大花蕙兰茎尖及茎节组织培养快速繁殖技术研究.docx
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大花蕙兰茎尖及茎节组织培养快速繁殖技术研究
大花蕙兰茎尖及茎节组织培养快速繁殖技术研究
大花蕙兰茎尖及茎节组织培养快速繁殖技术研究
1.项目背景
1.1该植物的生物学知识、特性。
大花蕙兰又叫虎头兰、喜姆比兰和蝉兰。
兰科、兰属植物。
原产于印度、缅甸、泰国、越南和中国南部等地区的兰属(Cymbidium)中的一些附生性较强的大花种和主要以这些原种为亲本获得的人工杂交种。
大花蕙兰,是对兰属中通过人工杂交培育出的、色泽艳丽、花朵硕大的品种的一个统称。
兰属植物约48种,目前用来作杂交亲本的原生种有近20种,主要是大花的附生类以及少量的地生类。
常绿多年生附生草本,假鳞茎粗壮,属合轴性兰花。
假鳞茎上通常有12~14节(不同品种有差异),每个节上均有隐芽。
芽的大小因节位而异,1~4节的芽较大,第4节以上的芽比较小,质量差。
隐芽依据植株年龄和环境条件不同可以形成花芽或叶芽。
叶片2列,长披针形,叶片长度、宽度不同品种差异很大。
叶色受光照强弱影响很大,可由黄绿色至深绿色。
大花蕙兰的根系发达,根多为圆柱状,肉质,粗壮肥大。
大都呈灰白色,无主根与侧根之分,前端有明显的根冠。
内部结构为典型的单子叶植物构造,其皮层较为发达,有防止根系干燥的功能。
大花蕙兰花序较长,小花数一般大于10朵,品种之间有较大差异。
花被片6,外轮3枚为萼片,花瓣状。
内轮为花瓣,下方的花瓣特化为唇瓣。
大花蕙兰果实为蒴果,其形状、大小等常因亲本或原生种不同而有较大的差异。
其种子十分细小,种子内的胚通常发育不完全,且几乎无胚乳,在自然条件下很难萌发。
其中绿色品种多带香味。
花大型,直径6厘米~10厘米,花色有白、黄、绿、紫红或带有紫褐色斑纹。
1.2该植物的经济价值、生产现状与市场前景
经济价值:
大花蕙兰植株挺拔,花茎直立或下垂,花大色艳,主要用作盆栽观赏。
适用于室内花架、阳台、窗台摆放,更显典雅豪华,有较高品位和韵味。
如多株组合成大型盆栽,适合宾馆、商厦、车站和空港厅堂布置,气派非凡,惹人注目。
大花蕙兰以其植姿雄伟,花朵硕大而为人们所喜爱。
生产现状:
由于大花蕙兰常被称为“绿色股票”,于是就有人像炒股票一样疯狂地炒大花蕙兰,致使许多人上山掠夺性地挖掘野生兰花,从而使国兰野生资源遭受严重破坏,几近濒危大花蕙兰的繁殖传统上采用分株方法,一株一年只能繁殖0.8-1、25株,繁殖系数很低即使采用非传统栽培技艺,施用新的药剂和肥料,打破了“株不离母”栽培传统,也只能将繁殖系数提高到3倍。
因此,运用现代的组织培养等技术手段,进行大规模快速繁育大花蕙兰种苗的研究,对保护我国兰花资源以及大花蕙兰产业化发展具有十分重要的意义。
市场前景:
在近两年的元旦春节市场上大花蕙兰极为旺销。
其售价在150—280元/盆。
但多为一些花卉公司以整盆的方式从韩国、台湾、日本和荷兰进口在国内销售的,关税及运输的费用极大,售价十分昂贵,很难使这些美丽的兰花进入普通市民家庭。
如果大花蕙兰能在国内大量繁殖并大量生产,其售价完全可被普通消费者接受。
故在国内进行大花蕙兰的组培快繁和大花蕙兰栽培生产有极大的发展前景。
1.3该植物生产中存在的主要问题和解决途径
存在的问题:
(1)天然资源遭到破环,原有山上可采珍稀品种越来越少
(2)大花蕙兰多为杂交品种,种子繁殖无法保持其品种特性,且结实率也相对较低。
(3)传统栽培靠分株繁殖,因而周期长,繁殖系数低,繁殖速度慢,远远不能满足商品化生产的要求。
解决途径:
用组织培养的方法快速繁殖,包括以下三种:
(1)茎尖及茎节段作为外植体。
(2)根作为外植体。
(3)其它材料作为外植体,如叶片等。
1.4针对存在问题提出本项目的研究必要性
因传统的培养技术繁殖效率低,不能满足市场需求。
通过组织培养,快速培养出所需种苗,减少繁殖时间。
2.本项目的主要内容和需要解决的关键问题
2.1主要研究的内容
用茎尖及茎节段作为外植体,用组织培养的方法,快速繁殖。
2.2前人在该领域内已经取得研究成就和最新进展
学者们对茎尖及侧芽的取材时间、最适取材部位及大小进行了深入的研究,一般认为带1~2个叶原基的茎圆锥体成活率最高,中间部位侧芽的成活率及生长率也较高。
虽然顶芽和侧芽是极好的外植体,但芽的来源有限。
据殷丽青报道茎尖诱导芽的效果优于茎节段,诱导率为71.4%,而茎节段的诱导率为57.1%。
2.3项目的关键技术或难点
通过配置不同的培养基和不同条件处理外植体,将成苗开花率从50提高到80%,增加花朵数,增大花冠直径。
2.4研究的实验设计方案
(1)外植体的选择
取茎尖及茎节段作为外植体
(2)选择适宜的培养基
目前兰花无菌培养常用的培养基有KnudsonC、Vacin&Went、Kyoto、Reinent&Monr、Lindeman、MS以及美国Hydroponic公司出品的Hyponex培养基等,据李杰报道,不同培养基种类不足以对种子萌发产生实质性的影响。
但以Hyponex培养基操作简单且为节俭.
(3)选择适宜的取材时间
由于兰花酚类物质含量与季节有关,在生长旺盛的季节,兰花新芽上的酚类物质含量显著提高,而在生长较弱的季节酚类物质明显减少,所以选择冬春季取材在一定程度上可以减少褐化死亡。
(4)外植体的预处理
将取材的兰花外植体用含有150mg/L柠檬酸和抗坏血酸溶液处理1h,是较有效的办法。
3.项目所需要条件
3.1主要建筑设施
基本实验室(准备室、接种室、培养室、光照培养箱)
3.2需要的各种设备和仪器(列出清单注明型号、数量)
高压消毒锅1台;超净工作台(或接种箱)1一2台;电冰箱l台;空调机1一2台;精密天平1台;显微镜飞台;纯水器(或电热蒸馏水器)1台;电热恒温干燥箱1台;电炉(或煤气炉)1一2个;不锈钢锅1一2个(煮培养基用);酒精灯2个;长、短摄子,解剖刀二套;、l0ml移液管各5支;漏斗2一3个;25、50、100、1000、2000ml容量瓶各2个;250、500、1000ml烧杯各2一3个;100、500、1000ml小口棕色玻璃瓶各6一10个;直径阮。
的培养皿40一沁套;酸度计1台(或用精密试纸代替);
3.3药品试剂和耗材(列出清单,注清楚名称,规格,数量)
(1)无机营养物
无机营养物是植物生长发育所必须的养分。
无机营养物包括大量元素和微量元素两部分。
大量元素主要是硝态氮、按态氮。
磷、钾、钙、钠、镁、铁。
常用的药物有:
硝酸钱、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、微量元素包括碘硼锰、锌、钥、铜和钴。
硫酸锰、硫酸锌(ZnSO;·7H20)硼酸、铝酸钠、硫酸铜、氯化钻和碘化钾。
(2)维生素
培养基含维生素,有利于离体培养植物的发育。
常用的维生素有:
盐酸硫胺素(维生素Bl)、盐酸毗哆素(维生素B。
)生物素、肌醇、烟酸、甘氨酸泛氨酸等。
(3)生长调节物质
生长调节物质包括生长素和细胞分裂素。
调整它们之间所含的比例,可以控制植物愈伤组织的形成、芽的分化生长、生根生长素主要有叫噪乙酸(IAA)叫噪丁酸(工BA)、蔡乙酸(NAA)24一二氯苯氧乙酸(24一D)细胞分裂素可促进芽的分化,它包括有6一节基漂吟(6一BA或BAP)激动素(Kt、即6一吠喃氨基嚓吟)、玉米素(Zt)和异戊烯漂吟(Zip)。
(4)培养基
MS+2.0mg/LNAA+4.0mg/LBA
4.实验研究实施方案/或设计的技术规程
4.1实验准备(仪器安装,药品溶液的配制)
把母株放在温室内盆栽培养,于2月底~4月初陆续从母株上取8cm左右的新芽,从基部切离。
4.2实施研究的操做方法与过程
A.从母株上取8cm左右的新芽,从基部切离,用自来水冲洗,再用洗洁净溶液浸泡5min,自来水冲洗10min,剥去最外几层叶片,并剪去芽的上半段.
B.然后在超净工作台上采用3步灭菌处理法处理:
先在70%的酒精中处理6s,立即投入10%次氯酸钠溶液中10min,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层2~3片叶;再放入5%的次氯酸钠溶液5min,取出后无菌水冲洗,剥至最后一枚叶片;再放入1%的次氯酸钠溶液1min,取出后无菌水冲洗数次.
C.以上次氯酸钠溶液中均加入Tween-60以利杀菌剂更有效地发挥作用.在无菌条件下剥出约5mm长的茎尖,以生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4个小方块,分别接入已准备好的培养基上.pH5.2~5.6,蔗糖2%,琼脂条0.6%~0.85%,温度22~25℃,光照强度2000lx,每日光照12h.
D.外植体接在附加一定激素配比的培养基上,20d左右外植体周围出现许多白色颗粒状愈伤组织,继续培养逐渐转为绿色,25d可形成大量原球茎,以后每隔20d进行一次继代培养,若继代不及时易形成不定芽,需在继代时切去,影响原球茎增殖,造成浪费.
E.继代前观察统计试验结果.大花蕙兰对KT的敏感程度高于对6BA的敏感程度,相同浓度的NAA下,KT用量稍微增减即会产生明显差异,低浓度的KT对原球茎增殖有明显促进作用,高于0.1mgL则会抑制其生长.最佳激素配比为KT0.05mg/L,NAA0.5mg/L。
F.通过前期初步筛选后,选择以附加KT0.05mgL,NAA0.5mgL的最佳激素配比,把原球茎切块分别接种MS,12MS,VW,KC为基本培养基的培养基上,测试不同培养基种类对原球茎增殖的影响.
G.生长健壮的原球茎不切割接种在固体分化培养基上,10~15d可诱导出丛生芽,继续培养30d左右可发育成小苗,当培养瓶内丛生芽长出5cm左右时,将苗与新增殖的原球茎分开,原球茎继续增殖培养,苗转入生根壮苗培养基中,每瓶8~10个小苗,当苗长出5~6片叶,根长到3cm左右时,即可开盖于温室内炼苗.通过添加不同水平的NAA比较,以NAA0.2mg/L为最佳。
H. 炼苗2d后即可将苗取出,用清水洗净根部的琼脂,植于温室苗床内,栽培基质为松针+苔藓+粗砂,苗床底部垫以碎石、碎砖块,用稀薄的营养液喷雾,每隔1周喷1次800倍的多菌灵溶液,温度保持在10~25℃,在大棚里亦可生长良好,1个月后统计移栽成活率可达98%以上.1年后上盆,栽培基质用泥炭土+蕨根+树皮,每周浇1次液肥.
4.3观察记载项目
结果表明:
MS,1/2MS,VW,KC均可应用于原球茎增殖,但以KC效果最佳.MS,1/2MS,VW也能分化和增殖原球茎,但增殖缓慢、色淡.附加香蕉泥对原球茎增殖有明显促进作用,使增殖倍数提高到4.22,且生长健壮,色泽深绿。
用固体培养基培养最差,增殖速度慢,且易导致原球茎块死亡,继代不及时易分化出芽,但适合芽和根的分化培养;液体培养增殖较快,但生长不够健壮,色黄绿,质地较疏松;半固体培养基(减少琼脂用量)最佳,原球茎增殖量大,色深绿,健壮.,每隔4~5d对半固体培养基的培养瓶震荡,摇动一次,生长增殖效果更好。
4.4结果计算或分析的手段与方法
芽分化率(%)=未污染的原球茎分化个数的平均值/未污染的原球茎总数X100。
生根率(%)=生根苗总数/接种苗总数×100。
5.项目的预期结果
5.1研究项目会取得数据或结果
通过配置不同的培养基发现,无机盐浓度、糖的浓度和不同种类、浓度的植物激素配比以及培养方式等对大花蕙兰原球茎的增殖、分化、生根的都有很明显的影响。
无机盐的增加不利于芽的分化和生根,而原球茎的增殖量则随无机盐的增加而增加,因此,在诱导芽的分化和生根的培养中,适当的降低无机盐的浓度,而在原球茎增殖的培养中可适当的增加无机盐的浓度;蔗糖浓度的高低对原球茎的增殖影响不明显,生根率随蔗糖浓度的增加而增加,而芽的分化率则随糖用量的增加而减少;BA和NAA过高过低都不利于原球茎的增殖及分化,以NAA浓度为0.2mg·L~,BA浓度为1mg·L时大花蕙兰增殖量最高;NAA浓度为0.4mg·L~,BA浓度为0.5mg·L时大花蕙兰原球茎分化率最高;以NAA浓度为0.2mg·L~,BA浓度为1mg·L时大花蕙兰生根率最高;原球茎增殖培养宜采用液体悬浮培养,有利于增殖;而分化和生根培养宜采用固体培养,不仅有利于分化和生根,而且固体培养形成的。
5.2研究将取得成果的形式(论文、专利、或标准)
论文提纲:
(1).原材料的选择方法及选材部位。
(2.)培养过程及操作方法,以及在培养过程中应注意的问题。
(3.)记录数据,数据总结和分析结果,得出的结论。
6.成果的推广及应用前景
从生产的角度对培养基成分,工艺流程等方面有较大的创新,提供了一套大花蕙兰植物优质种苗快速繁殖方法和相关培养基配方。
该研究方法具有外植体去污成功率较高,增殖率高,变异率低,种苗粗壮,品质好、移栽后成活率高,生长势强等优势。
其外植体消毒效率高、培养基成分独特而且成本低,生产出的种苗品质一流,应用价值高。
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- 大花蕙兰茎尖 组织培养 快速 繁殖 技术研究