常用色谱和光谱分析方法和技术.docx
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常用色谱和光谱分析方法和技术
常用色谱和光谱分析方法和技术
色谱分析、光谱分析以及两谱联用技术,构成了药物分析学科领域中最主要和最基本的研究手段和方法,应用日趋广泛,发展十分迅速,新颖方法层出不穷。
新近常用的色谱分析方法:
一、胶囊色谱(MicellarChromatography,MC)又称拟相液相色谱或假相液相色谱(PseudophaseLC),是一种新型的液相色谱技术。
特点是应用含有高于临界胶囊(或称胶束,微胞等)浓度的表面活性剂溶液作为流动相。
所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(CriticalMicelleConcentration,CMC)时形成的分子聚合体。
通常每只胶囊由n个(一般为25~160个)表面活性剂单体分子组成,其形状为球形或椭圆球形。
在CMC值以上的一个较大浓度范围内,胶囊溶液的某些物理性质(如表面张力、电导等等)以及胶囊本身的大小是不变的。
构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。
通常有正相与反相两种胶囊溶液。
前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊;后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。
被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同,并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。
改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。
胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。
适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析,是一种安全、无毒、经济的优越技术。
(一)原理:
胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenoussystem)。
在胶囊色谱中,分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。
组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用;同时定量地指出分离组分的容量因子k'的倒数值与胶囊浓度成正比,一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。
(二)方法特点:
与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系,而常规流动相是一种均相体系。
特点:
1、高度的选择性:
因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用,只要通过流动相中胶囊浓度的改变,就可使分离选择性获得改善和提高。
此外,通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。
2、便于梯度洗脱:
由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时,溶液中仅胶囊的浓度发生改变,而表面活性剂单体分子的浓度不变,不影响流动相与固定相的平衡过程,因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间,并减少了流动相的消耗,适用于常规。
3、提高检测灵敏度:
胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度,从而提高检测灵敏度。
还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。
4、因分离组分不易分出,故缺点是柱效低且不适于制备分离。
(三)常用表面活性剂:
常用的阳离子表面活性剂主要有:
溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyltrimethylammoniumbromideorchloride,CTMAD或CTMAC);阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS);非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。
二、手性分离色谱(ChiralSeparationChromatography,CSC)
是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。
由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异,有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。
(一)原理和方法:
对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外,其理化性质是完全相同的,因而难以分离。
传统方法(分步结晶法、酶消化法等)有很大局限性,特别是难以进行微量分离和测定。
60年代前后,TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。
但这两种方法只能拆分不多的化合物,且需要较复杂的样品处理步骤,制备分离也难以进行。
80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。
HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径:
间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
间接方法主要基于外消旋体混合物经柱前衍生化形成一对非对映异构体(Diastereoisomers)。
此法又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。
由于d-型和l-型对映体的物理性质完全相同,只能在手性固定相上才能获得拆分;如果利用对映体分子中的反应基团与某一光学纯试剂反应形成了非对映光学异构体混合物,其物理性质就有较大的差异,因而可在普通固定相(非手性固定相)上实现分离。
本法需高光学纯度的手性衍生化试剂(ChiralDerivatizationReagent,CDR),衍生化反应往往比较繁琐费时;各对映体衍生化反应的速率有时也不相同。
由于可采用价格便宜、柱效较高的非手性柱和通过适当的衍生化反应可提高检测的灵敏度,以及衍生化过程中可伴随样品的纯化等优点,柱前手性衍生化的方法仍然是当前手性药物拆分、尤其是生物样品中药物对映体分离和测定的常用方法。
直接方法主要采用手性流动相添加剂(ChiralMobilePhaseAdditives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。
CMPA法又可称为手性流动相(CMP)拆分法或手性洗脱法。
它不必事先将样品制备成衍生物,而只须将手性剂加入流动相中。
手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法所形成的衍生物那样牢固,但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构体性质却基本相同。
常用的CMPA有:
环糊精(Cyclodextrins)类(主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物);手性离子对配合剂(ChiralIonPairComplex,CIPC),如(+)-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等;以及配位体交换型手性流动相添加剂(ChiralLigand-exchangeComplexes,CLEC),其中手性配位体多为光活性氨基酸或其衍生物,再与二价金属离子形成螯合的配位化合物,以适当的浓度分布于流动相中,遇有药物消旋体时即可形成相应的非对映体配位化合物对,然后在正相柱或反相柱上完成拆分。
近年来CSP法发展迅猛,应用日益广泛。
它是不经转变成非对映体而直接拆分的方法,优点是:
适用于不含活泼反应基团的化合物;除非必须衍生化,否则无需高光学纯度试剂;样品处理步骤简单。
但迄今为止,CSP柱商品已有40多种,价格大多昂贵,尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。
根据分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。
常用的CSP有:
手性电荷迁移配位体固定相,如Pirkle型HPLC-CSP;蛋白亲和配体固定相,如Enantiopac(LKB);内部配位化合固定相,如环糊精(Cydobond)和纤维素酯(Chiracel)等;以及配基交换固定相,如L-脯氨酸-Cu2+共价键合于聚苯乙烯等基质上。
CSP拆分对映体的理论概念:
在HPLC的CSP柱上拆分对映体是利用药物对映体和特制的、在硅胶上键合的对映体固定相(CSP)之间所形成的非对映体复合物。
由于非对映体复合物稳定性差异,可使两个对映体的保留时间不一致,与CSP形成稳定性较差的非对映体的药物对映体可先洗脱,因之实现了拆分。
CSP设计是基于Dalgliesh在1952年提出的“三点手性识别模式”(Three-pointchiralrecognitionmodel),认为要实现手性识别,在手性化合物分子与CSP之间至少同时要有三个相互作用部位,其中之一必受空间影响,或是相互吸引或是相互排斥。
生成的非对映体的相对强度,决定了两个对映体的分离度和洗脱次序。
(二)三类手性分离方法的比较:
CDR法的优点是应用条件相对简易,只需采用普通HPLC的固定相和流动相即可而且通过衍生化有利于增加检测(紫外或荧光)灵敏度;缺点是样品中相关化合物须预先分离、衍生化手性试剂的光学纯度的高要求以及异体对的衍生化反应速率不一。
CMPA法的优点是不必作柱前手性衍生化;对固定相也无特殊要求;样品的非对映异构化络合具有可逆性而且利于制备。
主要缺点是可拆分的化合物范围有限;某些添加剂不够稳定而且往往会干扰检测。
CSP法的优点较多,能广泛适用于各类化合物,适于常规及生物样品的分析测定,制备分离方便,定量分析的可靠性较高,采用此法研究考察的化合物已达数千种之多。
缺点是样品有时也须作柱前衍生(但不一定是手性衍生化试剂),对样品结构有一定限制,其适用性尚不及普通HPLC固定相(包括正相和反相)那样广泛。
三、离子色谱(IonChromatography,IC)
是由经典的离子交换色谱发展开创而成的新的液相色谱分析技术,具有快速、灵敏、选择性好、且可同时测定多组分的优点;还能测定无机的或亲水性的有机阴离子。
IC已广泛用于其他多个领域,但在医药研究中的应用尚处起始阶段。
它不仅可用于药品的常规质量同时分析,也可有效地用于生产过程的质量控制和体内药物分析,具有美好的应用前景。
(二)类型特点与原理:
阳离子交换柱用于分离样品阳离子;阴离子交换柱用作分离样品阴离子。
洗脱液为含有阳离子和阴离子的一种稀溶液,经泵输送入色谱柱后,其阳离子或阴离子最终将色谱柱中所有可交换的离子置换出来,同时由检测器转换为恒定的信号——基线。
然后,进样少量样品,样品离子即被树脂柱所接受,并与等同数量的洗脱液离子交换。
如果样品中所有离子的浓度大于洗脱液的离子浓度,那么在柱顶端的总离子浓度就将增加,这就产生了一个脉动,当它沿着柱移动并通过电导检测器时即得到一个正峰;反之,则获得负峰。
进样后,洗脱液离子继续不断地经泵输入色谱柱,对树脂的可交换部位与样品离子进行竞争,并且使样品离子沿着柱子移动。
由于样品离子对交换树脂有不同的亲和能力,因而不同的样品离子沿柱以不同的速度移动,最后完成了分离。
现代离子色谱的过程有所不同,主要有以下两种:
1、抑制型离子色谱法(SuppressedIC):
由于离子交换分离的洗脱液几乎都是强电解质,其电导一般要较待测离子高二个数量级,簇会完全覆盖了待测离子的信号。
为提高检测灵敏度,采用在分离柱后串联抑制柱的办法,可使洗脱液转变成低电导组分,以降低来自洗脱液的背景电导。
另外可将样品离子转变成相应的酸或碱,以增加其电导。
抑制装置有柱型和离子交换膜管型两种。
抑制柱内填充与分离柱填料相反电荷的离子交换树脂。
当分析阴离子时,要用苯乙烯系列的强酸型(H+)树脂装柱;而分析阳离子时,则用苯乙烯系列的强碱型(OH-)树脂装柱。
抑制柱须定期再生。
离子交换膜管型抑制系统可解决色谱上出现的水和碳酸离子的负峰。
这是一种表面经磺化处理的聚苯乙烯多孔纤维管,管内流过流动相,管外流过再生抑制液,借助于离子交换作用来消除背景离子。
分析阴离子时,Na+穿出纤维管壁进入抑制液(H2SO4)中,与硫酸反应生成硫酸钠而被除去;同时,H+穿入管壁,与流动相的Na2CO3反应生成H2CO3。
若流动相为NaOH时,则生成水。
但是,CO32-和SO42-不能穿过管壁,而阳离子却可穿过。
在实际应用中,环境温度超过40℃时,H2SO4有可能将管膜破坏。
为此有人改用十二烷基苯磺酸(DodecylBenzeneSulfonicAcid,DBS)作再生抑制液来取代硫酸液。
DBS则较为安全,而且这种抑制液能使HCO3-减少而使负峰变得更小,并且通常都出现于同一位置,使色谱的重现性提高,保留时间不变;但会出现F-峰的峰高变低和峰宽增加的问题。
有人在膜管内装填苯乙烯和二乙烯苯的共聚物小球,因而提高了交换效率和色谱峰的锐度,这种改良后的装置称为组合型多孔纤维管抑制器,可使负峰现象大大改善,其效果最好。
对于阳离子来说,分离柱装有阳离子交换填料,抑制单元则为羟基阴离子交换剂,洗脱液中典型的是H+或苯二铵[Ph(NH3)22+],通过抑制单元后分别转变为H2O或Ph(NH2)。
抑制型离子色谱柱因价格昂贵,使用也较复杂,限制了该装置和操作的进一步发展。
2、单柱离子色谱法(SingleColumnIC,SCIC):
是一种不用抑制柱,直接用电导等检测器测定阴离子和阳离子的液相色谱法。
特点是:
采用足够低交换容量的分离柱,以及很稀浓度的洗脱液。
进行阴离子分析时,树脂的交换容量为0.005~0.10Meq/g,典型的洗脱液是1.0×10-4~4.0×10-4mol/L的苯甲酸、羟基苯甲酸或邻苯二甲酸的钠盐或钾盐,这些洗脱液都足够稀,从而使背景电导率相当低;大部分样品阴离子的当量电导比洗脱液阴离子要高,因此,样品浓度即使低至ppm级也能测得。
采用羧酸页不是它的盐作为洗脱液时,对大部分离子的检测限可以扩大10倍。
进行阳离子分析时,采用低容量的阳离子交换柱,它能与电导检测器或者其它类型的检测器相连,一价阳离子的分离系数用稀硝酸溶液作为洗脱液和电导检测器,而分离二价阳离子时则用乙二胺盐溶液。
二价过度金属阳离子可以用弱的络合试剂,如乙二胺酒石酸盐进行分离。
在强络合离子(Fe3+和Al3+)的样品溶液中加入络合试剂(如EDTA或磺基水扬酸盐)能获得更好的先择性。
由于各种碱金属离子的当量电导均比洗脱液中的H+的当量电导小,H+的极限当量电导为350μS/当量,而Li+、Na+、K+分别为39、50、74。
同样,二价阳离子和过渡金属离子也较乙二胺盐阳离子的当量电导小,因此样品峰相对于洗脱液的背景电导要小而呈负峰。
由于两者之间当量电导的差异是很大的,因此检测灵敏度很好,特别是用酸作为洗脱液时更是如此。
(三)离子色谱中最常用的检测器:
IC中使用的检测器有:
电导检测器、分光光度检测器、荧光检测器、折光率检测器、电化学检测器以及原子吸收或发射光谱检测器。
1、电导检测器:
是IC中使用最广泛的检测器。
其作用原理是用两个相对电极测量水溶液中离子型溶质的电导,由电导的变化测定洗脱液中被分离组分的浓度。
此检测器的死体积小,若采用抑制电导法,IC体系通常可获得极低的背景电导,适于使用二极式电导检测器,其敏感度可达10-9g/l,线性动态范围达104;用SCIC体系时,洗脱液的背景电导常高达50μs/cm以上,极化效应严重,必须用五极式电导检测器或精心设计的二电极式电导检测器,其敏感度达10-9g/l,线性动态范围为103。
由于电导率大小与离子运动速度有关,温度升高将减少液体的粘度,从而加速了离子的运动,这样就会使电导率增加。
通常,温度每升高一度,电导率将增加22.5%,因此需采用绝热恒重措施,以提高仪器对环境温度变化的适应性。
2、紫外-可见分光光度检测器:
应用越来越受重视,特点:
(1)选择性好;
(2)通用性好;(3)敏感度好,市售检测器的噪声水平可低至210-6吸光度单位,其敏感度达10-10g/ml,因之很易进行ppb级浓度的离子分析;(4)线性动态范围达105;(5)与电导检测器相比,受温度影响较小等。
四、高分辨气相色谱(HighResolutionGasChromatography,HRGC)简述
HRGC在分离分析复杂有机化合物、天然产物、医药、环保等方面具有显著效果和特殊意义。
与传统GC柱的主要差别在于HRGC柱是不装填充剂的空心柱,固定液相是涂渍或固定在柱管内壁上的。
这种空心柱的渗透性很高,固定液量很少,这就使HRGC具有三大特点:
分离效率高,一根20mm的色谱柱,总理论塔板数可达5万以上;分析时间短,与填充柱相比,可缩短若干倍;薄而均匀的固定液液膜,使柱流失的绝对量减少,因而信噪比得以提高。
(一)HRGC的色谱柱:
最初使用的材料是不锈钢,操作方便,比较结实耐用,但对不少极性样品会有吸附并发生分解,成本也高,因而限制了它的应用范围。
用玻璃作柱材料的螺旋形开管柱,可弥补不锈钢的一些不足,但易于破碎。
熔融石英开管柱(FusedSilicaOpenTubularColumn,FSOT柱)对若干极性大、分子量也较大的药物也可不经衍生化而直接就能进行分离。
开管柱(Opentubularcolumn,Golay柱,空心柱)因柱管内径在0.2~0.8mm间,也称毛细管柱(Capillarycolumn),但此名称不正确,因开管柱的主要特点不只是内径小,而是由于柱开口(即中空),因此通气性佳,无涡流扩散,可使用长柱,因而分离效率高,可称之为“高分辨”。
此外,还有填充毛细管柱(Packedcapillarycolumn)和微填充柱(Micropackedcolumn)它们的柱管内径也很小,严格讲,HRGC是指使用开管柱(包括涂壁开管柱和涂担体开管柱)的气相色谱法。
常用的开管柱类型有:
涂壁开管柱(Wall-coatedopentubularcolumn,WCOT柱):
内径为0.05mm~0.53mm,内壁涂布固定相(SE30、OV-1、OV-225、Carbowax20M等),相膜厚0.1μm~8.0μm。
缺点是柱容量低,不适于在室温下分析分子量很低的成分和永久气体。
涂担体开管柱(Support-coatedopentubularcolumn,SCOT):
内装10-3~10-4mm的固体担体,厚度一般为0.1mm,样品处理量大。
多孔层开管柱(Porous-layeropentubularcolumn,PLOT柱):
似SCOT,但常分两步制备,先是多孔层的沉积,然后再涂布固定相,多孔层常由重的晶性沉积或玻璃粉熔结而成。
与SCOT相同,PLOT柱容量大而柱效较低。
固定化相开管柱(Immoblilizedphaseopentubularcolumn,IPOT柱):
也称为不能提取相开管柱(Nonextractablephaseopentubularcolumn,NPOT柱):
是在WCOT柱涂布后,将固定相进一步用横向交联或键合的办法,使之固化,形成更大、更稳定的大分子薄膜。
此种柱可分为两大类:
交联柱(crosslinkingcolumn)是在固定液相分子间进行共价连结;键合相柱(bondingphasecolumn)是固定液相与支持物的表面连结。
这两种开管柱比WCOT柱的优越之处在于:
产生了稳定的涂层;得到了不可提取的涂层;使用温度往往要比未固化相柱的柱温上限约高30℃也可用作超临界流体色谱法或液相色谱法的固定相。
(二)开管柱的进样方式:
由于柱系统特性不同(如内径、膜厚、样品容量、载气种类和线速度等)以及样品性质的差异(如组分的浓度范围、温度范围和稳定性等),需采用不同的进样方式和方法:
1、分流进样(Splitinjection):
受柱容量限制,在分析很纯或浓度很高的样品时,对WCOT柱就须分流进样,即样品进入汽化室后被汽化样品按一定比例分成两部分,大部分放空,仅小部分进入色谱柱。
入口分流器为最常用,优点是使用方便;缺点是不适于痕量分析和宽沸程样品。
2、无分流进样(Splitlessinjection):
有两种形式:
一种是直接无分流,全部样品在最短时间内完全汽化均匀混合后直接进入色谱柱。
进样量能达1μl。
迄今这种进样器为宽孔柱(内径0.33mm,膜厚0.5μm)和SCOT柱所广泛使用。
另一种是Grob型分流(溶剂效应),注入的样品在汽化室中汽化,但在开管柱入口端再度冷却,以液体捕集,并保持冷却;然后快速加热色谱柱进行“再进样”。
此法的优点是特别适用于痕量分析,对宽沸程样品也能获得满意结果。
缺点是操作较难,必须利用溶剂效应或冷阱;溶剂的选择和起始柱温的限制;以及洗脱时间很严格、不能定量回收等等。
3、柱头进样(On-columninjection):
这是一种针对分流和无分流进样的缺点而设计的正在发展的进样方法。
特点是:
(1)必须使用外径为0.17~0.23mm的细针,而开管柱内径又必须是大约0.32mm的;
(2)不能通过隔垫进样;(3)要缓慢进样,以免倒流;(4)对热敏感,稀的和宽沸程的样品比较理想;(5)能给出定量结果。
主要缺点是:
样品中非挥发性物质在柱中积累,导致柱性变惰和柱效损失,为此,样品应经过仔细的预处理才可直接注入柱中,否则将缩短柱的寿命。
(三)开管柱的选择和性能评价:
若供试品在填充柱上,经反复试验,对其组分的分辨率仍感不满意时;或要想使分析更加快速;或者,需要较好的色谱柱以克服样品峰的严重拖尾时;均可考虑选用开管柱进行分析。
若缺少参考资料,可首先考虑样品组分的沸点和极性。
一般,相差2℃或2℃以上的组分,采用非极性开管柱分离是合适的;若沸点相差在2℃以内,则需在极性较大的开管柱上进行分离为好。
开管柱一般为柱长25m、内径0.25mm、膜厚0.25~0.4μm;但对低挥发性样品,则宜使用10m左右柱长、膜厚不大于0.2μm的开管柱为好。
开管柱性能评价指标有:
理论塔板数,容量因子,柱效率,涂渍情况,混合物的峰形以及峰的对称因子的大小等等。
还可采用Grob标准试验混合物来进行综合性的进样考察。
五、多维气相色谱(MultidimensionalGC,MDGC):
是用两根或更多的柱连接起来,以达到单柱不可能达到的分离分析结果。
最简单的MDGC是2DGC,先将样品注入预柱(填充柱或开管柱),进行第一次分离。
用中心切割(heartcut)选择所需的流分,使之进入分析柱通常用FOST柱进行第二次发离。
两根柱可以在同一柱箱内或不同柱箱;切割用阀进行。
所用预柱有:
1、高分辨柱:
用于分离复杂混合物成为窄切割带,然后再由分析柱进一步分离;
2、高容量柱:
用于分离溶剂、主成分、衍生化试剂,以保护分析柱和检测器。
3、样品预柱:
用于除去样品中不需要的物质,只切割待分析组分进入分析柱。
4、浓集柱:
用以从稀浓度的样品中进行样品富集。
MDGC并不是一种新技术,近年来得到发展的原因是:
1、采用了FSOT柱,不仅高效、惰性,而且操作方便;
2、采用大口径、厚涂层的FSOT柱,样品载量大,可取代填充柱作预柱,而且惰性、分辨率较高,易于使用,而填充柱一般对痕量组分来说,活性太高。
3、有关硬件(如微量阀、低死体积柱切换装置)已经商品化。
六、常用的药物色谱分离的优化方法:
(一)色谱响应函数(ChromatographicResponseFunction,CRF):
尽管CRF还不能帖切地全面地反映出实际效能,但作为一个色谱系统效能的尺度和寻求理想指标的起点,为色谱分离质量提供初步的数值性的描述,值得探讨。
CRF最初是作为两相邻色谱峰的分离参数的函数:
其中,ρi是k对色谱峰中(k为峰总数减1)相邻峰间分离的尺度。
后来扩展到实际分离参数(ρι)和理论分离参数(ρ0)之间的比较以及实际分析时间(TL)和可接受的分析时间(TM)之间的比较:
式中,α为加权因子。
有了CRF值,即可通过调节一组实验因子(如柱温、流速等)达到最好的响应。
(二)色谱优化函数(ChromatographicOptimizationFunction,COF):
主要是CRF方程进行了改进,首先用峰的分辨率R(Resolution)代替峰分离参数(ρ),因为在色谱测量中两者相比更习惯于采用分辨率,而且当峰的分离参数ρ<0.75时,往往不太正常,这对非常难以分离的峰的优化是不利的。
COF的定义如下:
式中,Ri是第i对峰的分辨率,Rid是第i对峰的理想分辨率,Ai和B都是加权因子。
当所有Ai和Rid都相同时,COF非常相似于CRF。
但对于色谱峰的重叠或出峰次序因条件改变而倒置时,上述两种优化指标就不能适用。
有待继续索。
(三)单纯形法(SimplexMethods):
这是色谱分析最优化中常用的一种方法。
就是在一定
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