免疫组织化学染色技术常见问题及解答.docx
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免疫组织化学染色技术常见问题及解答
免疫组织化学染色技术常见问题及解答
上海太阳生物技术有限公司
2009年4月
前言
上海太阳生物技术有限公司成立于1996年,是专门从事诊断试剂的生产型企业。
上海太阳生物技术有限公司除了为客户捉供可靠优质的产品外,还十分重视致力于新产品的开发研究以及新技术的推广服务。
近年来,太阳生物技术有限公司在提供产品和服务过程中,不断积累经验,以便更好的服务客户,提高自身品牌形象。
目前,虽然免疫组化技术已趋于成熟和普及,但在临床病理实际应用中,仍存在不少问题,离免疫组化标准化的目标还有很大的距离,影响了病理诊断结果的可靠性。
为此,我们通过阅读文献资料并结合实践积累和体会的一些经验,将免疫组化实验中经常发生的一些不稳定因素和相关知识汇编成册,供免疫组化工作者参考,希望能对大家的工作有所帮助,由于我们自身的水平有限,本册中难免会有不尽如人意之处,敬请读者批评指正,以便今后加以改进。
一、免疫组织化学染色概述
1.什么是免疫组织化学染色?
2.免疫组织化学染色的方法有哪些?
3.几种常用免疫组织化学方法的原理是什么?
4.免疫组织化学技术的优点是什么?
5.免疫组织化学染色中标识物质的选择有哪些条件?
6.免疫组织化学染色成功的关键因素有哪些?
7.怎样设立各种对照?
8.如何选用高敏感免疫组化染色方法?
9.免疫组织化学染色中常见的抗原表达模式有哪几种?
10.免疫组织化学染色结果如何分析?
11.如何选择石蜡切片和冰冻切片的应用?
12.快速冰冻切片免疫组织化学染色的优点是什么?
13.免疫组织化学染色在临床病理诊断中主要用于哪些方面?
二、组织前期处理
14.组织固定不当常由哪些原因引起?
怎样更好地保存组织的抗原性?
15.组织脱水、透明、浸蜡中要注意哪些问题?
16.骨组织的免疫组织化学染色技术要点是什么?
17.免疫组织化学染色中怎样防止脱片?
18.常用的防脱片剂(粘合剂)有哪些?
19.如何才能充分脱蜡?
三、抗原修复
20.什么是抗原修复?
免疫组织化学染色中为什么要进行抗原修复?
21.抗原修复技术的原理是什么?
22.抗原修复的方法有哪些?
23.抗原修复的常用方法有哪些?
怎样操作?
24.抗原修复方法的选择中应注意哪些问题?
四、染色的假阴性和假阳性
25.怎样消除除内源性过氧化物酶?
26.怎样消除除内源性生物素?
27.怎样选择封闭血清?
28.组织切片背景深通常与哪些因素有关?
29.边缘效应产生的主要原因是什么?
怎样解决?
30.怎样解决间质着色的问题?
31.造成假阴性结果的常见原因是什么?
怎样解决?
32.造成假阳性结果的常见原因是什么?
怎样解决?
33.造成阳性染色信号弱的常见原因是什么?
怎样解决?
五、一抗的选择与保存
34.一抗的选择要点和技巧是什么?
35.怎样保存和稀释抗体?
六、显色与复染
36.常用的显色系统有哪些?
37.DAB显色时间如何把握?
38.免疫组织化学染色后为什么要进行背景复染?
复染有哪些方法?
39.苏木素复染的时间如何把握?
一、免疫组织化学染色概述
1.什么是免疫组织化学染色?
答:
免疫组织化学染色(1mmunohistochemicalstaining,IHCS)技术是用己知标记的特异性抗体或抗原对组织内相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测,经组织化学反应,使标记于特异性抗体的酶、金属及荧光素等呈现出某种颜色,并借助于光镜、荧光显微镜及电子显微镜等观察所显示的颜色和变化,从而了解抗原或抗体结合部位和含量的一门新兴检测技术。
它己广泛应用于病理诊断、鉴别诊断和研究之中。
2.免疫组织化学染色的方法有哪些?
答:
(1)按标记物质的种类可分为免疫荧光法、放射免疫自显影法、免疫酶标法和免疫金银法等,相应的标记物为:
荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等。
(2)根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类,可分为:
①直接法:
将标记物与第一抗体(一抗)结合后,直接加到细胞或组织上,在适当条件下,抗体与相应的抗原反应;②间接法:
与(待检物)抗原特异性结合的第一抗体未被标记,而第二抗体(与一抗结合)以荧光素、酶或胶体金标记,有二步法(包括间接法、夹心法、补体法等)和多步法(包括桥连法)。
一步法染色步骤简捷,特异性强,但敏感性较差,且标记抗体适用范围较窄;二步及多步法经抗体放大,敏感性明显提高,标记抗体可一标多用,但染色步骤多、耗时。
3.几种常用免疫组织化学方法的原理是什么?
答:
(1)免疫荧光法:
是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理,先将已知抗体标记上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位,进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断和检验中应用比较广。
(2)免疫酶标法:
是继免疫荧光后,于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用,然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,通过光镜或电镜对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是:
①定位准确,对比度好;②染色标本可长期保存;⑧不需要特殊显微镜,适合于光、电镜观察;④显色反应后可用苏木精等常规染料复染,组织结构显示良好,便于与形态学相结合,使免疫定位准确;⑤显色反应的产物颜色易分辨,且电子密度大,便于光镜及电镜观察;
目前已成为最常用的IHC方法,应用广泛。
免疫酶标方法的发展非常迅速,已经衍生出了多种标记方法,且随着方法的不断改进和创新,其特异性和灵敏度都在不断提高,使用也越来越方便。
目前在病理诊断中广为使用的当属SP法和非生物素系统的聚合物法等。
(3)免疫胶体金法:
免疫胶体金技术是用胶体金颗粒作为示踪物或探针标记抗体,利用抗原抗体反应,从而对细胞内外的或细胞表面的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子予以精确定位。
胶体金是指金的水溶胶,它能迅速而稳定地吸附蛋白,对蛋白的生物学活性没有明显的影响。
因此,用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针,能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位、甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒,且胶体金的电子密度高,所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。
由于胶体金本身呈淡至深红色,因此也适合进行光镜观察,如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4.免疫组织化学技术的优点是什么?
答:
(1)特异性强:
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性。
(2)敏感性高:
采用各种方法保存细胞组织中待检物质的抗原性,采用高亲和力的抗体与标记复合物,并通过多步放大的免疫反应和先进的检测设备,可以从细胞、分子甚至基因水平检测出微量的抗原成分。
(3)多个层面和多个角度的检测技术:
电镜和激光共聚焦扫描显微镜的发展实现了在超微结构上从各个层面和角度观测待检物质,不仅可以对离体标本进行观察,还可对活体细胞组织进行动态观察,使人们在一定时间段观察到某一现象或物质发生发展的变化情况,流式细胞术在免疫细胞化学中的应用使对单个细胞的分离和鉴别成为可能。
(4)定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体及呈色反应,可在组织和细胞中进行抗原的准确定位,因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察,这样把形态与功能结合起来进行研究,对病理学研究的深入具有重要意义。
5.免疫组织化学染色中标识物质的选择有哪些条件?
答:
在免疫组织化学染色法中,标识抗体或抗原的物质须具备以下条件:
(1)用量微小,且容易在光镜或电镜下识别。
(2)被检组织中最好没有与底物相同或类似的物质作为内源性组分存在。
(3)物理或化学性质稳定,与抗体或抗原结合,反应产物必须稳定,不应发生扩散,影响组织学定位。
6。
免疫组织化学染色成功的关键因素有哪些?
答:
(1)抗原性的良好保存。
(2)蜡块的正确选择:
应选出血、坏死少的、最好有内对照的、最具代表肿瘤特异性的区域。
而在日常工作中有些用于免疫组化实验的组织切片根本就不包含所预期检测的组织或细胞。
可能是病理医生选择错了切片或抗体选错了,或是技术员选错了蜡块,这些都直接影响病理诊断的准确性。
(3)实验试剂的选择:
用于免疫组化实验的试剂质量直接影响染色的结果。
所以要选用有信誉的合格厂家,且应对抗体进行预实验以确定最佳的浓缩液效价;抗体的储存也非常重要,每次使用完应及时放回冰箱4℃保存。
(4)第一抗体与免疫组化检测系统的正确配套:
要求被标记的二抗与一抗相匹配,如二抗是羊抗兔的抗体,可以与任一免疫免得到的特异性一抗结合,以检测与特异性一抗才目应的抗原,否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。
最好选用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的二抗。
(5)在操作中每次都应设阳性,阴性对照,并严格按照实验步骤。
(6)选择正确的抗原修复方法,严格控制修复时间及温度。
(7)在整个过程中都不能干片以免造成背景染色。
但也不能残留太多缓冲剂以免稀释抗体的浓度,造成假阴性结果。
(8)酶标抗体系统中的酶与显色剂的合理选用。
(9)实验后的总结工作,找出问题所在,不断加强理论学习及文献资料的学习,尤其是实验室之间的交流。
7.怎样设立各种对照?
答:
理想的免疫组化染色结果应该是特异性好、定位准确、阳性反应与阴性背景对比清晰、细胞结构显示良好。
为了正确判断染色结果,在染色过程中应分别设置阳性和阴性对照。
(1)阳性对照是指用已证实含靶抗原的标本片与待检标本片同时做同样处理染色的组织对照,其目的在于证实免疫组化染色流程的有效性,排除假阴性的可能。
凡阳性标本片得到阳性结果,表明所用抗体和各种试剂以及操作步骤均可靠。
(2)阴性对照是指证实不含靶抗原或缺少免疫试剂的同步处理和标记染色的免疫组化染色对照,包括有阴性组织对照和阴性试剂对照两类
A阴性组织对照:
阴性组织对照是指确知不含有靶抗原的组织(或细胞)标本片和待检标本片同时染色的对照,结果应为阴性,以排除假阳性情况。
B阴性试剂对照:
阴性试剂对照是指用于证实免疫组化染色所用试剂,尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性的同步对照标本片染色,它是每一批免疫组化染色中绝不可缺少的对照设置,目的在于排除假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检标本片阳性结果的可靠性。
这类对照相对较多,共有空白或替代对照/吸收试验对照和抑制试验对照等,常用的为空白或替代对照:
空白或替代对照是指以缓冲液(如PBS、CBS、TBS等)或以第一抗体同源动物未免疫的正常血清(若为小鼠单克隆抗体则可用正常小鼠血清或与本试验无关的其他单克隆抗体)取代第一抗体,其他各步不变的对照染色,结果应为阴性。
必要时还可分别对第二抗体、桥抗体做相应的空白或替代对照试验。
自身对照:
在同一标本片上,靶抗原的阳性反应与其它无关结构或成分的阴性对照结果可形成鲜明对照,称为自身对照。
事实上,自身对照出现于每一次试验、每一份标本片上,无须另加试剂和步骤,目的在于排除内源性干扰产生的假阳性或抗原弥散位移所造成的错误结果。
以上各项对照设置对判断免疫组化染色结果是否正确至关重要,尤其是对某种新的靶抗原的确定更是不可缺少的。
同类靶抗原的重复性后续染色试验中,为了排除每一次所用试剂或步骤方面的人为因素干扰,可只设置阳性组织对照和空白(替代)阴性对照,以节省工作成本。
8.如何选用高敏感免疫组化染色方法?
答:
敏感性高是免疫组化技术的特点之一,即能将抗原抗体结合物特异性的放大。
目前,免疫组化染色方法有一步法、二步法(包括间接法、夹心法、补体法等)和多步法(包括桥连法)。
一步法染色步骤简捷,特异性强,但敏感性较差,
标记抗体适用范围较窄;二步及多步法经抗体放大,敏感性明显提高,标记抗体可一标多用,但染色步骤多、耗时。
由于技术不断地改进和提高,不同公司的试剂盒在特异性和敏感性方面各有特点。
同一种染色方法,因检测试剂盒的不同其敏感性也不同。
检测同一对象,采用不同公司的试剂盒,其检测敏感性也不同。
故病理实验人员应根据各自的需求购买不同公司的试剂盒,并采用相应的敏感度较高的检测方法检测。
9.免疫组织化学染色中常见的抗原表达模式有哪几种?
答:
根据抗原在组织细胞中的阳性颗粒大小和分布部位可分为:
细胞膜型、细胞质型、细胞核型、膜—质型、核—质型、腔缘型等,通常很少出现细胞膜和细胞核同时表达。
免疫组织化学标记中,阳性细胞学特征反应抗原在细胞中定位形式和分布情况。
抗原在细胞中的定位,与目标抗原本身表达部位、细胞分化不同阶段抗原表达的动态变化、肿瘤细胞多向分化时抗原异常表达有关外,还与组织处理不当和抗原特异性不够等因素相关。
在肿瘤免疫组化诊断中,阳性细胞是以拟标记肿瘤细胞为目标细胞,这是判断阳性与否的前提,其阳性表达颗粒必须是定位于该细胞的特定抗原部位。
若阳性颗粒不定位于目标细胞,即阳性颗粒定位于非肿瘤细胞或非目标细胞,不应作为判断依据。
抗原特异性定位主要取决于肿瘤标志物,每一种标志物都有自身的表达定位形式。
多数肿瘤标志物只表现为一种形式,如细胞膜、细胞核或细胞质阳性表达,而少数抗原可表现几种表达形式,如膜—质表达或核—质同时表达。
10.免疫组织化学染色结果判断原则?
答:
免疫组化结果的判断原则主要有以下几点:
①要确定免疫组化染色结果是否合格,首先是背景清晰:
②必须同时设立对照,没有对照的免疫组化染色结果是不可信的;⑧不仅要判断所检组织中有或无阳性标记物,且阳性表达颗粒必须定位于该细胞的特定抗原部位,若阳性颗粒不定位于目标细胞,即阳性颗粒定位于非肿瘤细胞或非目标细胞,不应作为判断依据:
④注意阳性信号的分布部位和形态特征。
一般来说,阳性信号应与被测抗原所在的部位一致;⑤阴性结果不能视为抗原不表达。
由于检测方法的灵敏度有高低之分,有时可因染色方法的灵敏度不够而导致阴性反应,判断时尤应注意;⑥尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达,特别是酶免疫标记。
因为这类阳性着色多系内源性干扰或系人为因素所致:
⑦对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。
11。
如何选择石蜡切片和冰冻切片的应用?
答:
(1)抗原性的保存:
不稳定抗原经过制片等繁杂过程,其抗原性易被破坏,只能用冰冻切片来检测;而抗原性不易丢失的稳定抗原,则可制成石蜡切片。
(2)研究目的:
石蜡切片对组织细胞的定位较准确,有利于标本的长期保存,且组织细胞形态结构保持良好;而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形态结构而造成抗原的弥散,从而定位不准确。
(3)抗原的保真性:
新鲜冰冻切片对抗原的保真很好,而石蜡切片在组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。
(4)操作步骤的繁琐程度:
染色过程冰冻切片简单,而石蜡切片要求脱蜡等前期处理和抗原修复等过程,比较繁琐。
12.快速冰冻切片免疫组织化学染色的优点是什么?
答:
多年来,病理诊断一直是临床医师对疾病明确诊断及制定治疗方案的主要根据。
常规病理是将组织经过前期处理制成石蜡切片经HE染色,借助光镜观察病理组织形态以进行病理诊断。
冰冻切片是借助低温使组织达到一定硬度进行切片的一种常用快速制片方法,被广泛用于术中病理诊断。
其不需要固定、包埋和切片后处理等实验步骤,能很好地保存组织抗原和酶的活性,以用于进一步的研究。
常规免疫组化技术步骤多,耗时长,可能在一定程度上延误了病人的最佳治疗时间。
在临床肿瘤病理快速诊断中,冷冻切片免疫组织化学检测方法检测特异性抗原,将大大缩短检测时间并提高术中病理诊断的确诊率,并在术后可及时对恶性肿瘤进行治疗,从而有效地避免了二次手术及损伤,同时为科研提供了一种新的操作技术,应用前景广泛。
13.免疫组织化学染色在临床病理诊断中主要用于哪些方面?
答:
免疫组化在临床病理诊断中的应用可以归纳为以下几个方面:
(1)标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度;
(2)协助肿瘤良恶性的诊断;
(3)鉴别低分化癌和肉瘤;
(4)鉴别转移癌的性质;
(5)协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶;
(6)鉴别小细胞恶性肿瘤;
(7)癌组织耐药基因的检测;
(8)为癌症患者治疗方案的拟定提供依据;
(9)确定肿瘤组织的增殖活性;
(10)评估癌症患者的预后;
(11)检测病原体。
二、组织前期处理
14.组织固定不当常由哪些原因引起?
怎样更好地保存组织的抗原性?
答:
组织离体后一般15分钟内固定,常温下固定8~24小时。
同时还要注意避免因福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失,一般固定时间不超过24h。
固定时间不足,组织结构不佳,组织抗原弥散;固定时间过长,可封闭或破坏组织抗原。
但在实际工作中很多医院都不能完全做到及时、合理的固定,标本离体后没有及时固定导致组织固定欠佳甚至腐烂;有的基层医院采用95%的酒精固定后放置较长时间才送到上级医院检测,造成组织固缩、变硬。
以上因素会造成抗原的弥散、丢失甚至破坏,以致不能得出正确的免疫组化结果。
因此为了良好保存组织的抗原性,离体组织必须立即得到合理的固定。
固定不当对抗原性有很大的影响,主要表现在三个方面:
一是组织块过大,固定剂未能充分浸透,造成抗原溶解、弥散或丢失:
二是福尔马林固定时间过长,因醛—氨基交联而降低抗原性;三是固定液的种类、浓度和温度对一些特殊原有很大的破坏作用,如浓度超过2%的醛类固定剂、0.4%苯二酮等对5—羟色胺抗原保存不利。
常用的固定液为10%福尔马林液(浓甲醛液:
蒸馏水为1:
9),最好选用10%中性福尔马林液,固定液的量为组织块体积的4~10倍。
手术医生应先将标本切开并将大标本完全浸泡在固定液中,组织块以1.5cm×1cm×0.2cm为宜,切记“取材时组织块宁可面积大,不能厚的原则”(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm,但组织块的厚度不能超过0.2cm,否则将不利于组织的均匀固定)。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛,固定时间为10~20min,对于动物实验研究标本可先采用原灌注固定。
为了保持组织细胞形态的完整性,最大限度的防止抗原丢失,提高免疫组化的阳性率,应提倡山医院药剂科统一配制10%中性福尔马林液供临床科室领用。
在标本取材后,还应在10%中性缓冲福尔马林固定液中补充固定l~小时;另外脱钙液对抗原破坏较为严重,因此脱钙液中酸的浓度与脱钙时间必须尽量控制在一定限度;组织的脱水是组织前期处理的关键步骤之一,应每周更换新鲜的脱水液,取材大小应适宜,薄切以消除脱水不足造成的影响。
组织的脱水、浸蜡、包埋温度不应过高,否则切片时容易碎片。
15.组织脱水、透明、浸蜡中要注意哪些问题?
答:
组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋需掌握的原则:
脱水透明要充分但不能过;浸蜡和包埋时间要充足但温度不能过高。
否则造成组织硬脆使切片困难,即使能切片,也使组织切片不能完好平整,染色过程中极易脱片,对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利,所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长,正常大小的组织无水酒精脱水1h×3次,二甲苯透明lh×2次即可,浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。
16.骨组织的免疫组织化学染色技术要点是什么?
答:
骨组织的免疫组织化学染色技术不同于常规石蜡切片:
(1)骨组织的脱钙:
骨组织石蜡切片在制片前需使用脱钙剂除去骨组织中的钙盐,才能将其制备成4—5µm厚的切片。
目前,常用的脱钙剂主要有单纯酸类(主要有甲酸、硝酸、盐酸、三氯乙酸和硫酸等,尤其是甲酸和硝酸在骨组织的脱钙中应用较多)、混合酸类(主要有甲酸—甲醛脱钙液、甲酸—柠檬酸钠液、Schmort液、VonEbner液、Jenkins液、Plank—Rycho液、Richman液、Jy—I液、Jy—Ⅱ液、Schcidde液等)和螯合剂(主要有乙烯二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠等)。
现使用的脱钙方法有:
①离子交换树脂技术:
②电解脱钙技术:
⑧脱钙机脱钙技术;④低温—微波快速脱钙技术;目前较常用的为低温—微波快速脱钙技术:
此技术能够很好的保存脱钙组织的抗原性,且脱钙时间显著缩短,在骨肿瘤和内耳的免疫组织化学染色观察收到了很好的效果。
其方法如下:
a.取骨及骨肿瘤组织,大小为1cm×0.5cm×0.3cm,用10%福尔马林固定12h、流水冲洗0.5~1h。
b.在1000ml的大烧杯内放入装有500ml冰水的小烧杯。
c.在500ml的小烧杯内放250ml经冰箱预冷的8%硝酸脱钙液,将待脱钙的组织放入其中。
d.将装有脱钙液的容器一起放入微波炉中。
巳用微波2档脱钙,并测量大、小烧杯中液体的温度。
当接近15℃时向大烧杯中添加冰块,或向小烧杯中添加预冷的脱钙液,这样脱钙液温度不会迅速升高,又发挥了微波效应的作用,保证了脱钙液的温度始终控制在15℃以内。
骨组织脱钙时应注意以下几点:
①脱钙时间应根据所用的脱钙剂的不同、骨组织、骨密质、骨松质和组织块的大小等具体情况而确定。
②低温—微波脱钙的关键是保持脱钙液的温度始终控制在15℃以内,尽量减少脱钙液温度过高等人为因素对组织结构、抗原性等的破坏作用。
③骨组织取材不宜过厚,一般应在5mm左右,以免脱钙时间过长造成组织形态结构破坏和染色效果不佳。
④脱钙容器不能使用金属制品,而且脱钙液的用量要充足,一般为标本的20~30倍,其中更换新液1~2次。
⑤骨组织一般应先固定后脱钙,或脱钙、固定同时进行,来经固定的骨组织不宜脱钙,同时脱钙液也不宜加温。
⑥注意脱钙“终点”的鉴定。
脱钙“终点”的鉴定主要有物理检测,X线照射技术和化学检测法。
(2)石蜡切片:
骨组织的石蜡切片法与常规石蜡切片法基本一致,但是固定液和乙醇脱水液的pH值、透明、浸蜡、烤片等过程都可导致抗原决定簇(尤其以构像决定簇)不同程度的破坏,甚至完全破坏、丧失原有的抗原性。
由于骨组织内蛋白含量少,免疫组织化学染色时容易掉片,所以裱片时要应用防脱玻片剂,并用60~℃—65℃烤片1~1.5h。
要进行免疫组织化学染色的标本,需从取材、制片到染色全程都应尽量减少人为因素对抗原性的不良影响。
(3)合理使用抗原修复技术最大程度的恢复抗原性:
由于脱钙处理使骨组织中的抗原性受到很大的破坏,所以免疫组织化学染色时,应用抗原修复技术恢复被破坏的抗原性,提高免疫组织化学染色的敏感性。
大多数抗原用柠檬酸缓冲液(0.Olmol/l.pH=6.0)修复,明显好于蛋白酶消化。
(4)用TritonX-100增加细胞通透性、加快抗体穿透速度,缩短孵育时间:
TritonX-100是一种无离子表面活性剂(俗称清洁剂)。
使用方法是在抗体稀释液中加入0.05%~0.1%TritonX-100,或加一抗前用0.2%~0.4%的TritonX-100,TBS处理切片5~20min。
使用时要注意TritonX-100的浓度不宜过高、时间不宜过长,否则对组织结构有不良影响。
(5)延长一抗与组织中抗原的结合时间,提高免疫组织化学染色质量:
常规免疫组织化学染色时一抗与组织内抗原的孵育时间一般为37℃1h,但骨组织免疫组织化学染色使用上述条件很难获得良好的结果。
较好的方法是加一抗后在冰箱4~8℃过夜(有的甚至需要孵育48h)。
同样二抗也应在37℃温箱中孵育45min,这样才能获得好的免疫组织化学染色结果。
(6)使用金属离子增强
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