松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响.docx
- 文档编号:2992113
- 上传时间:2022-11-16
- 格式:DOCX
- 页数:5
- 大小:20.30KB
松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响.docx
《松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响.docx(5页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响
松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响
【摘要】[目的]研究松花粉对衰老细胞(2BS)内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF1基因mRNA表达的影响。
[方法] 2BS细胞从28代开始培养,随机分成年轻对照组、衰老模型组、松花粉中剂量组、松花粉高剂量(240mg/dl)组。
流式细胞术分析细胞周期,检测G1期比例;半定量RTPCR法测定p16INK4a、p21WAF1mRNA的表达。
[结果]衰老模型组细胞出现典型的细胞体积增大,形态不规则;松花粉处理组细胞,体积回缩,形态趋于规则。
G1期细胞比例松花粉中剂量组(%±%)和高剂量组(%±%)较衰老模型组(%±%)显着下降()。
细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4amRNA的表达量在松花粉中剂量组(±)和高剂量组(±)较衰老模型组(±)表达灰阶明显下调。
p21WAF1mRNA的表达量在松花粉中剂量组(±)和高剂量组(±)较衰老模型组(±)。
[结论]松花粉具有改善细胞衰老的作用,其分子机制可能与下调衰老细胞内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF11mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关。
【关键词】松花粉;细胞衰老;细胞周期;p16;p21
Abstract:
[Objective]Toobservetheeffectsofpinepollenonthechangesofp16INK4aandp21WAF1in2BScells.[Method]The2BScellswereculturedfrom28populationdoubling(PD)anddividedequallyintotheyoungcontrolgroup,oldcontrolgroup,middledosepinepollengroup(120mg/dl)andhighdosepinepollengroup(240mg/dl)thephasesofcellcyclebyflowcytometry,andthentheexpressionofp16INK4a,p21WAF1mRNAweredeterminedbysemiquantitativeRTPCR.[Result]TheamountofcellsinG1phasewasdepressedinmiddledosepinepollengroup(%±%)andhighdosepinepollengroup(%±%)thaninoldcontrolgroup(%±%)noticeablely().Theexpressionofp16INK4amRNAinmiddledosepinepollengroup(±)andhighdosepinepollengroup(±)wassignificantlydecreasedthaninoldcontrolgroup(±,);Thelevelofp21WAF1mRNAinmiddledosepinepollengroup(±)andhighdosepinepollengroup(±)wassignificantlylowerthaninoldcontrolgroup(±,).[Conclusion]Pinepollenhastheantiagingeffectonaging2BScells,thiseffectmaybereactedviadecreasingtheexpressionofp16INK4aandp21WAF1mRNAlevelsinagingcells,andthendownregulatingtheamountofcellsblockinginG1phaseofcellcycle.
Keywords:
pinepollen;cellaging;cellcycle;P16;P21
细胞复制性衰老是目前普遍接受的细胞衰老理论,其最显着的特征即细胞出现G1期阻滞。
在细胞衰老过程中细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子发生表达量的改变。
其中p16INK4a及p21WAF1是细胞衰老诱导途径中的两个关键产物,被称为衰老相关基因[1]。
其表达量与衰老的表型及衰老进程密切相关,作为检测细胞衰老的分子指标应用于衰老相关检测。
松花粉是天然的营养宝库,已有的研究发现,松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞有促进增殖[2],并提高端粒酶活性[3]的作用。
本实验探讨松花粉对衰老2BS细胞中细胞周期及细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF1mRNA表达量的影响。
为研究松花粉抗细胞衰老的分子机制及衰老通路选择提供实验依据。
1材料与方法1材料细胞培养、分组与处理2BS细胞由北京生物制品研究所建株,28代引入。
培养于15%胎牛血清的MEM培养基中,37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中生长。
细胞寿限为60~70代。
至30代时随机取8瓶作为年轻对照组,至56代时随机取24瓶分成衰老模型组、松花粉中剂量组、松花粉高剂量组3组每组8瓶,分别以单纯完全培养基、120mg/dl含花粉血清培养基、240mg/dl的含花粉血清培养基培养8天[3],收集细胞。
配制松花粉血清液,使其终浓度分别为120mg/dl与240mg/dl。
仪器与试剂FACScan流式细胞仪(Beckmancoulter);PCR仪;凝胶成像仪。
类标准胎牛血清购自民海生物,MEM培养基为invitrogen产品。
流式细胞周期检测试剂盒;cDNA试剂盒。
2方法细胞周期测定细胞培养至80%~90%融汇时,彻底收集细胞入15ml离心管,1500rpm,5min离心,去上清得细胞沉淀。
再按细胞周期流式检测试剂盒说明进行操作。
EXPO32ADC软件进行检测,MulticycleforwindowsDNA软件行细胞周期分析。
RTPCR法检测p16INK4a及p21WAF1mRNA的表达p16INK4a、p21WAF1特异基因及βactin内参基因的引物均由上海生工合成。
βactinPCR引物[4]:
上游5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’,下游5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’,扩增片段为500bp;p16INK4aPCR引物[4]:
上游5’ATGATGATGGGCAGCGCC3’,下游5’CGAGGTTTCTCAGAGCCT3’扩增片段为346bp;p21WAF1PCR引物[5]:
上游5’CATTTGGTGGACCCAAAGAC3’,下游5’CCTCCCTTCCCCAAAGTTTA3’,扩增片段为304bp。
RNA提取与测定:
采用Invitrogen公司Trizol试剂提取细胞总RNA。
紫外分光光度计测定其吸光度值并计算RNA浓度。
1%琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。
逆转录反应:
反应总体积为20μl,其中总RNA为5μl,随机引物(oligo(dT))1μl、MMLV200u、RNaseInhibitor40u、10mmol/LdNTPs1μl、/LDTT2μl、5×RTbuffer4μl。
65℃变性5min后,37℃温育50min后,70℃、15min后终止反应。
PCR反应:
反应体系为20μl,分别含cDNA模板μl、TaqEμl、dNTP/L、引物μl、10×PCRBufferμl。
反应条件:
94℃5min,94℃30s,56~62℃30s,72℃40s,35个循环;最后72℃延伸10min。
其中βActin退火温度为62℃;p16INK4a退火温度为56℃;p21WAF1退火温度为56℃。
取6μlPCR扩增产物,2μl上样缓冲液在1%琼脂糖凝胶电泳上做产物检测分析,80V,30min电泳,EB染色,以GELDOC2000型紫外凝胶成像系统拍照,对特异基因条带进行灰度扫描,并对各特异基因/βactin的比值进行分析。
3统计处理测定值以均数±标准差表示,采用软件进行统计分析。
多组间比较方差齐性时行单因素方差分析,LSD方法进行多组间两两比较;方差不齐时,采用非参数分析进行多组间比较,Dunnett’sT3方法进行多组间两两比较,以P≤定为差异有统计学意义。
2结果
细胞周期由表1可见,56代较30代2BS细胞G0/G1期细胞比例增加(),而120mg/dl与240mg/dl含花粉血清培养基处理组细胞均较衰老模型组G0/G1期细胞比例减少()。
表1松花粉对2BS细胞细胞周期的影响
与56代对照组比较,*P≤,**P≤,***P≤;△非参数方法
RTPCR结果
总RNA完整性分析总RNA电泳结果示,4组细胞中提取的总RNA其28S,18S条带完整,OD260/OD280比值为~,证明所提取的总RNA片段完整,无蛋白质污染,可用于RTPCR反应。
图1总RNA电泳图。
年轻对照组;2.衰老模型组;/dl含松花粉血清组;/dl含花粉血清组。
p16INK4a及p21WAF1基因mRNA水平p16INK4a和p21WAF1基因RTPCR产物经%琼脂糖凝胶电泳后,进行灰度扫描分析。
结果显示(图3),120mg/dl(±)与240mg/dl含花粉血清组较衰老模型组中p16INK4amRNA表达量均显着下调。
p21WAF1mRNA表达量在120mg/dl与240mg/dl含花粉血清组较衰老模型组也显着下调。
图2p16,p21基因PCR电泳图年轻对照组;2.衰老模型组;/dl含松花粉血清组;/dl含花粉血清组。
图3p16,p21半定量RTPCR表达量比较
3讨论
细胞周期是细胞生命活动中的基本过程,细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。
细胞周期运转是十分有序的,沿着G1期-S期-G2期-M期的顺序进行,细胞周期具有G1/S与G2/M两个调控点,其中G1/S点是启动细胞周期循环的关键。
细胞衰老最显着的特征是细胞在很长一段时间内仍维持代谢活性,但因阻滞于G1期,失去了对有丝分裂原的反应和合成DNA的能力,不能进入S期。
本研究采用自然衰老2BS细胞模型,观察松花粉的抗衰老作用,结果显示松花粉干预能明显改善衰老细胞出现的G1期细胞阻滞,提示松花粉在体外具有一定的抗细胞复制性衰老的作用。
因此本研究进一步观察了细胞周期调控蛋白p16,p21在此过程中的可能作用。
在衰老细胞中,其细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKI)发生量与活性的变化。
依据激活的CDKI的不同,可将衰老通路分为以下三条[6],包括p16INK4a/RB,p19ARF/p53/p21WAF1,和PTEN/p27通路。
已有大量研究表明在人胚肺成纤维细胞的衰老过程中,p16INK4a/RB和p21WAF1通路发挥着重要作用。
当这些途径所涉及的关键因子发生突变,细胞将延缓衰老或绕过衰老程序继续增殖。
P16是CDK46/D的特异性抑制剂,通过抑制CDK46/D激酶的活性,使RB蛋白保持非磷酸化,减少了转录因子E2F的释放,使细胞内不能表达E2F依赖的G1晚期蛋白,使细胞DNA增殖不能通过G1/S调控点,阻滞在G1期。
P16蛋白在正常生长细胞中表达水平较低[7],但是在细胞多次复制接近衰老时其表达水平逐渐增高[89],2004年Janakir
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 松花粉 人胚肺 二倍体 纤维 细胞 p16 p21 基因 表达 影响
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)