荧光定量PCR详细流程和问题解析.docx
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荧光定量PCR详细流程和问题解析.docx
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荧光定量PCR详细流程和问题解析
荧光定量PCR详细流程和问题解析
一般PCR与荧光定量PCR技术区别?
简单的讲PCR技术最先是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术那么是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。
如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过一般PCR后,通过电泳也能够进行定量,实际上是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。
近两年没有人再讲这种的话了。
SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方式如何选择?
从实验本钱来讲,SybrGreen是最好的,大体上确实是一般PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可,其信号强度也专门好,还能够进行融解曲线分析等,但缺点是只能在一个反映管内进行一种PCR反映的检测,另一个问题是非特异性扩增会阻碍实验结果,固然也有一些技术解决这些问题,后面会讲到。
关于研究人员来讲,若是需要检测的基因很多,而每一个反映管中进行一种PCR反映的检测能够知足实验要求,那么SybrGreen是最好的选择。
若是需要进行多通道实验,即在一个反映管中进行2种或以上的反映,那么要选择其他的方式,最经常使用的是Taqman、Molecularbeacon,这两种都是探针的方式,由于增加了探针的特异性,因此其扩增曲线反映的确实是特异性产物的扩增曲线,不含有非特异性扩增的成份。
因此商业用途的检测试剂盒多数采纳这一技术,以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。
其缺点在于探针本钱较高,有时设计的探针并非适合,有造成损失的可能性。
而且要进行较多的实验条件的优化。
这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题,听说取得Molecularbeacon的许可权的本钱相对较低,但只是听说。
另一种值得一提的是LUX探针,它也可进行多通道实验,但它没有Taqman和Molecularbeacon方式的增加探针特异性的功能,因此只能是一种折中的方案,若是不考虑多通道实验,那么不如SybrGreen法
选择单通道实验仍是多通道实验?
这是要依如实验需要来选择的,若是有一个、两个或是三个基因要进行比较,并用看家基因进行对照,能够考虑选择多通道实验。
多通道实验的益处是能够排除样本加样的误差。
但要克服的困难也比较多,一是条件的优化比较麻烦,即多种PCR反映和探针要在同一个反映条件下进行,而且效率都要比较高,另一个困难是要求彼此之间没有干扰,因为干扰会阻碍到实验结果。
还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时,因为共用核苷酸等资源的缘故,会让模板数少的基因的定量值变小或变成零。
因此一样两通道的实验比较多些,即一个基因进行多样本比较,用看家基因进行对照。
能够看出,若是单通道实验能够解决问题,就不要选择多通道实验了。
三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。
因为一样的仪器最多也只有四个通道,确实是有更多的通道,实验条件的优化也是足够麻烦了。
双通道实验时如何克服反映条件、干扰和模板数不同专门大等困难?
关于反映条件的优化,可通过两个单独实验的标准曲线来优化,主若是复性温度,可用PCR仪的温度梯度功能来选择,然后找到一个适合的复性温度。
关于如何确信是不是存在彼此干扰,那么要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较,若是不同不大,那么说明没有干扰。
至于模板数不同专门大的问题,能够通过降低引物浓度的方式来实现,即primerlimited,在一样的PCR反映中,引物的浓度是足够高的,大体上能够将反映液中的核苷酸全数消耗尽,在优化引物浓度时,用不同的引物浓度进行实验,找到不阻碍反映的C值的最低引物浓度。
如此在实际反映中,模板数高的基因在引物耗尽后,反映液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反映。
引物设计中的几个注意事项
一、引物设计最好用相关的软件来进行设计,考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题,其中产物的变性温度是大伙儿不太关切的问题,但有些产物在一样的95度条件下不能充分解链,会严峻阻碍实验结果。
二、引物所设计的片断必然要有足够的特异性,选择好片段后,最好到互联网中进行相关的搜索,看在样本的基因组有无相拟的基因和假基因等,若是有,那么可选择特异性更高的区域。
3、在进行mRNA表达量的定量,能够在引物设计时考虑基因组的污染问题,即在引物设计时让两个引物跨一个内含子,如此基因组污染所造成的扩增能够区别出来,或因为片段过大而不能扩增
4、由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的进程,若是逆转录是用poly(T)作引物,那么设计的片段尽可能靠近poly(A),以避免逆转录的效率阻碍到实验结果。
若是用特异性引物进行逆转录,那么要考虑引物区是不是存在RNA二级结构的问题
五、产物片段的大小:
定量PCR一样产生片段都不大,可不能超过600bp。
SybrGreen法一样选择250-600bp,过大会阻碍到PCR扩增的效率,过小那么很难通过融解曲线与引物二聚体分开,但并非是绝对的。
Taqman法的扩增片段都很小,几十或是100多,这是其原理造成的。
Molecularbeacon法对片段大小的要求不高,只要不是太长即可。
SybrGreen法的实验策略:
实验可分为三个时期,即实验条件的优化、预实验和正式实验。
一、实验条件的优化时期,这一时期是最花时刻的,
一、要找到一个阳性的模板,能够是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。
有了阳性的模板才能进行最大体的定量扩增实验,若是有一般PCR的实验条件,也能够此为基础进行实验。
二、扩增出的产物要通过电泳方式确信其大小,以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因,有些用户就发生过优化了几天的条件才发觉扩增片段的大小不对,不是自己想要的基因。
固然,能测个序什么的最好。
并通过融解曲线实验来确信产生的Tm值和所用的变性温度是不是已经足够,个别情形下会出来解键不充分的现象。
3、有了大体的PCR条件后,要将阳性模板进行倍比稀释,一样用10倍稀释。
将稀释的模板带上阴性对照,分成多份进行温度梯度实验,对复性温度进行优化,以找出复性温度范围,复性温度最好能知足以下条件:
高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。
选择知足条件的中间温度,如此能够提高实验的稳固性,可不能因为样本管在加热模块中的位置不同而阻碍实验结果。
4、若是找不到适合的条件,如引物二聚体过量,可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化,然后再进行复性温度梯度实验。
其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会阻碍Tm值和所用的变性温度。
二、预实验时期
依照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验,每一个样本做一个10倍和100倍稀释的实验,预实验的目的要紧有两个,一是了解样本的模板浓度范围,若是有样本的模板浓度在标准曲线之外,如太高或太低,那么可能要对标准曲线进行从头优化,固然,若是太高和太低不阻碍你的实验结论那么可定为高于多少或低于多少,直接进行外推是不科学的。
另一个目的看样本中是不是有PCR抑制物的阻碍,若是每一个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同,那么说明没有抑制物的阻碍,若是不同,如原倍结果为零,而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性,那么说明样本中PCR抑制物浓度较高。
可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发觉过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的,或许有更多用户没有进行如此的实验,取得了错误的结论。
因为样本RNA的提取试剂中常常有抑制PCR反映的物质,清洗不干净就会阻碍到定量PCR反映。
三、正式实验时期
然后就能够够进行正式实验了,只需要将每一个样本作三个或更多的重复即能够了。
有抑制物的样本先进行稀释,计算浓度时不要忘记就好了。
最后就能够够进行实验结果分析了,个别样本中离群的数值能够删除。
SybrGreen法的注意事项
一、最好依照上面提到策略进行实验,以避免造成没必要要重复实验,从而降低实验本钱
二、SybrGreenI一样是先将母液用DMSO进行稀释100倍,最终的利用浓度为4000-10000分之一。
可能不同的SybrGreenI母液的稀释倍数不同,可通过实验来证明,但高浓度的SybrGreenI确信会阻碍PCR反映。
另外用水稀释后的SybrGreenI保留的时刻很短,一样1周后就不能用了。
DMSO似乎反复冻融会阻碍性能,但缘故不明。
3、在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到中意的结果,专门是引物二聚体很多时,能够考虑改换引物,因为引物本钱低,而优化实验本钱很高。
4、当有少量引物二聚体阻碍荧光结果时,能够提高荧光读板时的温度来排除引物二聚体的阻碍,如将读板时的温度提高到82度,现在引物二聚体已经解链而产物没有解链。
但引物二聚体浓度很高时会严峻阻碍PCR反映,排除引物二聚体的阻碍也没有效。
五、大伙儿都明白进行绝对定量需要标准曲线,有些用户以为进行相对定量时就不需要标准曲线了,能够通过2ΔΔC(t)来计算,但这一计算是有条件的,即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%,能够通过实验来证明。
但大多数用户并无进行如此的实验就直接用2ΔΔC(t)来计算了。
这是错误的,会取得错误结论。
六、不管是利用自配的试剂仍是用商业的荧光定量试剂盒,最好买够试剂,以避免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采纳其他试剂,由于不同试剂的缓冲液成份有较大不同,如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等,可能会阻碍到实验结果,乃至要从头进行实验条件的优化。
7、不要在管盖上写字,缘故很明显,但有些用户适应了写字,后来再擦掉,也会对实验有些阻碍。
八、最好利用高质量的PCR管,低质量管的管间差可能会专门大。
九、每次实验必然要有阳性对照和阴性对照,以避免显现问题时找不到缘故。
10、在样本很宝贵时能够采纳对样本进行稀释的方式进行定量。
只要浓度不是太低,理论来讲对稀释是可不能阻碍实验结果的。
其他方式也能够采纳类拟的策略,以节约本钱,提高效率。
想到的内容就这些了,希望大伙儿多批评指正。
反映体系的成立及优化
来源:
发布时刻:
2020-10-17
1.SG浓度:
终浓度1:
5,000-1:
100,000,一样为1:
10,000—1:
70,000
2.Primer浓度:
终浓度50nM-300nM
固定摸板浓度的梯度实验
不加摸板的对如实验(NTC)——有无非特异信号
熔解曲线的分析——是不是单峰
建议利用HPLC纯化的引物
3.MgCl2浓度
降低MgCl2浓度以减少非特异性产物
最低可至
同时做梯度实验和NTC对照
4.反映温度和时刻参数
反映温度参考所用酶的种类
退火温度利用温度梯度功能优化
反映时刻与常规PCR类似,扩增片断一样为200-300bp
5.TaqMan探针
引物、探针设计:
第一选择探针序列
探针的Tm值为68-70度,长度不该超过30碱基
探针的5’端不该是G,G有可能会淬灭荧光素
引物应尽可能靠近探针,扩增片断不超过400bp,一样为80-150bp
引物的Tm值为59-60度,长度约20碱基
幸免引物、探针之间的二级结构
委托合成公司设计
利用辅助软件
确信反映参数
一样为两步法,94度10-20s
60度30-60s(Taq酶的5’外切酶活性在60度最强)
通过温度梯度优化退火温度
三步法,72度45s
优化引物探针浓度
目标:
最高的信号/背景比
最小的Ct值
引物浓度:
50nM-900nM
探针浓度:
50nM-250nM
通过量次实验确信各自的浓度和比例
RealtimePCR体会从RNA的提取到PCR
一:
引物的设计
引物的设计关于那个实验相当重要,因为realtimepcr的检测灵敏度比较高,因此相应的对引物设计的要求就很高。
一般的要求规那么大伙儿都明白,还有几点必需注意:
1,引物的错配率(引物错配形成引物二聚体,可是SYBR照样能嵌入进去,结果致使实验结果的误差专门大,重复性也不行)。
2,引物的特异性必然要高(不像常规PCR,引物同源性不高,只要两条产物的片段长度相差足够大,在电泳的时候能够区分开就能够够。
realtimePCR只有在熔解曲线的时候能分开,因此这就造成整个实验结果误差专门大,不可信)。
3,引物设计要跨内含子,不能在一个外显子上(咱们的实验是以cDNA为模板来扩增的,若是有DNA污染的话,因为DNA上含有分子量专门大的内含子,不可能完成扩增。
这对咱们排除整个实验的误差起专门大的作用)。
4,引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度,方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。
可是若是相差比较大,就得分开做,浪费模板,浪费管家基因,因此每一个实验室设计引物的时候要尽可能一致,如此就不用每次查退火温度,且对整个实验有利。
5,注意引物设计好后的产物长度。
REALTIMEPCR的最正确产物长度在150-250kb左右(书上说如此能够增加荧光的灵敏度,减少实验误差,可是我对那个说法持疑心态度。
产物长度越大,SYBR嵌入的越多,如此才能够保证最后的荧光值比较可信)。
6,不同的管家基因扩增效率不同。
因此在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。
若是扩增效率相差太大,就不能利用delt,deltCt法来比较基因表达量的高低。
二:
模板的要求
归根到底,REALTIMEpcr想要检测的是目的基因表达量的高低,因此对整个实验进程中模板的质量要求必然很高,我以自己的一些体会说一下操作进程中的一些关键点:
1,用TRIZOL提取RNA有范围要求。
细胞数必需在一个范围之内才能提掏出高质量的RNA,因此咱们在提取前必需明白细胞数(一样6孔板中两个孔就能够够提掏出RNA)。
2,加入氯仿抽提进程中尽可能不要吸到中间层(中间层为基因组DNA,对上机做REALTIMEPCR很不利,会致使起始荧光值很高,无法跑出完整的扩增曲线)。
3,提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉,可是不要过度挥发。
(乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有阻碍。
在乙醇存在的情形下,DNA加倍难溶,这确实是醇沉的道理。
可是过度挥发,RNA又不溶于水,会造成后续反转录量不高)。
4,反转录进程的操作尽可能在冰上。
咱们用的是OLIGODT18,为了尽可能的排除RNA之间的二聚体,咱们将RNA和OLIGODT18在一路70度变性10分钟后,马上冰浴2分钟,再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITOR,MLV。
然后在37-40度下一个小时完成延伸进程(也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟,再加入OLIGODT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITOR,MLV。
可是在变性完再加OLIGODT18时,加的比较晚的管子有专门大的可能RNA又从头形成二聚体,致使前面的变性没成心义)。
5,反转录完后将cDNA-20度保留,尽可能不要反复冻融(能够以10UL为一个单位来分装cDNA)。
6,在加样的进程中需要专门注意:
(1)最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上,如此能够排除不同管之间引物浓度的不同。
(2)最后加模板的时候需要一把很准确的移液器,以便确保每次加进去的样一致,注意不要沾管壁(大部份人说需要混匀,可是我以为只要确保加入到体系中就能够够,不用刻意混匀。
因为咱们在反映前有个95度变性,大伙儿能够想象一下,在95度时候体系内的分子运动是很猛烈的,完全能够混匀),有条件的话能够加ROX,来排除不同的加样体系来造成的误差。
(3)加样完毕后最好离心一下,避免沾璧。
三:
上机操作
在做整个实验之前,应该对实验有个整体的打算,每一个管中所加的物质要有打算。
在程序上编好号码,选好需要进行的熔解曲线(因为机械刚开始是默以为不进行熔解曲线,切记)。
能够选择两步法(产物长度较小,退火和延伸都在60度完成),也能够选择三步法(产物较大,只能分为3步,且应该依照产物的长度来确信延伸时刻,因为TAQ酶的延伸速度最少也在50BP/S,因此能够换算出所需要的延伸时刻)。
扩增完毕后进行熔解曲线,那个是必需要有的,因为如此才能鉴定你产物的特异性和有无引物二聚体。
若是前几回做的话最好在做完REALTIMEPCR后将产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,来确信自己的判定。
四:
分析数据
用的比较多的是用双DELT法相对定量,而绝对定量那么必需要进行标准曲线的制备,需要对那个基因构建质粒,克隆分离。
因此咱们对基因表达量高低用双DELT法(前提是扩增效率要一致)。
熔解曲线观看,若是同一基因的熔解曲线不一样,那么造成结果不一致,重复性很差,因此要多摸条件,尽可能使熔解曲线一致。
实验步骤:
1.设计引物,溶解成为10mM的浓度。
2.提取RNA,反转录成CNDA
3.常规PCR以实验所得模板扩增看家基因40个循环,电泳看产物多少。
若是少,那么不能进行REALTIMEPCR操作。
4.编写好程序,加样,上机。
5.分析结果。
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- 荧光 定量 PCR 详细 流程 问题 解析