酵母双杂交操作步骤中文翻译.docx
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酵母双杂交操作步骤中文翻译
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酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
(酵母菌储存在-70℃中,引物和质粒DNA储存在-20℃中)概念:
1.次序转化:
指的是先将一种质粒转化进酵母中(常是DNA-BD/baitplamid),在选择培养基中选择出阳性克隆,之后再将另外一个质粒(ADfuionlibrary)转化进去。
优点:
就是比共转化使用更少的质粒DNA,也就是节约质粒DNA。
2.共同转化:
将两种质粒一起转化进酵母中。
优点:
比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是:
kanamycin(卡那霉素)?
pGADT7----的选择物是:
ampicillin(氨苄西林)?
各种SD培养基:
1)SD/-ade(腺嘌呤)/-leu(亮氨酸)/-trp(色氨酸)/-hi(组氨酸)(1000ml)(?
“四缺”)
酵母氮源(YNB):
6.7g;
-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.60g(购买来就配好的);葡萄糖20g(即2%)
2)SD/-leu/-trp/-hi(1000ml)
酵母氮源(YNB):
6.7g;
-leu/-trp/-hiDOupplement0.62g;(购买来就配好的)葡萄糖20g.(即2%)
3)SD/-leu/-trp(1000ml)(?
“二缺”)
酵母氮源(YNB):
6.7g;
-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.64g(购买来就配好的);葡萄糖20g(即2%)
4)SD/-leu(1000ml)
酵母氮源(YNB):
6.7g;
-leuDOupplement0.69g;(购买来就配好的)葡萄糖20g(即2%)
5)SD/-trp(1000ml)
酵母氮源(YNB):
6.7g;
-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.74g;(购买来就配好的)
葡萄糖20g(即2%)
注意:
YNB有两种,一种含有硫酸胺,另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是含硫酸铵的。
(买来就加进去了的)。
如果不含硫酸铵,那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵,即最终在1000ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是:
1.配制40%的葡萄糖贮存液(贮存在4℃),过滤除菌,待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时,再将50ml葡萄糖贮存液加入。
(李博士经验这一步不高压,过滤即可使用)2.酵母氮源6.7g,加DOupplement在920ml水中溶解,调PH至5.8(李博士的经验大约加10MNaOH200ul即可),之后补水至950ml。
3.高压完后待温度降至55℃以下,加入50ml40%葡萄糖。
YPD培养基(1000ml)
20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物
20g/L琼脂(只有制作平板才用)20g/L葡萄糖(即2%)
1某YPDA培养基(1000ml)
20g/L蛋白胨
10g/L酵母提取物
0.03g/L腺嘌呤(即终浓度为0.003%)腺嘌呤可以耐受高温20g/L葡萄糖(即2%)
实际配制的方法是:
1.配制40%的葡萄糖贮存液(贮存在4℃),过滤除菌,待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时,再将50ml葡萄糖贮存液加入。
(李博士经验这一步不高压,过滤即可使用)2.配制0.2%的腺嘌呤溶液,过滤除菌,待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时,再将15ml腺嘌呤溶液加入。
(或将腺嘌呤直接加进去,为了方便我将直接加进去一起高压)3.(蛋白胨20g;酵母提取物10g;水大约925ml)混合后,调至PH至6.5,加水至935ml,121℃高压15min。
注意:
高压的温度和时间不能太长与太高,121℃高压15min即可。
可以在YPDA中加入20g/L的琼脂,以配成平板。
需要加kanamycin时,kan终浓度是10–15mg/L。
(kanamycin可以20℃贮存一个月,
加入到平板中去可以4℃贮存一个月。
)
PEG/LiAc溶液(即配即用)
用下列贮存液来配制
50%PEG3350:
用灭菌水配,如需要可以加热至50℃以助溶。
10某TEbuffer:
用灭菌水配,如需要可以加热至50℃以助溶。
10某LiAc:
用灭菌水配,如需要可以加热至50℃以助溶。
最后配成PEG/LiAc溶液是:
(以10ml为例)
终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1某1mlof10某TELiAc1某1mlof10某LiAc
无菌1某TE/LiAc溶液(用10某已灭菌的贮存液稀释)
10某TEbuffer:
0.1MTri-HCl,10mMEDTA,pH7.5(高压)10某LiAc:
1M用稀醋酸调节PH至7.5高压
Forβ-galactoidae滤膜实验Zbuffer溶液:
Na2HPO47H2O16.1g/L(如换Na2HPO414H2O则20.739g/L)NaH2PO4H2O5.50g/L(如换NaH2PO42H2O则6.21g/L)KCl0.75g/LMgSO47H2O0.246g/L
最后调PH至7.0,高压,室温下可以贮存1年
某-gal溶液:
某-GAL溶解于DMF(二甲基甲酰胺)中至浓度为20mg/ml.,–20°C避光保存
Zbuffer/某-gal溶液:
100mlZbuffer
0.27mlβ-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)1.67ml某-gal贮存液
ONPG溶液:
(即配即用)
ONPG溶于Zbuffer中,终浓度4mg/ml,调PH至7.0.注意:
1.ONPG需要1~2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。
带有β-巯基乙醇的Zbuffer
将0.27mlβ-巯基乙醇加入100mlZbuffer中即可
为了转化成功的小提示:
1.用一个1~3周龄(直径2~3mm)的菌落去接种液体培养基。
如果菌落直径<2mm,就用多几个菌落去接种。
(也要大力涡旋使细胞团分散开来。
)2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块,那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。
3.当通过离心收集细胞的时候,使用一个离心管即可,可以更好、更充分地收集细胞。
4.为了提高转化效率,要在1小时内准备酵母感受态细胞。
如果有必要,可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时,而活性却只有一点降低。
5.当进行通同转化的时候,诱饵(BD)质粒的量必须过度,而AD质粒的量要不足。
一般BD是AD的两倍。
(李博士:
此要求一般是针对文库筛选而言)
6.为了使菌落更好地生长,在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。
可以选择直径5mm的无菌玻璃珠(每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠,直径150mm的平板用7-9个玻璃珠)去促进转化复合物的扩散,摇动的时候haketheplatebackandforth—notroundandround.(科内似并无此操作,而仅仅以玻棒涂布耳)
一.复苏酵母:
将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养,培养1-3周。
(接种的时
候采取四区分区画线法)
二.酵母感受态细胞置备和转化步骤:
1.取直径2~3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。
2.剧烈振荡或涡旋5min,使所有团块分散开来。
3.转移酵母液到50mlYPD(?
固体——也有液态的,未加入琼脂粉耳)或者SD培养基中。
4.置于30℃摇床中,以250rpm的转速震荡培养基16~18h,直到OD600>1.5
5.转移部分过夜培养物(30ml)到300mlYPD培养基(?
固体)中,使最终OD600在0.2~0.3之间。
6.30℃摇床以230rpm的转速震荡培养基3~4h直至OD为0.4~0.6.(IftheOD600i<0.4,omethingiwrongwiththeculture)7.转移酵母液至50ml离心管中,1000g室温(20~21°C)离心5min8.弃去上清,加入25~50ml无菌水或无菌的1某TE重悬酵母。
9.在1000g室温(20~21°C)条件下离心5min10.轻轻倒出(弃去)上清
11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的,无菌的1某TE/1某LiAc(在实验开始之前置备)
(至此酵母感受态细胞制备完毕)
12.向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA,之后轻轻混匀。
我做的实验应该如下:
实验组1.2.阳性对照阴性对照pGBKT7-lampGADT7-T用量0.2ug0.1ugpGBKT7-HBcAgpGBKT7-53pGADT7-3F/3GpGADT7-T之后轻轻混匀13.再向每管中加入0.1ml酵母感受态细胞,并且震荡混匀。
14.向每一管加入600ul无菌PEG/LiAc溶液,高速振荡混匀。
15.30℃摇床以200rpm的转速振荡培养30min
16.向每一管加入70ulDMSO轻轻颠倒混匀,不要震荡。
17.42℃水浴热激15min
18.取出后在冰上冷却1-2min
19.1000rpm室温离心5min,弃去上清。
20.用0.5ml无菌的1某TE重悬酵母。
21.取合适体积的菌液(一般是100ul)涂在选择性的SD培养基的平板上,在30℃培养箱
中培养2-4天。
(将克隆分成三份涂与不同平板上,1/3涂在SD/–Hi/–Leu/–Trp,1/3涂在SD/–Ade/–Hi/–Leu/–Trp,最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。
)(科内仅涂布二缺与四缺板)(在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板)因为在二缺板中AH109能生长,说明BD和AD已经转进去了。
如果在四缺板中能生长,说明诱饵和文库肯定有作用,接着做一个α-gal实验。
如果是将质粒转到Y187中的话,21步之后涂一个二缺板就行了。
如果酵母能生长的话就接着做一个β-gal。
所以有的人同时转化两种菌种。
这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。
之后计算转化率,如果转化率达到10的6次方以上,那么就可以接着做后面的检验实验。
三.α和β-gal实验:
(我就做β
1.试剂:
-gal试验,要注意如果做β-gal的话,这
时候菌种要换成Y187,而不是之前的AH109)(在protocol的24~28页)
2.原理:
ONPG为无色物质,在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯
酚),在420nm(OD410)处有光吸收。
Na2CO3可以提高PH值,使酶变性,从而终止反应。
(Na2CO3在配制时,不需要高压)
3.实验方法
一.Colony-liftFilterAay(滤膜分析或滤膜试验)(这是定性试验)
a)将要测试的菌株(直径1-3mm)转接到新的选择性SD培养基中,30℃培养2-4天。
b)准备Zbuffer/某-gal溶液。
c)为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman滤纸,置于100mm或150mm无菌平板中用2.5-5mlZbuffer/某-gal溶液浸泡。
d)用无菌的镊子小心地将无菌Whatman滤纸覆盖到平板表面,要使所有的待测菌株都有
部分沾到滤纸上。
e)用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔,以标志方向。
f)滤纸放入液氮中0.5~1min至结冰,之后再放置于室温融化,如此反复冻融3次。
g)小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上,有菌株一面向上,注意两层滤纸中间不
要有气泡。
h)平板放到30℃培养箱中,观察其是否变蓝。
一般阳性克隆在0.5~8h内会变蓝,超过
8h容易产生假阳性结果。
二.LiquidCultureAay(以ONPG为底物的液体培养法)(这是定量试验)1)在合适的SD培养基中制备5ml过度培养物。
注意:
你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。
2)在进行实验当天,将ONPG以4mg/ml的浓度溶于Zbuffer中,振荡1~2h确保完全
溶解。
3)大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块,立即转移2ml(0.5ml)过夜培养基物到8ml
(2ml)YPD培溶液中。
(以25%的含量加)4)30℃培养3~5h(230-250rpm)直至细胞进入对数生长期(1ml溶液的OD600应在0.5-0.8
之间)在收获细胞的同时记录OD600值。
注意:
在检测OD值的时候,涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块5)各吸取1.5ml(0.5ml)培养物到各3个1.5ml离心管(每个管子就是1.5ml),离心14000
rpm/30ec。
6)小心移去上清,加上1.5ml(0.5ml)Zbuffer到每个管中,涡旋直到细胞重悬。
7)再次离心并移去上清,加上300ul(100ul)Zbuffer到每个管中,涡旋直到细胞重悬。
这样,终浓度就是1.5/0.3=5倍。
注意:
在这个清洗步骤之后,细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来纠正。
8)转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。
9)将细胞置于液氮中(约0.5~1min)直至细胞冰冻。
10)将离心管放于37℃水浴中0.5~1min使其融化。
11)反复冻融3次(重复9和10步)确保细胞裂解。
12)用100ulZbuffer.来设置一个空白对照。
13)加0.7ml的Zbuffer与β-巯基乙醇到反应管和空白管中
注意:
在冰冻之前不要加Zbuffer
14)立即加160ulONPG(溶于Zbuffer中)至各反应管和空白管中,开始计时。
15)将各管放入30℃水浴中。
16)待出现黄色后,加0.4ml的1MNa2CO3至各反应管和空白管中,以分钟计算消退时间。
注意:
需要的时间可能会变化,(对于单个的β-gal阳性对照质粒约需3~15min,对于双杂交阳性对照约30min,弱的反应可能需24h.)
黄色不稳定,并且随时间延长可能加剧。
每一批需要做一个新的空白管。
17)14,000rpm离心10min,以除去细胞碎片。
18)仔细小心转移上清到清洁比色杯中。
注意:
如果上清中若混有细胞碎片,将严重干扰本实验的精确性
19)以空白管在A420校准分光光度计,并且测量在OD420值。
OD420值终在0.02-1.0之间才
会处于线性范围内。
20)计算β-半乳糖苷酶单位,1个单位的β-半乳糖苷酶被定义为每个细胞每分钟水解
1umolONPG为邻硝基苯酚和D-半乳糖所需要的量。
β-半乳糖苷酶活性单位=1000某OD420(t某V某OD600)t=孵育过程中黄色消退的时间(min)V=0.1ml某浓度因子
OD600值=1ml培养基的OD600值注意:
这里的终浓度因子是5(第七步),然而可以试用几个不同的稀释度以确保分析位于线性范围内。
为了减少实验的变异性,需挑5个单独的克隆,每个克隆进行3次试验。
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