呋喃丹对淡水鲶鱼Clarias gariepinus乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验.docx
- 文档编号:30062167
- 上传时间:2023-08-04
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:108.42KB
呋喃丹对淡水鲶鱼Clarias gariepinus乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验.docx
《呋喃丹对淡水鲶鱼Clarias gariepinus乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《呋喃丹对淡水鲶鱼Clarias gariepinus乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
呋喃丹对淡水鲶鱼Clariasgariepinus乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验
附录2:
英文文献中文译文
呋喃丹对淡水鲶鱼(Clariasgariepinus)乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验
RjendraK.Singh,B.Sharma
摘要
乙酰胆碱酯酶(ACHE)活性的抑制,作为生物标志物已被广泛用于农药对动物的影响中。
但是,广泛使用的有机氨基甲酸酯类杀虫剂,呋喃丹,对水生生物的神经系统的相互作用,还没有适当的研究。
乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的催化水解,神经肌肉接头的神经递质来说是一个关键酶,从而来调节神经传递系统。
在本研究中,我们从胡子鲶(C.batrachus),淡水硬骨鱼中取出不同的组织,在体内暴露96小时和15天后,评估了呋喃丹亚急性浓度(0.01和0.02mg/L时即二十分之一和十分之一的半致死浓度)对乙酰胆碱酯酶活性的影响。
在浓度和暴露时间一定下,呋喃丹显著降低了胡子鲶(C.batrachus)的不同组织中乙酰胆碱酯酶的活性。
在较长(15天)的治疗期间后,用较高的呋喃丹浓度(0.02mg/L),可使鱼组织内乙酰胆碱酯酶活性得到最大的抑制。
乙酰胆碱酯酶活性的抑制在所有鱼类组织实验中均依赖于农药浓度和治疗的持续时间。
来自胡子鲶(C.batrachus)组织的乙酰胆碱酯酶是一种真正的胆碱酯酶,因为在毒扁豆碱低浓度(nM)的体外实验中它被完全的抑制住。
结果发现,浓度非常低的呋喃丹对鱼组织内的乙酰胆碱酯酶可产生显著的抑制作用。
关键词:
呋喃丹;胡子鲶;毒性;乙酰胆碱酯酶;抑制
1.引言
在大多数发展中国家,由于氨基甲酸酯化合物在农业上广泛又随意的应用,是主要的环境问题和公共健康的问题所在。
进入水体内的农药来自于农业用水径流,还可通过卫生工作者直接申请。
氨基甲酸酯类对昆虫,寄生虫,哺乳动物和水生有机体[1-4]的毒性是基于对乙酰胆碱酯酶的抑制,这种酶将乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸,胆碱酯酶得到氨甲酰成为有机氨基甲酸酯化合物继而灭活。
这导致副交感神经突触(毒蕈碱样动作)和运动终板(烟碱样行动)中乙酰胆碱的累积。
此外,它所引起的中枢神经系统的症状与受到有机磷农药的症状相似[5]。
由氨基甲酸酯引起的胆碱酯酶的抑制是不稳定,可逆的,而且持续时间较短,这点在哺乳动物中已经描述[6]。
其中的氨基甲酸盐,呋喃丹(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯丙呋喃基-N-氨基甲酸甲酯)已被证明是导致成为超胆碱活性极强毒性的原因,这是因为它抑制了大脑和神经肌肉接头突触中央及周边源头[7-8]中的乙酰胆碱酯酶[9]。
在亚急性浓度中活性已显著减少。
用水生生物和敏感的参数来检测水库中的农药,这使乙酰胆碱酯酶的活性成为一个潜在的毒性生化指标。
氨基甲酸酯对一些生命系统中神经系统的影响已大致描述了[10]。
乙酰胆碱酯酶的活性已被识别出来,且其在水生生物体的生化特征也表示出来了。
但并没有太多关注于呋喃丹对硬骨鱼胡子鲶(C.batrachus)重要器官中乙酰胆碱酯酶活性影响的研究。
鉴于这些事实,我们试图系统的评价呋喃丹在相对低浓度(0.1倍和0.2倍的胡子鲶(C.batrachus)半致死浓度)的化合物中对胡子鲶(C.batrachus)的影响。
结果表明,低浓度的毒扁豆碱可抑制胡子鲶(C.batrachus)内的胆碱酯酶。
2.材料与方法
2.1化学药品
呋喃丹(工业级99.8%纯度,可溶于丙酮),拉利斯(印度,孟买)有限公司提供。
乙酰胆碱碘(ATI),5-5-二硫代-双
(2)-硝基苯甲酸(DTNB),毒扁豆碱半硫酸盐和牛血清白蛋白(BSA),购自Sigma公司(圣路易斯,密苏里州)。
其他分析纯化学药品从供应商中购买。
2.2实验用鱼
健康的淡水硬骨鱼,胡子鲶(长10-12cm,重20-25g,混合同龄组),来自印度法扎巴德本地养殖渔场。
每条鱼分别用钾溶液(0.5%,w/v)处理5分钟以去除皮肤粘附物,并且让其在玻璃水族箱(容量50L)中,在正常光周期和标准实验室环境下的正常脱氯自来水中适应环境达7天[11]。
饲喂人工鱼饵料,并且每天更换水,清洗水族箱。
实验中要用健康的雌雄鱼。
试验中所用的水的物理化学特征是:
温度(24±2.2)℃,pH(6.7±0.3),DO(溶解氧6.7到7.12ppm),碱度87ppm(如CaCO3),硬度160ppm(如CaCO3),电导率(860±41.87S)。
2.3半致死浓度的测定
呋喃丹对胡子鲶半致死浓度的值在实验室测定(0.2mg/L,96h)[12]。
呋喃丹(纯度为98%,可溶于丙酮)用由拉利斯印度有限公司(班加罗尔)提供,并溶解在丙酮中(100mg/mL)。
在盛有20L水的玻璃水族缸中加入适量的呋喃丹以达到所需的浓度。
在对照组的水族箱中加入等体积的丙酮,使水族箱中的呋喃丹可溶于丙酮中。
将21条鱼放入3组含有不同浓度呋喃丹的水族箱中。
记录在24,48,72和96h后鱼的死亡数量并且将死鱼移走。
有此得出鱼的半致死浓度的值。
采用方差分析的方法来研究呋喃丹的剂量和时间影响的百分死亡率。
用概率日志法分析数据,各浓度的百分死亡率和暴露期用平均值±SEM表示。
半致死浓度的值用ppm表示。
急性毒性95%置信限的范围可用于半致死浓度,且其斜率是根据LitchfieldandWilcoxon[13]。
未观察到有害效应的呋喃丹浓度根据Doudoroff等人[14]提供的公式计算。
2.4呋喃丹处理
将驯化后的30条鱼平均分为6组,其中4组放入亚致死浓度的呋喃丹(0.01和0.02mg/L)于50L的玻璃容器内,分别曝光96h和15天。
剩下的2组鱼作为对照组,放于无药性的水中。
每24小时更换一次每个容器中的水,以确保曝光的一致性。
保持相同的丙酮浓度,作为与实验水族箱中的呋喃丹的对照。
将丙酮作为溶剂是因为它在高浓度下仍然无毒。
在规定的时间结束后,将鱼进行解剖,分离组织,肝,腮,肌肉,脑和肾脏,用生理盐水洗净后保存在冰冷的环境下,已做进一步的研究。
2.5无细胞提取物的准备
将组织和用呋喃丹处理后的鱼用低温生理盐水(0.15M)彻底洗净。
将每个组织切碎,并在低温条件(6-8℃)下,用Potter-Elvehjam的方法将聚四氟乙烯涂层碾碎制成10%的匀浆(重量/体积),用于制备磷酸钠缓冲溶液(50mM,pH8.0,含0.1%的TritonX-100)。
将匀浆液在冰冷条件下间歇搅拌30分钟,然后用冷冻高速离心机在10000的离心力下离心30分钟。
收集各组织匀浆的上清液,保存在冰中直到试验使用。
2.6酶活性检测
我们对Ellman等人[15]提出的方法进行了改进,并用于乙酰胆碱酯酶的测定。
在测定前,将每种酶匀浆适当的稀释。
用于测定乙酰胆碱酯酶的混合物中包括50mM的磷酸钠缓冲液(pH8.0),0.5mM的ATI和0.5mM的DTNB(pH8.0)。
ATI和DTNB溶液要现用现配。
混合物中所加入的酶匀浆决定着反应开始时间。
室温(28±2℃)下用Digispec-200GL紫外可见分光度计在412nm下测吸光值,且3分钟内不变。
将每个组织匀浆分成3份予以测量。
同时,用两个空白组(一个含有磷酸缓冲液,DTNB,ATI;一个含有磷酸缓液,DTNB,蛋白酶(没有底物ATI))检验非乙酰胆碱酯酶(依赖于三硝基苯酸TNB的形成)。
读出每分钟空白组减去实验组的吸光值。
在上述规定的实验条件下,将酶活性的单位定义为每分钟催化转换1μmolATI酶的量。
该酶活性单位用黄色阴离子(1.36×104㎝-1mol)-1的摩尔消光系数计算,表示g-1的组织湿重。
2.7体外曝光
在底物存在下,呋喃丹和毒扁豆碱对乙酰胆碱酯酶活性的抑制有了初步的确定[16]。
用鱼脑匀浆作为乙酰胆碱酯酶的来源,测定呋喃丹和毒扁豆碱对酶活性的影响。
将0.1M含有0.05%的TritonX-100磷酸钠缓冲液(pH8.0)加入到呋喃丹和毒扁豆碱中,配制成不同的浓度,然后加入20μL的脑匀浆(含40μg的蛋白质)盛在不同的试管内,在25℃下放置15min后加入ATI和DTNB,记录每组的吸光值,每组至少要有三个重复,且每个重复均要测定呋喃丹和毒扁豆碱的浓度。
呋喃丹和毒扁豆碱决定着所需时间和剂量,分别培养加入20和40nM的呋喃丹和毒扁豆碱的酶匀浆。
用动能图来估计ICS的值,此化合物的平均浓度抑制了一半乙酰胆碱酯酶的活性。
作为对照,在不同的培养时间下,酶活性几乎保持不变。
3结果
3.1体内试验
表1和表2总结了呋喃丹对胡子鲶不同组织内乙酰胆碱酶活性的影响。
未处理的胡子鲶,大脑中乙酰胆碱酯酶的活性最高,而肾脏中酶活性最低。
未暴露的鱼体中各组织内乙酰胆碱酯酶的活性排列如下:
大脑>肝脏>肌肉>腮>肾脏。
相比较未处理的鱼,用呋喃丹处理后的胡子鲶的乙酰胆碱酯酶的活性在亚急性浓度和不同的处理时长下都有明显的变化。
用呋喃丹(0.01,0.02mg/L)处理后酶抑制最明显的部位在鱼鳃;暴露96h和15天后,其中抑制程度排列为:
鱼鳃>肌肉>大脑>肝脏>肾脏。
当鱼在高浓度(0.02mg/L)呋喃丹长时间(15d)处理后抑制程度得到最高。
在两种呋喃丹亚急性浓度中,对腮部乙酰胆碱酯酶强烈的抑制作用可能是由其直接受药物影响所致。
结果显示高浓度(0.02mg/L)呋喃丹和长处理时间(15d)对乙酰胆碱酯酶活性强烈的抑制影响在腮部为74%,肌肉上为71%,十分相似。
而且,类似的是,肝脏为69%,大脑为70%。
这表示这些器官收到了等量的药物影响。
Table1EffectofcarbofuranontheactivityofAChE(Uuits/gwetweiehtoftissue)indifferenttissueofC.badochasexposedfor96hr
Table2EffectofcarbofuranontheactivityofAChE(Uuits/gwetweiehtoftissue)indifferenttissueofC.badochasexposedfor15day
3.2体外实验
为了观察呋喃丹(杀虫剂)和扁豆毒碱(特定的乙酰胆碱酯酶抑制剂)对乙酰胆碱酯酶的抑制程度,在实验用品与方法所介绍的类似实验环境的条件下,我们用不同的混合物浓度对酶进行了测定。
鱼脑匀浆被用为酶的来源。
将不加入上述任何混合物作为对照组。
体外实验中,乙酰胆碱酯酶的活性在低浓度的呋喃丹和扁豆毒碱中得到了抑制(图1和图2)。
乙酰胆碱酯酶的活性在25nM呋喃丹和扁豆毒碱中得到了完全抑制(图1和图2)。
呋喃丹和扁豆毒碱对胡子鲶大脑乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度值基本相似(12nM)。
扁豆毒碱对乙酰胆碱酯酶活性的特定抑制证明酶是一种真正的胆碱脂酶。
在不同时长下通过两种固定浓度的混合物对酶的培养,我们记录了呋喃丹和扁豆毒碱对酶抑制时间,并在之前提到的环境类似的条件下,监测了乙酰胆碱酯酶的活性。
活性的百分率与时间点的上升成反比(图3和图4)。
结果表明当乙酰胆碱酯酶的活性被20nM浓度的呋喃丹和扁豆毒碱抑制50%时,t1/2值为12.5min。
Figure1Acetylchollnestrase(AChE)activityinbrainofC.batrachusafterinvitroezposuretocarbofuran
Figure2Acetylchollnestrase(AChE)activityinbrainofC.batrachusafterinvitroezposuretoeserine
Figure3TheinhibitionofAChEactivitybycarbofursn0.0nM(◆);20nM(x)and40nM(△)atdifferenttimeintervals.Valuesaremeansofatleastthreerepllcatlonaforeachconcentration
Figure4TheinhibitionofAChEactivitybyeserine0.0nM(◆);20nM(x)and40nM(△)atdifferenttimeintervals.Valuesaremeansofatleastthreerepllcatlonaforeachconcentration
4讨论
胡子鲶中的乙酰胆碱酯酶存在可溶和颗粒两种形态。
用聚乙二醇辛基苯基醚可使包膜状态的乙酰胆碱酯酶在磷酸盐缓冲剂中溶解。
聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子清洁剂。
从其他生物中得到的乙酰胆碱酯酶同样被检测出存在可溶与包膜粒子两种形态[2,17,18]。
本实验中从胡子鲶不同器官中提取的乙酰胆碱酯酶在低浓度下,体内和体外试验中都因呋喃丹处理受到了强烈抑制。
相比其他组织,鱼鳃受到的呋喃丹毒性影响最强烈。
腮相对较大的表面积作为环境和血液的连接层,其上有明显的可保持氧溶解,酸基稳定和离子平衡[19,20],所以鱼鳃内的乙酰胆碱酯酶活性受到最大的抑制可能与呋喃丹与此器官在水中培养时的直接接触药物有关。
而且也不能被排除鱼鳃上杀虫剂的生化积累速率相对提高的可能性[21]。
Sharma等[22]证明西维因(另一种氨基甲酸酯杀虫剂)在更高浓度下同样引起了类似于胡子鲶不同组织上对乙酰胆碱酯酶的抑制。
氨基甲酸酯杀虫剂可以对与薄膜外表皮连接的胆碱酯酶产生直接影响[23,24]。
这导致了乙酰胆碱(ACH)的积累[25]。
乙酰胆碱作用于等离子薄膜,主要产生神经毒素。
氨基甲酸酯杀虫剂被证明能够干扰乙酰胆碱酯酶在突触和肌神经连接处分解神经传导物乙酰胆碱的能力,从而因产生了有毒的超胆碱而抑制了中枢和周边神经内乙酰胆碱酯酶的活性[6,25-27]。
呋喃丹对小型哺乳动物[18,24],人体红细胞[28]和科罗拉多马铃薯甲虫等昆虫[29]中的乙酰胆碱酯酶活性也有类似的抑制。
近期的一些报告表明亚毒性浓度的呋喃丹可引起胡子鲶[8],鳢毛虫[9]和淡水乌鳢[30]等鱼类中的神经毒素。
本实验中低浓度呋喃丹对乙酰胆碱酯酶的强烈抑制,表明杀虫剂的滥用能对环境和包括人类等食用鱼类在内的生物产生严重的负面影响。
本实验中的数据对环境影响的评估和杀虫剂的管理都有很高的价值。
【参考文献】
[1]MachemerLH,PickelM.Carhamatelnsecticides[J].Toxicology,1994,91:
36-41.
[2]JensenSE.Acetylcholinesteraseactivityassociatedwithmethiocarhresistanceinastrainofwesternflowerthrips,Frankliniellaoccidentalis(Pergande)[J].PesticBiochemPhysiol,1998,61:
191-196.
[3]Tarrab-HazdaiR,TokerL,Silman1,etal.AcetylcholinestcrasefromSchistosoma,mansoni:
interactionofglobularspecieswithheparin[J].BiochemJ,1999,344:
951-959.
[4]RickwoodCJ,Galloway,TS.Acetylcholinesteraseinhibitionasahiomarkerofadverseeffect.AstudyofMytilusedulisexposedtotheprioritypollutantchlorfenvinphos[J].AquaticToxicology,2004,67:
45-51.
[5]RicherJF,MinkFL,StaraJF.Thetoxicologiceffectsofthecarbamateinsecticide,aldicarbinmammals:
AReview[J].EnvironHlthPros.1987,72:
267-28I.
[6]BrienRDO.lnsecticides,actionandmetabolism[M].NY:
AcademicPress,Inc.1967,83.
[7]YuCC,MetcalfRL,BoothGM.Inhibitionofacetylcholinesterasefrommammalsandinsectsbycarbofurananditsrelatedcompoundsandtheirtoxicitiestowardstheseanimals[J].JAgriFoodChem,1972.20:
923-926.
[8]BayoumiOC,BasyouniSA.ToxiceffectsofsomecarhamateinsecticidesandtheirrespectivemetabolitestowardsClariaslazera,Paperpresentedatthe39thInternationalsymposiumoncropprotection[C].Belgium,1987,52:
2b,528-533.
[9]GuhathakurtaS,BhattacharyaS.Targetandnon-targetactionsofphenthoateandcarhofuran;brainacrtylcholinesterase,kidneyiodideperoxidaseandbloodthyroxineprofilesinChannapunclatus[J].BiomedEnvimnSciences,1998,1:
63-67.
[10]WHO."Carbamatepesticides":
AgeneralIntroductionNo.64,EnvironmentalHealhCriteria;lnternationalProgrammennChemicalSafety[R].Geneva,1986.
[11]AmericanPublicHeathAssociation(APHA).Standardmethodsfortheexaminationofwaterandwastewater,18thedn[R].Washington,DC.1991.
[12]SinghRK,SinghRL,SharmaB.AcutetoxicityofcarhofurantoafreshWatertelcOSt,Clariashatrachus.Bull.EnvironContamToxicol2003,70:
1259-1263.
[13]LitchfiPldJTJr.,WilcoxonF.Asimplifiedmethodofevaluatingdoseeffectexperiments[J].JPharmacolExpTherap,1949,36:
99-113.
[14]DoudoroffP,AndersonBG,BudrickGE,GalstaffPS,HartWB,PatrickR,StrongER,SurherEW,VanhornWM.Bioassaymethodsfortheevaluationofacutetoxicityofindustrialwaste[J].SewlndustWater,1951,23:
1380-1391.
[15]Ellman,GL,CourtneyKD,AndresV,etal.Anewandrapidcolorimetricdeterminationofacetylcholinesteraseactivity[J].BinchemPharma,1961,7:
88-95.
[16]Kufcesck0,SzeqletesT,LangT,etal.InvestigationofeffectsofpesticidesonmolecularformofAChEinalimentarypanelsofcarp[J].PesticBiochemPhysiol,1994,4:
155-163.
[17]SharmaB.PurificationandcharacterizationofacetylcholinesteraseandphosphofractokinasefromSeteriacervi,afilarialparasite,Ph.Dthesis[C].BanarasHinduUniversity,Varanarsi,India,1988.
[18]FishwickSK,ShoreRF,TurkA,etal.Variationofbrainandserumcholinesteraseactivitywithageinwildsmallmammals[J].BullEnvironContamToxico1,1996,56:
604-611.
[19]ClaiborneJB,EdwardsSL,Morrisson-ShetlarAI.Acid-baseregulationinfishes:
cellularandmolecularmechanisms[J].JExpZnnl,2002,293:
298-302.
[20]RandallDJ,BraunerCJ,ThurstonRV,etal.Waterchemistryatthegillsurfacesoffishandtheuptakeofxenobiotics[A].In:
TaylorEW,ed.Toxicologyofaquaticpollution[M].Cambridge:
CambridgeUniversitPress,1-16.
[21]YadavA,SinghRK,SharmeB.lnteractionofcarbofuranwiththeacetylcholinesterasefromthebrainoftheteleost,Clariasbatrachus[J].ToxicolEnvironChem,1998,65:
245-254.
[22]SharmaB,GopalK,KhannaYP.Interactionofcarbarylwithacetylcholinesteraseoftheteleost,Clariasbatrachus,afreshwaterteleost[J].ToxicolEnvironChem.1993,39:
147-152
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 呋喃丹对淡水鲶鱼Clarias gariepinus乙酰胆碱酯酶活性的亚急性毒性试验 呋喃 淡水 鲶鱼 Clarias gariepinus 乙酰 胆碱酯酶 活性 急性 毒性 试验