生物实验室常用专业技术参数汇编.docx

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生物实验室常用专业技术参数汇编

实验室常用技术参数资料

一、核酸及蛋白质常用数据

1．核苷三磷酸的物理常数

化合物

分子量

λmax（pH7.0）

1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值

OD280/OD260

ATP

507

259

15400

0.15

CTP

483

271

9000

0.97

GTP

523

253

13700

0.66

UTP

484

262

10000

0.38

dATP

494

259

15200

0.15

dCTP

467

271

9300

0.98

dGTP

507

253

13700

0.66

dTTP

482

267

9600

0.71

2．常用核酸的长度与分子量

核酸

核苷酸数

分子量

λDNA

48502（双链环状）

3.0×107

pBR322

4363（双链）

2.8×106

28SrRNA

4800

1.6×106

23SrRNA

3700

1.2×106

18SrRNA

1900

6.1×105

19SrRNA

1700

5.5×105

5SrRNA

120

3.6×104

tRNA（大肠杆菌）

75

2.5×104

3．常用核酸蛋白换算数据

（1）重量换算

　　1μg=10-6g　　　　　1pg=10-12g

　　1ng=10-9g　　　　　1fg=10-15g

（2）分光光度换算：

　　1A260双链DNA=50μg/ml

　　1A260单链DNA=30μg/ml

　　1A260单链RNA=40μg/ml

　　（3）DNA摩尔换算：

　　1μg100bpDNA=1.52pmol=3.03pmol末端

　　1μgpBR322DNA=0.36pmol

　　1pmol1000bpDNA=0.66μg

　　1pmolpBR322=2.8μg

　　1kb双链DNA（钠盐）=6.6×105道尔顿

　　1kb单链DNA（钠盐）=3.3×105道尔顿

　　1kb单链RNA（钠盐）=3.4×105道尔顿

　　（4）蛋白摩尔换算：

　　100pmol分子量100，000蛋白质=10μg

　　100pmol分子量50，000蛋白质=5μg

　　100pmol分子量10，000蛋白质=1μg

　　氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿

　　（5）蛋白质/DNA换算：

　　1kbDNA=333个氨基酸编码容量=3.7×104MW蛋白质

　　10，000MW蛋白质=270bpDNA

　　30，000MW蛋白质=810bpDNA

　　50，000MW蛋白质=1.35kb

　　100，000MW蛋白质=2.7kbDNA

4．常用蛋白质分子量标准参照物

（1）高分子量标准参照

（2）中分子量标准参照

（3）低分子量标准参照

肌球蛋白

分子量

磷酸化酶B

97，400

碳酸酐酶

31，00

肌球蛋白

212，000

牛血清白蛋白

66，200

大豆脻蛋白酶

21，500

β-半乳糖甘酶B

116，000

谷氨酶脱氢酶

55，000

抑制剂

磷酸化酶B

97，400

卵白蛋白

42，700

马心肌球蛋白

16，900

牛血清白蛋白

66，200

醛缩酶

40，000

溶菌酶

14，400

过氧化氢酶`

57，000

碳酸酐酶

31，000

肌球蛋白（F1）

8，100

醛缩酶

40，000

大豆脻蛋白酶

21，500

肌球蛋白（F2）

6，200

抑制剂

肌球蛋白（F3）

2，500

溶菌酶

14，400

5．常用DNA分子量标准参照物

λDNA/HindⅢ

λDNA/EcoRⅠ

λ/HindⅢ+EcoRⅠ

pBR322/HaeⅢ

23130

21226

21227

587

123

9416

7421

5148

405

104

6557

5804

4973

504

89

4361

5643

4268

458

80

2322

4843

3530

434

64

2027

3530

2027

267

57

564

1904

234

51

125

1584

213

21

1375

192

18

974

184

11

831

124

7

564

125

续上表

pBR322/HinfⅠ

φχ174/HinfⅠ

φχ174/HaeⅢ

φχ174/TapⅠ

1631

726

140

1353

2914

517

713

118

1078

1175

506

553

100

872

404

396

500

82

603

327

344

417

66

310

231

298

413

48

281

141

221

311

42

271

87

220

249

40

234

54

154

200

24

194

33

75

151

118

20

72

　　二、常用缓冲液

　　1．分子克隆常用缓冲液

　　2．磷酸缓冲液

（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※

pH

1mol/LK2HPO4（ml）

1mol/LKH2PO4（ml）

5.8

8.5

91.5

6.0

13.2

86.8

6.2

19.2

80.8

6.4

27.8

72.2

6.6

38.1

61.9

6.8

49.7

50.3

7.0

61.5

38.5

7.2

71.7

28.3

7.4

80.2

19.8

7.6

86.6

13.4

7.8

90.8

9.2

8.0

94.0

6.2

（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※

pH

1mol/LNa2HPO4（ml）

1mol/LNaH2PO4（ml）

5.8

7.9

92.1

6.0

12.0

88.0

6.2

17.8

82.2

6.4

25.5

74.5

6.6

35.2

64.8

6.8

46.3

53.7

7.0

57.7

42.3

7.2

68.4

31.6

7.4

77.4

22.6

7.6

84.5

15.5

7.8

89.6

10.4

8.0

93.2

6.8

　　※:

用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：

　　pH=pK’+1g（[质子受体]/[质子供体]）

　　在此，pK’=6.86（25℃）。

　　3．电泳缓冲液

　　测序凝胶加样缓冲液

　　98%去离子甲酰胺

　　10mol/LEDTA（pH8.0）

　　0.025%二甲苯青FF

　　0.025%溴酚蓝

　　甲酰胺：

许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。

不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与DowexXG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液

使用液

浓贮存液（每升）

Tris-乙酸（TAE）

1×：

0.04mol/LTris-乙酸

50×：

242gTris碱

0.001mol/LEDTA

57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

Tris-磷酸（TPE）

1×:

0.09mol/LTris-磷酸

10×:

10gTris碱

0.002mol/LEDTA

15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）

40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

Tris-硼酸（TBE）a

0.5×0.045mol/LTris-硼酸

5×：

54gTris碱

0.001mol/LEDTA

27.5硼酸

20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

碱性缓冲液b

1×:

50mmol/LNaOH

1×:

5ml10mol/LNaOH

1mmol/LEDTA

2ml0.5mmol/LEDTA（pH8.0）

Tris-甘氨酸c

1×:

25mmol/LTris

5×:

15.1gTris

250mmol/L甘氨酸

94g苷氨酸（电泳级）（pH8.3）

0.1%SDS

50ml10%SDS（电泳级）

　　说明：

　　①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

　　以片都以1×TBE作为使用液（即1：

5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。

但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。

目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：

10稀释的贮存液作为使用液。

　　进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

　　②碱性电泳缓冲液应现用现配。

　　③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

　　2×SDS凝胶加样缓冲液：

　　100mmol/LTris·HCl（6.8）

　　200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）

　　4%SDS（电泳级）

　　0.2%溴酚蓝

　　20%甘油

　　不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

　　4．凝胶加样缓冲液

缓冲液类型

6×缓冲液

贮存温度

Ⅰ

0.25%溴酚蓝

4℃

0.25%二甲苯青FF

40%（W/V）蔗糖水溶液

Ⅱ

0.25溴酚蓝

室温

0.25%二甲苯青FF

15%聚蔗糖（Ficoll400）

Ⅲ

0.25%溴酚蓝

4℃

0.25%二甲苯青FF

30%甘油水溶液

Ⅳ

0.25%溴酚蓝

4℃

40%（W/V）蔗糖水溶液

碱性加样缓冲液:

300mmol/LNaOH

6mmol/LEDTA

Ⅴ

18%聚蔗糖（Ficoll400）

4℃

0.15%溴甲酚绿

0.25%二甲苯青FF

　　使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：

增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。

溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。

以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。

在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

　　选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。

但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

　　5．各种pH值的Tris缓冲液的配制

各种pH值的Tris缓冲液的配制　

所需pH值（25℃）

0.1mol/LHCl的体积

7．1

45．7

7．2

44．7

7．3

43．4

7．4

42．0

7．5

40．3

7．6

38．5

7．7

36．6

7．8

34．5

7．9

32．0

8．0

29．2

8.1

26.2

8.2

22.9

8.3

19.9

8.4

17.2

8.5

14.7

8.6

12.4

8.7

10.3

8.8

8.5

8.9

7.0

　　某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制：

将50ml0.1mol/LTris碱溶液与上表所示相应体积（单位：

ml）的0.1ml/LHCl混合，加水将体积调至100ml

（2）温度对50mmol/LTris·HCl液pH值的影响

4℃

25℃

37℃

8．1

7．5

7．2

8．2

7．6

7．3

8．3

7．7

7．4

8．4

7．8

7．5

8．5

7．9

7．6

8．6

8．0

7．7

8．7

8．1

7．8

8．8

8．2

7．9

8．9

8．3

8．0

9．0

8．4

8．1

9．1

8．5

8．2

9．2

8．6

8．3

9．3

8．7

8．4

9．4

8．8

8．5

　　（6）常用缓冲液的pKa值

缓冲液

分子量

pKa值

缓冲范围

Trisa

12.1

8.08

7.1～7.9

HEPESb

283.3

7.47

7.2～8.2

MPOSc

209.3

7.15

6.6～7.8

PIPESd

304.3

6.76

6.2～7.3

MESe

195.2

6.09

5.4～6.8

　　a：

三羟甲基氨基甲烷；b：

N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：

3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：

N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：

2-（N-吗啉代）乙磺酸。

　　7．温度对常用缓冲液pH的影响

缓冲体系

pKa（20℃）

△pKa/10℃

Mes

6.15

-0.110

Ada

6.60

-0.110

PiPes

6.80

-0.085

Aces

6.90

-0.200

Bes

7.15

-0.160

Mops

7.20

-0.013

Tes

7.50

-0.200

Hepes

7.55

-0.014

Tricine

8.15

-0.210

Tris

8.30

-0.310

Bicine

8.35

-0.180

Glycylglycine

8.40

-0.280

　　三、常用酶的配制

　　1．溶菌酶

　　用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。

每一小份一经使用后便予丢弃。

　　2．蛋白水解酶类

贮存液

贮存温度

反应浓度

反应缓冲液

温度

预处理

0.01mol/LTris（pH7.8）

链霉蛋白酶a

20mg/ml

-20℃（溶于水）

1mg/ml

0.01mol/LEDTA

37℃

自消化b

0.5%SDS

0.01mol/LTris（pH7.8）

蛋白酶Kc

20mg/ml

-20℃（溶于水）

50μg/ml

0.005mol/LEDTA

37～56℃

无须预处理

0.5%SDS

　　a：

链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomycesgriseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

　　b：

自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：

把该酶的粉末溶解于10mmol./lTris·HCl（pH7.5）、10mmol/lNaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。

经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。

　　c：

蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（TritirachiumalbumLimber）中纯化得到。

该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。

然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。

所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。

但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/lCa2+而不含EDTA的缓冲液。

在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+。

　　3．无DNA酶的RNA酶

　　将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/lTris·HCl（pH7.5）、15mmol/lNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

　　四、常用抗生素溶液

抗生素

贮存液a

工作浓度

浓度

保存条件

严紧型质粒

松弛型质粒

氨苄青霉素

50mg/ml（溶于水）

-20℃

20μg/ml

60μg/ml

羧苄青霉素

50mg/ml（溶于水）

-20℃

20μg/ml

60μg/ml

氯霉素

34mg/ml（溶于乙醇）

-20℃

25μg/ml

170μg/ml

卡那霉素

10mg/ml（溶于水）

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

链霉素

10mg/ml（溶于水）

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

四环素b

5mg/ml（溶于乙醇）

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

　　a：

以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。

以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。

所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

　　b：

镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

　　五、常用贮存液的配制

　　1．30%丙烯酰胺溶液

　　【配制方法】

　　将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。

加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。

　　【注意】

　　丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。

称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

　　一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。

　　在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

　　2．40%丙烯酰胺

　　【配制方法】

　　把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。

继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。

　　【注意】

　　见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。

　　3．放线菌素D溶液

　　【配制方法】

　　把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中，1：

10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。

放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

　　【注意】

　　放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

　　药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。

只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

　　4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液

　　【配制方法】

　　在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃

　　5．10mol/L乙酸酰溶液

　　【配制方法】

　　把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。

　　6．10%过硫酸铵溶液

　　【配制方法】

　　把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。

　　7．BCIP溶液

　　【配制方法】

　　把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃

　　8．2×BES缓冲盐溶液

　　【配制方法】

　　用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4，室温下用HCl调节　该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。

　　9．1mol/LCaCl2溶液

　　【配制方法】

　　在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。

　　【注意】

　　制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。

　　10．2.5mol/LCaCl2溶液

　　【配制方法】

　　在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

　　11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

　　【配制方法】

　　用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

　　【注意】

　　DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

　　12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液

　　【配制方法】

　　把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/lTris碱分别调节　每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。

碱基

波长（nm）

消化系数（ε）[L/（mol·cm）]

A

259

1.54×104

G

253

1.37×104

C

271

9.10×103

T

260

7.40×103

　　比色杯光径为1cm时,吸光度=εM

　　13．0.5mol/lEDTA（pH8.0）溶液

　　【配制方法】

　　在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节　溶液的pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

　　【注意】

　　EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。

　　14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）

　　【配制方法】

　　在100m