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组织培养protocal

水稻成熟胚愈伤组织的诱导、分化、生根及移栽方法

一、转化程序

1、愈伤诱导

（1）将成熟的水稻种子去壳，先用无菌水冲洗3遍，然后用70%的乙醇处理1分钟，不时摇动；

（2）无菌水冲洗3遍，每次30秒，不时摇动；

（3）0.1%升汞溶液消毒12分钟（或2.5%NaCIO消毒30min），不时摇动；

上述步骤可以在超净工作台外面操作，在第（3）步快结束时，用酒精棉球将装有消毒种子的小三角瓶擦拭干净后拿到超净工作台上。

（4）无菌水冲洗5遍以上，每次30秒，不时摇动；

（5）将种子放在灭菌滤纸上吸干水分，然后放在诱导培养基上；

（6）28℃，暗培养4周。

准备工作：

①超净工作台的消毒：

清除台面→75%乙醇喷雾超净工作台→75%的酒精棉球擦拭超净工作台面→将接种所用物品用酒精棉球擦拭干净后放在台面上（酒精灯，打火机，已灭菌镊子，无菌水1瓶，已灭菌的大玻璃杯1个（盛废液），已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）），盛诱导培养基的平皿若干，铺有灭菌滤纸的平皿一个）→打开紫外灯杀菌20-30min，然后打开鼓风机和工作电源，关闭紫外灯，5min后接种；

②接种人员首先用洗洁精洗净双手后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。

如有可能，将胳膊做同样消毒处理。

注意事项：

①在接种过程中要经常灼烧镊子，防止交叉污染；

②尽量在酒精灯下风向的一小块无菌空间操作，尽量避免在接种材料的上层空间活动；

③接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

④培养瓶上贴上标签，标明接种材料和日期。

⑤无菌水需准备2瓶，一瓶在超净工作台外面使用，另一瓶在超净工作台里面使用。

⑥若接种材料出现污染，及时转接培养基。

附注：

2d后水稻种子开始萌发，7-10d即从盾片处产生小块愈伤组织，2周左右愈伤进一步膨大，此时愈伤组织质地较硬，成块状，淡黄色。

2、愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤（即散落到培养基上的愈伤，不要选从种子上发出来的愈伤），放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度28℃。

准备工作：

酒精灯，打火机，灭菌镊子，继代培养基，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

3、预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4-14天，温度28℃。

准备工作：

酒精灯，打火机，灭菌镊子，预培养基，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

4、愈伤与农杆菌共培养

1）农杆菌培养

①在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌两天，温度28℃；

附注:

若农杆菌在4℃或-80℃保存，需活化一次，再预培养2天，以增加浸染效率。

②将农杆菌转移至装有悬浮培养基的带塞试管或离心管里，重悬农杆菌，调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；

准备工作：

LA培养基，悬浮培养基，已灭菌的带塞试管或离心管1个（用于重悬农杆菌），已灭菌三角瓶一个。

2）农杆菌侵染

①将预培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；

②将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

③转移愈伤至灭菌好的滤纸上吹干（30min-1h）；

④然后放置在已铺有一层滤纸的共培养基上培养3天，温度19-20℃。

准备工作：

酒精灯，打火机，灭菌镊子，共培养基，悬浮培养基，灭菌三角瓶一个，铺有灭菌滤纸的平皿一个，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

5、选择培养

①将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；

②灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

③浸泡在含400ppm羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；

④转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干（1h以上）；

⑤转移愈伤至选择培养基上选择培养2次，每次2周。

（第一次羧苄青霉素筛选浓度为400ppm，第二次为250ppm）

朝霉素：

50mg/L

草甘膦：

25mg/L

G418：

50mg/L

准备工作：

酒精灯，打火机，灭菌镊子，灭菌水1瓶，选择培养基，灭菌三角瓶2个（一个用来装愈伤，另一个用来配含400ppm羧苄青霉素的灭菌水），铺有灭菌滤纸的平皿一个，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子），已灭菌的大玻璃杯1个（盛废液）

6、分化培养

①将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天（可省略）；

②转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

准备工作：

酒精灯，打火机，灭菌镊子，预分化培养基，分化培养基，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

附注：

转移到分化培养基上3-4d以后就能在愈伤组织上出现绿点，待苗长至3-5cm后剪取其全部根，然后转移至生根培养基上。

7、生根培养

①剪掉分化时产生的根（留1-2mm）；

②然后将其转移至生根培养基中光照下培养2周，温度26℃。

准备工作：

酒精灯，打火机，灭菌镊子，灭菌剪刀，生根培养基，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

附注：

转移至生根培养基上，1-2d就能长出新根。

8、移栽

待苗高10-12cm，根系发生较好，打开瓶盖，洗掉根上的残留培养基（注意不要伤根），移栽花盆中。

在最初的几天，蒙上保鲜膜，保持水分湿润。

2、培养基配方

1、诱导培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

600ml

700ml

800ml

900ml

1000ml

N6max

（10X）

10ml

20ml

30ml

40ml

50ml

60ml

70ml

80ml

90ml

100ml

N6min

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

7ml

8ml

9ml

10ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

7ml

8ml

9ml

10ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

1.5ml

1.75ml

2.0ml

2.25ml

2.50ml

2,4-D

（1mg/ml）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

1.5ml

1.75ml

2.0ml

2.25ml

2.5ml

Casein

0.03g

0.06g

0.09g

0.12g

0.15g

0.18g

0.21

0.24g

0.27g

0.3g

L-proline

0.2878g

0.5756g

0.8634g

1.1512g

1.4386g

1.7268g

2.0146g

2.3024g

2.5902g

2.878g

Sucrose

3g

6g

9g

12g

15g

18g

21g

24g

27g

30g

Phyta

0.4g

0.8g

1.2g

1.6g

2.0g

2.4g

2.8g

3.2g

3.6g

4.0g

1NKOH调节PH值到5.8，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.4gPhyta，封口灭菌。

最后分装倒入培养皿中。

因诱导愈伤时间较长，平皿尽量倒厚一些。

2、继代培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

600ml

700ml

800ml

900ml

1000ml

N6max

（10X）

10ml

20ml

30ml

40ml

50ml

60ml

70ml

80ml

90ml

100ml

N6min

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

7ml

8ml

9ml

10ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

7ml

8ml

9ml

10ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

1.5ml

1.75ml

2.0ml

2.25ml

2.50ml

2,4-D

（1mg/ml）

0.2ml

0.4ml

0.6ml

0.8ml

1.0ml

1.2ml

1.4ml

1.6ml

1.8ml

2.0ml

Casein

0.03g

0.06g

0.09g

0.12g

0.15g

0.18g

0.21

0.24g

0.27g

0.3g

L-proline

0.2878g

0.5756g

0.8634g

1.1512g

1.4386g

1.7268g

2.0146g

2.3024g

2.5902g

2.878g

Sucrose

3g

6g

9g

12g

15g

18g

21g

24g

27g

30g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

4.8g

5.6g

6.4g

7.2g

8.0g

1NKOH调节PH值到5.8，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

最后分装倒入培养皿中。

3、预培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

600ml

700ml

800ml

900ml

1000ml

N6max

（10X）

5ml

10ml

15ml

20ml

25ml

30ml

35ml

40ml

45ml

50ml

N6min

（100X）

0.5ml

1.0ml

1.5ml

2.0ml

2.5ml

3.0ml

3.5ml

4.0ml

4.5ml

5.0ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

7ml

8ml

9ml

10ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

1.5ml

1.75ml

2.0ml

2.25ml

2.50ml

2,4-D

（1mg/ml）

0.3ml

0.6ml

0.9ml

1.2ml

1.5ml

1.8ml

2.1ml

2.4ml

2.7ml

3.0ml

Casein

0.06g

0.12g

0.18g

0.24g

0.3g

0.36g

0.42g

0.48g

0.54g

0.6g

Sucrose

2g

4g

6g

8g

10g

12g

14g

16g

18g

20g

glucose

1g

2g

3g

4g

5g

6g

7g

8g

9g

10g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

4.8g

5.6g

6.4g

7.2g

8g

1NKOH调节PH值到5.8，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入AS贮存液（100ul/100ml），分装倒入培养皿中。

4、共培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

600ml

700ml

800ml

900ml

1000ml

N6max

（10X）

5ml

10ml

15ml

20ml

25ml

30ml

35ml

40ml

45ml

50ml

N6min

（100X）

0.5ml

1.0ml

1.5ml

2.0ml

2.5ml

3.0ml

3.5ml

4.0ml

4.5ml

5.0ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

7ml

8ml

9ml

10ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

1.5ml

1.75ml

2.0ml

2.25ml

2.50ml

2,4-D

（1mg/ml）

0.3ml

0.6ml

0.9ml

1.2ml

1.5ml

1.8ml

2.1ml

2.4ml

2.7ml

3.0ml

Casein

0.08g

0.16g

0.24g

0.32g

0.40g

0.48g

0.56g

0.64g

0.72g

0.80g

Sucrose

2g

4g

6g

8g

10g

12g

14g

16g

18g

20g

glucose

1g

2g

3g

4g

5g

6g

7g

8g

9g

10g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

4.8g

5.6g

6.4g

7.2g

8g

1NKOH调节PH值到5.8，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入AS贮存液（100ul/100ml），分装倒入培养皿中。

5、悬浮培养基

成分

50ml

100ml

N6max（10X）

2.5ml

5.0ml

N6min（100X）

0.25ml

0.5ml

Fe2+EDTA（100X）

0.25ml

0.5ml

Vitamine（400X）

0.125ml

0.25ml

2,4-D（1mg/ml）

0.1ml

0.2ml

Casein

0.04g

0.08g

Sucrose

1.0g

2.0g

glucose

0.25g

0.5g

调节PH值到5.4，封口灭菌。

使用前加入AS贮存液（100ul/100ml）。

6、选择培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

N6max

（10X）

10ml

20ml

30ml

40ml

50ml

N6min

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

2,4-D

（1mg/ml）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1ml

1.25ml

Casein

0.06g

0.16g

0.24g

0.32g

0.40g

Sucrose

3g

6g

9g

12g

15g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

HN（50mg/ml）

100ul

200ul

300ul

400ul

500ul

CN（50mg/ml）

800ul

1600ul

2400ul

3200ul

4000ul

1NKOH调节PH值到6.0，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入HN和Cef，分装倒入培养皿中。

7、预分化培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

N6max

（10X）

10ml

20ml

30ml

40ml

50ml

N6min

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

6-BA

（1mg/ml）

0.2ml

0.4ml

0.6ml

0.8ml

1.0ml

KT

（1mg/ml）

0.2ml

0.4ml

0.6ml

0.8ml

1.0ml

NAA

（1mg/ml）

20ul

40ul

60ul

80ul

100ul

IAA

（1mg/ml）

20ul

40ul

60ul

80ul

100ul

Casein

0.06g

0.12g

0.18g

0.24g

0.30g

Sucrose

3g

6g

9g

12g

15g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

HN（50mg/ml）

100ul

200ul

300ul

400ul

500ul

CN（50mg/ml）

500ul

1000ul

1500ul

2000ul

2500ul

1NKOH调节PH值到5.9，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入HN和Cef，分装倒入培养皿中。

8、分化培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

600ml

800ml

900ml

1000ml

N6max

（10X）

10ml

20ml

30ml

40ml

50ml

60ml

80ml

90ml

100ml

N6min

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

8ml

9ml

10ml

Fe2+EDTA

（100X）

1ml

2ml

3ml

4ml

5ml

6ml

8ml

9ml

10ml

Vitamine

（400X）

0.25ml

0.5ml

0.75ml

1.0ml

1.25ml

1.5ml

2.0ml

2.25ml

2.50ml

6-BA

（1mg/ml）

0.2ml

0.4ml

0.6ml

0.8ml

1.0ml

1.2ml

1.6ml

1.8ml

2.0ml

KT

（1mg/ml）

0.2ml

0.4ml

0.6ml

0.8ml

1.0ml

1.2ml

1.6ml

1.8ml

2.0ml

NAA

（1mg/ml）

20ul

40ul

60ul

80ul

100ul

120ul

160ul

180ul

200ul

IAA

（1mg/ml）

20ul

40ul

60ul

80ul

100ul

120ul

160ul

180ul

200ul

Casein

0.1g

0.2g

0.3g

0.4g

0.5g

0.6g

0.8g

0.9g

1.0g

Sucrose

3g

6g

9g

12g

15g

18g

24g

27g

30g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

4.8g

6.4g

7.2g

8.0g

1NKOH调节PH值到6.0，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

最后分装倒入培养皿中。

9、生根培养基

成分

100ml

200ml

300ml

400ml

500ml

600ml

700ml

800ml

900ml

1000ml

MSmax

（10X）

5ml

10ml

15ml

20ml

25ml

30ml

35ml

40ml

45ml

50ml

MSmin

（100X）

0.5ml

1.0ml

1.5ml

2.0ml

2.5ml

3.0ml

3.5ml

4.0ml

4.5ml

5.0ml

Fe2+EDTA

（100X）

0.5ml

1.0ml

1.5ml

2.0ml

2.5ml

3.0ml

3.5ml

4.0ml

4.5ml

5.0ml

Vitamine

（400X）

0.125ml

0.25ml

0.375ml

0.5ml

0.625ml

0.75ml

0.875ml

1.0ml

1.125ml

1.25ml

Sucrose

3g

6g

9g

12g

15g

18g

21g

24g

27g

30g

Agar

0.8g

1.6g

2.4g

3.2g

4.0g

4.8g

5.6g

6.4g

7.2g

8g

1NKOH调节PH值到6.0，定容后分装到三角瓶，100ml/瓶，每瓶加0.8gAgar，封口灭菌。

最后分装倒入培养皿中。

3、主要溶液配方

1.N6max母液（10X）

硝酸钾/KNO3----------------------------------------------------28.3g

磷酸二氢钾/KH2PO4-----------------------------------------4.0g

硫酸铵/（NH4）2SO4---------------------------------------------4.63g

硫酸镁/MgSO4·7H2O---------------------------------------1.85g

氯化钙/CaCl2·2H2O---------------------------------------1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2.N6min母液（100X）

碘化钾/KI---------------------------------------------------------0.08g

硼酸/H3BO3--------------------------------------------------------0.16g

硫酸锰/MnSO4·4H2O------------------------------------------0.44g

硫酸锌/ZnSO4·7H2O--------------------------------------------0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3.Fe2EDTA贮存液（100X）

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和FeSO4·7H2O2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入Na2EDTA·2H2O3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4.Vitamin贮存液（100X）

烟酸/Nicotinicacid------------------------------------------------0.05g

维生素B1/ThiamineHCl（VB1）---------------------------