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分子细胞生物学复习
细胞信号转导
细胞信号传递
第一节概述
一、细胞通讯(Cellcommunication)
一个细胞发生的信息通过介质(又称配体)传递到另一个细胞并与靶细胞相应的受体相互作用,然后通过细胞信号转导产生胞内一系列生理变化,最终表现细胞整体的生物学效应的过程。
细胞信号转导是实现细胞间实现通讯的关键过程,它对多细胞生物细胞间功能的协调、控制细胞的生长和分裂、组织发生与形态建成时必须的。
二、细胞通讯方式
1、分泌化学信号的通讯
(1)内分泌
(2)旁分泌
(3)自分泌
(4)通过化学突触传递神经信号
2、细胞间接触依赖性的通讯(细胞间直接接触,通过与质膜结合的信号分子影响其他细胞)
3、间隙连接实现代谢耦联或电耦联
三、信号转导系统及其特征
具有信号识别的特异性,放大作用和信号终止、下调,细胞对信号的整合作用。
四、细胞内信号蛋白的相互作用
细胞内信号蛋白的相互作用是靠蛋白质模式结构域所特异性介导的。
五、信号分子与受体
1、信号分子
(1)物理信号
(2)化学信号:
激素、局部介质、神经递质
各种化学信号根据其溶解性通常分为两类:
①亲脂性信号分子:
甾类激素、甲状腺素
②亲水性信号分子:
神经递质、局部介质、大多数肽类激素(生长因子、细胞因子、内分泌激素)
③气体——NO
2、受体:
是一种能识别和选择性结合某种配体的大分子,主要为蛋白质,多为糖蛋白,少数为糖脂。
根据靶细胞上受体的存在位置,可将受体分为:
(1)细胞内受体
位于细胞质基质或核基质中,主要识别结合小的脂溶性信号分子,为胞外亲脂性信号分子所激活。
(2)细胞表面受体
识别和结合亲水性信号分子;根据信号转导机制和受体蛋白类型不同,分为:
①离子通道耦联受体
②G蛋白耦联受体
③酶联受体(受体酪氨酸激酶、细胞因子类受体超家族、受体丝/苏氨酸蛋白激酶)
④免疫球蛋白超家族
⑤TNF或NGF类受体家族
⑥非受体酪氨酸激酶
受体对信号系统的调节
(1)受体数量的调节
向下调节:
数量减少
向上调节:
数量增加
机制:
受体合成或分解速度变化;
膜受体介导的内吞与受体的再循环;
受体的位移或活性部位的暴露
(2)受体亲和力的调节:
受体磷酸化与去磷酸化
控制信号转导蛋白活性的方式:
①通过配体的调节;
②通过G蛋白调节;
③通过可逆磷酸化调节
六、第二信使学说:
胞外化学物质(第一信使)不能进入细胞,它作用于细胞表面受体,而导致产生胞内第二信使,从而激发一系列生化反应,最后产生一定的生理效应,第二信使的降解使其信号作用终止。
分子开关:
细胞转导过程中通过结合GTP和水解GTP或通过蛋白质磷酸化与去磷酸化而开启或关闭蛋白质的活性。
第二节细胞信号转导通路
一、细胞内受体介导的信号转导
细胞内受体超家族的本质是依赖激素激活的基因调控蛋白。
在细胞内,受体与抑制性蛋白结合形成复合物,处于非活化状态;当信号分子与受体结合,将导致抑制性蛋白从复合物上解离下来,使受体通过暴露它的DNA结合位点而被激活。
类固醇激素诱导的基因活化通常分为两个阶段:
1直接激活少数特殊基因转录的初级反应阶段,快速反应;
2初级反应的基因产物再活化其他基因产生延迟的刺激反应,对初级反应起放大作用。
二、NO作为气体信号分子进入靶细胞直接与酶反应
NO由一氧化氮酶(NOS)催化合成后扩散到邻近细胞,与鸟苷酸环化酶活性中心结合,改变酶的构象,导致酶的活性增强和cGMP合成的增多,cGMP作为第二信使介导蛋白质的磷酸化过程,发挥多种生物学作用。
第三节G蛋白耦联受体介导的信号转导
一、G蛋白耦联受体的结构与激活
G蛋白耦联受体,指配体-受体复合物与靶蛋白的作用要通过G蛋白的耦联,在细胞内产生第二信使,从而将胞外信号跨膜传递到胞内影响细胞的行为。
G蛋白是三聚体GTP结合调节蛋白的简称,位于质膜胞浆一侧,有Gα、Gβ、Gγ亚基组成,Gβ和Gγ亚基以异二聚体存在,Gα和Gβγ亚基分别通过共价结合脂分子锚定于膜上,Gα本身具有GTPase活性,是分子开关蛋白。
当配体与受体结合,三聚体G蛋白解离,并发生GDP与GTP的交换,游离的Gα-GTP处于活化的开启状态,导致结合并激活效应器蛋白,从而传导信号;
当Gα-GTP水解成Gα-GDP时,则处于失活的关闭状态,终止信号传递并导致三聚体G蛋白的重新组装,系统恢复进入静息状态。
二、G蛋白耦联受体介导的细胞信号通路
(1)以cAMP为第二信使的信号通路
(2)磷脂酰肌醇双信使信号通路
(3)G蛋白耦联离子通道的信号通路
G蛋白耦联受体介导离子通道的调控
信号途径
特点:
1.受体/离子通道复合体,四次/六次跨膜蛋白
2.跨膜信号转导无需中间步骤,又称配体门离子通道
3.主要存在于神经细胞或其他可兴奋细胞间的突触信号传递
4.有选择性:
配体的特异性选择和运输离子的选择性
如乙酰胆碱激活的通道,只运输Na+和Ca++,γ-氨基丁酸激活通道只运输Cl-
乙酰胆碱-N受体(260KD)外周型:
5个亚基组成
调节主要为α亚基变化通道开启:
Na+内流,K+外流,膜去极化。
注释:
M-型乙酰胆碱受体(乙酰胆碱的结合引发Giα亚基的活化并与Gβγ解离,k+通道开放,引起质膜超极化)
3、Gt蛋白耦联的光受体的活化诱导cGMP-门控阳离子通道的关闭(图8-25)p245
G蛋白与视紫红质(光受体)耦联,称之为传导素(transductin,Gt)
4.3酶连受体介导的信号传递
一、受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinases,RTKs)
包括6个亚族
信号传导:
配体→受体→受体二聚化→受体的自磷酸化→激活RTK→胞内信号蛋白→启动信号传导
RTK-Ras-Raf信号途径
RTK-PL3K-AKT信号途径
(1)、配体与受体在胞外与受体结合并引发构象改变,因此配体的结合导致受体二聚化;
(2)、当受体二聚化后,激活受体的蛋白酪氨酸激酶活性;
(3)、活化的PTKs可结合带有SH2结构域的结合蛋白或信号蛋白。
SH2\SH3首先在Src蛋白中发现,所以称作Src同源区(Srchomologregion2and3,SH2,SH3)
SH2选择结合在磷酸酪氨酸残基,SH3选择结合在富含脯氨酸基序(motif)
(4)在GEF作用下,无活性的Ras-GDP变成有活性的Ras-GTP
RTK-Ras信号通路
配体→RTK→adaptor→Ras→Raf(MAPKKK)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶→MAPKK→MAPK有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated化修proteinkinase)→进入细胞核→其他激酶或基因调控蛋白(转录因子)的磷酸化。
RTK→GNRP→RAS→RAF→MEK→ERK→Transcriptionfactor→transcription
RTK-PL3K-ATK信号途径
G蛋白耦联受体介导的MAPK的激活
(1)MAPK(Mitogen-activatedproteinkinase)又称ERK(extracelularsignal-gulatedkinase)——真核细胞广泛存在的Ser/Thr蛋白激酶.
(2)MAPK的底物:
膜蛋白(受体、酶)、膜浆蛋白、核骨架蛋白、及多种核内或胞浆内的转录调控因子——在细胞增殖和分化中具有重要调控作用。
(3)PKC、PLC与G蛋白耦联受体介导的MAPK激活
(4)G蛋白耦联受体激活G蛋白:
G蛋白α亚基或βγ亚基激活PLC:
PKC通过Ras或Raf激活MAPK:
(5)PKA对G蛋白耦联受体-MAPK途径的负调控
(6)cAMP↑,MAPK↓:
cAMP直接激活cAMP依赖的PKA:
PKA可能通过RTK或通过抑制Raf-Ras相互作用起负调控作用。
4.4其他信号途径
NF-κB信号转导途径
旁激素信号转导途径(又称生长分化因子(growthanddifferentiationfactor,GDF),由诱导细胞产生,并通过扩散的方式到达邻近的靶细胞)
Hedgehog信号途径
WntPathway
Notch信号转导途径
二、细胞对信号的控制
靶细胞对信号分子的5种脱敏方式:
受体没收:
受体-配体复合物内吞
受体下调:
反应减弱(迟发相)
受体失活:
受体磷酸化:
受体与Gs解耦联,cAMP反应停止并被PDE降解
信号蛋白失活
产生抑制蛋白
细胞周期调控
内容提要
1.细胞周期的概念
2.细胞周期的驱动因子(cyclinandCDK)
3.细胞周期的抑制因子(p21、p27、p15、p16、)
4.细胞周期调控机制
G1期、G2-S、S期、M期(G2-M,中期)
细胞周期的基本概念
细胞增殖周期通常简称细胞周期(cellcycle),是指细胞从上一次细胞分裂结束到本次分裂终了的过程或间隔时间。
根据细胞周期不同时相的特点,可将细胞周期顺序分为4个连续阶段,即G1期(gapphase1)、S期(synthesisphase)、G2期(gapphase2)及M期(mitoticphase).
1、1细胞周期的4个阶段及其与G0期的关系
1、2早期胚胎细胞的细胞周期
早期胚胎细胞周期主要指受精卵在卵裂过程中的细胞周期。
由于卵细胞在成熟过程中已经积累了大量的物质基础,基本可以满足早期胚胎发育的需要,因此早期胚胎细胞周期的G1和G2期非常短,以至认为其仅含有S期和M期。
非洲爪蟾精卵前12个细胞周期共需8h,而其体细胞的细胞周期持续时间约24h。
第一节细胞周期的驱动力量——cyclinheCDK的磷酸化和去磷酸化
细胞周期的程序控制主要通过各种细胞周期蛋白(cyclin)和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(cyclindependentkinase,CDK)有序的磷酸化和去磷酸化从而控制cyclin-CDK复合物的活性来实现的。
在各个阶段还可以分别处理来自细胞内外的各种信息并作出相应的应答。
组成这一自动程控机器的成分还有细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclindependentkinaseinhibitor,CDI)、磷脂酶和泛素(ubiquitin)
哺乳动物细胞周期
不同周期蛋白的表达时期不同,与不同的CDK结合,调节不同CDK激酶的活性。
部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。
细胞受丝裂原刺激后合成cyclin的时序和相对浓度
2、2CDK家族
CDK是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,目前发现有9种成员,有不同程度的同源性,故称CDK家族,各成员命名为CDK1,2,3…9.CDK含催化亚基,但需要cyclin提供调节亚基才有活性。
通常以cyclin-CDK复合物形式出现。
CDK的上游尚有CDK活化激酶(CDK-activatingkinase,CAK)。
CDK也能与CDI结合,而抑制细胞周期。
此外,CDK自身的磷酸化状态与其活性也密切相关,如CDK中的苏氨酸(T)残基和酪氨酸(Y)残基磷酸化,可使CDK激活,而活化的Thr残基发生去磷酸化则使CDK失活。
CDK1CDK1又称cdc2.cdc(celldivisioncyclegene).这些基因在进化上高度保守,如酵母的cdc2与人的踩单车28结构类似,编码产物是相对分子质量为34000的蛋白质,一般表示为p34cdc2/cdc28。
P34对G1/S转换和G2/M转换都是必需的.
P34与cyclinB结合成的复合物是成熟促进因子(MPF)的重要组分,对驱动细胞进入M期至关重要.
1991年冷泉港(coldspringharbor)实验室发起的一次细胞周期研讨会上决定把cdc2命名为CDK家族的第一号,即CDK1.
第一节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDI)
CDI(yclindependentkinaseinhibitor)是CDK的抑制物,通过与CDK非共价结合而抑制CDK活性的,是与cyclin-CDK作用相对抗的重要机制之一,参与细胞周期检查机制。
哺乳动物细胞的才CDI主要包括Ink4、Kip及GADD45等。
Ink4(inhibitor偶发CDK4的缩写)是一族CDK4的特异性抑制蛋白,只特异性抑制CDK4、CDK6.第一个被坚定的成员为p16,其他成员有p15、p18及p19.
Kip即kinaseinhibitionprotein的缩写,包括p21、p27及p57.
P21的功能
1.在G1期p21抑制cyclinD-CDK4、cyclinA-CDK2及cyclinE-CDK2,pRb不能发生磷酸化,细胞停滞于G1期,利于细胞进行修复。
但p21对cyclinB组成的复合物的抑制活性较弱。
P21与p27有协同作用。
2.通过与PCNA结合使PCNA不能与DNA聚合酶δ形成复合物,或使DNA全酶复合物不能在模版DNA单链上滑动,影响DNA的复制。
3.在细胞应激时,p21通过抑制应激激活蛋白酶(stress-activatedproteinkinase,SAPK)的活性,认为p21参与细胞应激状态时的信号转导。
p21蛋白的功能区域示意图
功能:
主要在G1和G1-S期的转变阶段抑制cyclin-CDK活性
通过与PCNA结合影响DNA的“复制”
通过抑制SAPK参与应激时的信号转导
调节:
p53依赖途径(p53作为转录因子启动p21表达)
非p53依赖途径(佛波脂、吖啶橙等可诱导p53-/-人类拜细胞株的p21表达。
3、3内源性增殖抑制因子
抑制因子是细胞中产生的,具有组织特异性的,抑制生长的调节分子,作用于细胞本身。
有人称其为“抑素”。
具有以下性质:
(1)无论在体内或体外,均能抑制有丝分裂,具有组织特异性
(2)无种间差异
(3)制造抑素的组织即是该抑素作用的靶组织
(4)对有丝分裂的作用是可逆的,对细胞无损害作用
3、4蛋白磷酸酶
蛋白磷酸化与脱磷酸化几乎设计所有生理过程:
从胚胎发育到细胞的生长发育、分裂分化、基因表达甚至癌变等。
它是使cyclin-CDK的靶分子去磷酸化的酶,其作用与cyclin-CDK相反。
例如蛋白磷酸酶I(PPI),它在M期使Rb蛋白发生去磷酸化。
PP2A主要在G2/M相过渡和M期的终止时参与一系列磷酸化的过程,组织细胞进入有丝分裂期。
3、5泛素为中介的蛋白水解体系
Cyclin的浓度依细胞周期而变化,其产生取决于mRNA的转录与蛋白质的合成,其降解则需要蛋白水解体系,这种水解是以泛素为中介的。
泛素是高度保守的小分子蛋白。
Cyclin被分解时,先在一种特定的连接酶作用下,泛素链接到cyclin分子特定的位点,然后由依赖泛素的蛋白水解酶的作用,将cyclin连同泛素一起水解掉。
G1周期蛋白也通过类似的途径降解,但其N端没有破坏框,C端有一段PEST序列与其降解有关。
4、CDK1激酶催化不同的底物(主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸),参与细胞的多种功能)
4、1G1期
G0期与G1期早期交界处有一个检查点,决定细胞是停留在静止状态,还是从G0期进入G1期这一检查点,通常称之为限制点(estrictionpoint).G1晚期与S期交界处(表示为G1/S交界处)也有一个检查点,负责检查染色体DNA是否有损伤,如DNA有损伤,则要求细胞先进行修复,然后才能复制,以免遗传信息传递出错。
细胞在通过G1晚期检查点之前一直对各种刺激(生长因子、丝裂原、分化诱导剂等)敏感。
细胞周期调控概况
G1晚期检查点决定是否进入S期,这最终取决于外界环境能否提供增殖信号及细胞内部有无出现障碍。
去除丝裂原后,许多分化的哺乳动物细胞可以从细胞周期退出进入G0期;也有一些细胞停滞于G1期,然后发生凋亡,换句话说,G1期细胞的命运取决于外部信号能否诱导G1期细胞合成D型cyclin等主要调控蛋白。
离子射线可诱导细胞增加表达p53,后者可诱导p21和GADD45表达增强,从而使细胞阻滞于G1后期。
P53突变的细胞经DNA损伤剂处理后,不能休止在G1期,经导入野生型p53,细胞再用电离辐射处理后则变为休止在G1期。
可见p53是在G1/S期执行DNA损伤检查的关键蛋白.p53与染色体的稳定性有关.
G1/S期交界调控示意图
p27——阈值设定者(thresholdsetter)
在G0期,细胞内含有较高而相对恒定浓度的p27而缺少CDK,随着从休止状态借方出来,细胞开始合成cyclin和CDK,并积累cyclinCDK复合物,但它们大多因被p27所结合而失活。
当细胞内cyclinCDK复合物增加到某一临界值后,可将p27完全结合,此时,细胞内游离的cyclinCDK复合物开始积累,细胞周期向S期推进。
4、2S期
S期的主要任务是进行DNA复制与修复,在每一条染色体的DNA分子上,有3种特异的核苷酸序列是复制所必需的,它们是多个复制起点(replicationorgin)、1个着丝粒(centromere)和2个端粒(telomere).真核细胞DNA复制是多点起始、双向复制的,不仅要启动DNA复制而且要关闭复制,以确保每段DNA在一个细胞周期中只复制一次,即S期DNA复制的起始存在“开启”和“关闭”机制。
S期的cyclin/CDK
S期初期主要发生cyclinE和A激活CDK2,两者都是启动DNA复制子所必需的。
继cyclinE激活CDK2后不久,发生cyclinA激活CDK2,且与可测定出的DNA合成同步。
G1晚期阻滞细胞可表达一定水平的cyclinE,但不表达cydinA。
CyclinA的过高表达足可克服S期阻滞。
S期的CDI主要为p21.DNA损伤可诱导p21表达,p21可抑制所有已发现的cyclin-CDK复合物。
在S期p21抑制PCNA参与DNA的复制与修复。
DNA复制的开启与关闭
DNA复制的起始特殊序列,称为复制子(replicator),复制子是否开启,决定于复制子与启动有关的DNA结合蛋白组装成复制复合物(replicationcomplex,RC)及其状态。
起始识别复合物(orginrecognizationcomplex,ORC)ORC由6种多肽组成;自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequence,ARS)与DNA复制起始有关,它与蛋白质结合。
ORC突变可使细胞阻滞于S期。
极可能cdc28可直接激活ORC。
CyclinECDK2或cyclinACDK2与ORC-ARS呈怎样的关机,目前不完全清楚。
CDC6是其中的一个调节因子,在G1期CDC6含量瞬间提高,CDC6结合在ORC上,在ATP供能下,促进6个亚单位构成的MC符合体和其他一些蛋白结合到ORC上,形成前复制复合体(pre-replicativecomplex,pre-RC),MCM实际上就是DNA解旋酶(hellicase)。
S-CDK触发pre-RC的启动,同时阻止了DNA再次进行复制,因为S-CDK将CDC6磷酸化,使其脱离ORC,磷酸化的CDC6随后被SCF参与的泛素化途径降解;S-CDK还可以将某些MCM磷酸化,使其被输出细胞核。
其他一些CDK也参与阻止pre-RC的再次形成,从而保证了DNA的复制当且仅当一次。
ThemechanismscotrollingS-phaseinitiationinanimalcells
1.TheRbproteinactsasabrakeinmammalianG1cells
2.ThecontrolofG1progressionandS-phaseinitiationisoftendisruptedincancercells,Ieadingtounrestrainedcell-cycleandcellproliferation.
PRb及其相关蛋白
G1期CDK的主要作用底物是pRb或pRb的相关蛋白.Rb基因首先从视网膜母细胞癌(retinoblastoma)中鉴定出来,是一种肿瘤抑制基因。
Rb基因失活可促进肿瘤的发生发展。
CyclinDCDK可使pRb磷酸化。
非磷酸化的pRb能结合转录因子E2F使之处于失活状态,从而阻止细胞周期的推进。
E2F
E2F是一类细胞转录活化因子,因首先发现它可激活腺病毒E2启动子而得名。
已发现E2F有5个成员,即E2F-1ˉ5.E2F通常以与其他蛋白质形成复合物的形式存在,只有少数细胞株(如Hela细胞)含有大量游离形式的E2F。
许多DNA合成基因和细胞生长控制基因的启动子中都存在E2F的结合位点,E2F可直接活化这些基因,启动DNA合成,从而使细胞进入S期。
4、3M期
(1)MPF的激活
P34与cyclinB结合及p34的磷酸化是MPF活化的关键步骤.p34的T161磷酸化受CAK(cdc2-activatingKinase)催化完成.PP2A可使磷酸化的T161去磷酸化,从而抑制p34的活性.T161磷酸化使p34处于一种特殊空间构象,适合与cyclinB结合.当p34与cyclinB结合后空间结构发生变化,使T14Y15残基暴露出来,M期之前weel-mikl关联蛋白使之磷酸化,此时cyclinB-p34没有活性.进入M期,cdc25将P34-T14-Y15磷酸基移去,于是MPF激活。
M期的检查点
G2/M期检查点
G2期检查点负责检查DNA复制是否完成.
DNA复制未完成,则可激活weel-mikl蛋白激酶.weel-mikl可使p34的T14-Y15发生磷酸化,MPF失活,细胞阻滞于G2期;DNA复制已完成,则cdc25表达出cdc25蛋白(p54/80),使上的磷酸基被水解掉,MPF呈现活性,细胞进入M期.
4、4M中期末的检查点
M中期末的检查点是指cyclinB灭活机制.其中APC活性变化是认识细胞由分裂中期向分裂后期转化的关键问题之一。
APC各成分在分裂期间中表达,但只有到达M期之后才表现出活性,提示M期CDK活性对APC的活性起着调节作用。
APC活性受到纺锤体装配检查点的监控,纺锤体装配不完全或所有动粒不能被动粒微管捕捉,APC不能激活。
(1995年KING在非洲爪蟾卵种分离出了一种20S的蛋白复合体,称之为APC(后期促进因子)。
在E1、E2、泛素和ATP再生体系存在的情况下,APC可以在体外将cyclinA、B降解)
染色体分离及纺锤体组装检控点的分子机制
在染色体的移动依赖于纺锤体微管蛋白结合在着丝点上的运动。
参与该监测点最重要的2类基因是MAD和BUB。
MAD2和BUB1存在于尚未结合微管的动粒上,这两种蛋白在着丝点上可以探测动力与微管的结合。
Controlofproteolysis:
APCregulatesexitfromMitosisbyProteolysisofM-Cdk(cdk1/cdc2).Thespindle-attachmentcheckpoint:
Unattachedchromosomesblocksister-chromatodseparation.Thesisterchromatidseperationistriggeredbyprotein.
小结:
细胞周期及其调控可简单地比喻为一个高度自动化的机器。
该机器主要由动力系统和制动系统2个部分组成,两者相互协调、相
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