量要求较高需标记引物或采用银染技术，昂贵费时，操作难度大,5）微卫星DNA,真核基因组中存在着大量的串联重复序列,按重复单位的大小,串联重复可分为卫星（重复序列70bp）、小卫星（670bp）和微卫星DNA（1-6bp）。

微卫星（Microsatellite,MS）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为24个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（SimpleSequenceRepeats,SSR）或短串联重复（ShortTandemRepeats,STR）、或简单序列长度多态性（SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSLP）重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR扩增，就可以检测到不同的DNA区域重复数目的多态性。

SSR的多态性基础,SSR（数目变异）,旁邻或侧翼序列（具有保守性引物设计）,SSR的类型,根据重复结构完全重复型（perfect）,单一序列单元无中断或无颠倒不完全重复型（imperfect）,单一序列单元有中断或有颠倒；混合型（compound），不同序列混合、中断根据来源的序列gSSR：

来源于基因组序列EST-SSR：

来源于EST（表达序列标签）,aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctggggagggggtagcggcagcgctagtgaaagagaagaagaagaaggaggaggaggaggaggaggaagaggaggaagggaggcagaaggagcagatgaaagaagagaatatgaatatggatgtggatgtggtcatggaagaaggggacgacgacaacaagaagaacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacggggatgtaacaagtccgccgccggcggctgaggatgagaccaaggatggtggaaaggctaaagg-