石斛的多糖提取及其多酚物质的抗氧化性研究.docx
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石斛的多糖提取及其多酚物质的抗氧化性研究
目录
1、综述2
1.1铁皮石斛简介2
1.2铁皮石斛国内外研究的进展3
1.3铁皮石斛的育种与繁殖4
1.4本文研究的意义5
2、铁皮石斛的水分测定及其多糖的提取5
2.1水分的测定5
2.2多糖的提取6
3、铁皮石斛乙酸乙酯萃取多酚物质抗氧化性的研究6
3.1铁皮石斛乙酸乙酯萃取母液及浓度梯度的配制7
3.2实验测定原理及方法8
3.2.1铁皮石斛乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基的测定8
3.2.2铁皮石斛乙酸乙酯萃取物清除羟基自由基(·OH)的测定8
3.2.3铁皮石斛乙酸乙酯萃取物清除超氧阴离子自由基(·O2-)的测定9
3.2.4铁皮石斛乙酸乙酯萃取物还原能力的测定10
4、结果与讨论11
4.1对DPPH自由基的清除能力11
4.2对羟基自由基(·OH)的清除能力11
4.3对超氧阴离子自由基(·O2-)的清除能力12
4.3还原能力的测定13
5、结论14
参考文献:
14
铁皮石斛的多糖提取及其多酚物质的抗氧化性研究
专业:
环境科学学号:
200911201066姓名:
许永佳指导老师:
苏小建
内容摘要:
石斛多达五十余种,是市场上常见的名贵中草药和保健品。
研究表明,植物的多糖及多酚含量很大程度决定了它的功效。
本次实验,我们主要用铁皮石斛为主原料,选取水提醇沉法来提取它的多糖并测其含量。
然后用极性较大的乙酸乙酯来萃取获得多酚物质,通过其对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用以及其还原能力的测定,探讨铁皮石斛多酚物质的抗氧化活性,并与人工合成抗氧化剂BHT对自由基清除能力及还原能力进行比较。
实验结果表明:
石斛的多糖含量为4.73%,它的多酚物质具有很强的抗氧化性,优于合成物BHT。
关键词:
铁皮石斛;多糖;抗氧化性;自由基;BHT
1、综述
1.1铁皮石斛简介
铁皮石斛[D-officinale],俗称吊兰,是兰科石斛属植物。
茎,直立,圆柱形,节间披有白色的膜质鞘;叶,纸质,长圆状披针形,尖端钝并钩转,基部有抱茎的鞘;花,白色,生于老茎上部节间,唇瓣菱形,喉部有一紫红色的斑块。
铁皮石斛为名贵草药,药名为黑节草,拥有滋阴润肺、养胃生津、明目清热、增强免疫力、医治失音沙哑、抗衰老等功效。
野生铁皮石斛生于海拔100——3000米之间的山地半阴湿岩石、树皮上,喜温暖湿润气候和半阴湿的环境,不耐寒。
铁皮石斛的鲜茎可直接食用,可炖汤,可泡茶,可浸酒[1],通常加工成制成药品或饮料,如铁皮枫斗、铁皮石斛功能性饮料等。
近年来以其为原料生产的高级保健品远销欧美和东南亚沿海发达地区。
早在1400多年前的《神农本草经》和400多年前的《本草纲目》等古典中药书籍中,就将铁皮石斛列为药材中的上品。
《道藏》则称:
“铁皮石斛、天山雪莲、三两人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、肉苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草为九大仙草”。
由于铁皮石斛的生长环境特殊及其自身繁殖慢等原因,野生铁皮石斛资源稀缺。
目前铁皮石斛主要生长于在中国安徽西南部(大别山)、浙江东部(鄞县、天台、仙居)、福建西部(宁化)、广西西北部(天峨)、四川、云南东南部(石屏、文山、麻栗坡、西畴)。
1.2铁皮石斛国内外研究的进展
通过对有关铁皮石斛的文献资料进行统计(图一),我们可以清楚的发现:
2004年基本是铁皮石斛研究的拐点,在1995—2003这9年中,文献较少,年平均产量为23篇左右;但是在2004—2012这9年中,文献资料竟达到了2051篇之多,年平均产量为228篇左右,后9年的平均产量是前9年的平均产量的近10倍。
另外,1995年前关于铁皮石斛的文献资料是非常少的,基本可以忽略不计。
年限
数量
图一铁皮石斛文献年增长趋势图
表1铁皮石斛的研究内容
研究内容
1989—1993篇(%)
1994—1998篇(%)
1999—2003篇(%)
2004—2009篇(%)
共计
组织培养
5(62.5%)
5(50%)
11(30.6%)
80(40.2%)
101(39.9%)
人工种植
0
0
9(25%)
26(13.1%)
35(13.8%)
种源鉴定
2(25%)
0
5(13.9%)
28(14.1%)
35(13.8%)
化学成分
0
2(20%)
1(2.8%)
26(13.1%)
29(11.5%)
内生菌
1(12.5%)
0
6(16.7%)
20(10.1%)
27(10.7%)
药理作用
0
3(30%)
4(11.1%)
16(8%)
23(9.1%)
综述
0
0
0
3(1.5%)
3(1.2%)
共计
8(3.2%)
10(4%)
36(14.2%)
199(78.7%)
253(100%)
由表1我们可以知道:
对于铁皮石斛的研究大多在它的种植方面,并且这方面效果明显(因为铁皮石斛在种源鉴定方面的论文增长明显)。
此外,在化学成分方面的研究[2—3]为后面相当一段时间内的大趋势,这个在未来是研究的重点。
我们再和图一进行比较,2004年是研究铁皮石斛的大拐点,从这以后的研究基本直线增长。
我国对铁皮石斛的研究基本在它的药理、药性及保健功效方面。
但是,由于近年来科技突飞猛进,我们对铁皮石斛的研究开始涉及到化学、生物等各个方面。
例如:
铁皮石斛生物碱提取纯化研究[4]、铁皮石斛种质资源研究中的DNA条形码初探[5]等。
对于铁皮石斛,它已经超出一般意义上的药物和保健品。
它的化学成分正一步一步被人们所熟知,我们提取它的主要成分用于各个研究领域。
1.3铁皮石斛的育种与繁殖
铁皮石斛现在属于频临灭绝的物种,我们首要的还是要研究它的育种与繁殖问题。
如今,在这方面的研究我们是成果颇丰的,铁皮石斛已经基本转为人工种植了。
我们主要以种子为实验体来进行组织培养,包括种子萌发、原球茎增殖、原球茎分化、生根与壮苗四个步骤。
叶秀麟等[6]取用2——6个月种龄的种子进行组织培养实验后发现,种龄越长,萌发率越高。
当把六个月的种子接入改良后的培养基中培养,萌发率可以达到90%。
曾宋君等[7—8]用相似的方法亦得到基本一致的结论。
除种子作为植物体外,以铁皮石斛的茎尖、茎段、幼叶种胚苗、幼根为外植体,均可培养出组培苗[9]。
大致过程为:
茎尖、茎段→诱导形成不定芽→不定芽增殖→不定芽分化→生根壮苗、形成完整试管苗。
目前浙江、安徽、广西等地都有铁皮石斛的种植基地,他们的品种也是各不相同。
如今的铁皮石斛在全球拥有大概1500多种杂交种,很多品种在抗虫害等方面都有优良性能。
我国较为出名的有“仙斛1号”、“中科3号”、“惠农1号”、“惠农2号”等品种。
1.4本文研究的意义:
多糖具有广泛的生物活性和功能,功能性多糖一般为天然产物提取,多糖的含量直接关系到药物的药性,并且植物多糖的含量和其含水量实密不可分的,于是我们测定了铁皮石斛的含水量并提取测定了其多糖含量。
英国学者Harman1956年创立自由基衰老学说以后,自由基生命科学的研究便日益深入。
自由基(Freeradical)攻击生命大分子造成组织细胞损伤,是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。
自由基是机体的有效防御系统,生物体内常见的自由基有:
超氧阴离子自由基(·O2—)、羟基自由基(·OH)、烷氧基自由基(RO·)等[10]。
摄入抗氧化性物质可有效抵消自由基氧化对人体的损害,但是,目前人们常用的抗氧化剂主要是通过人工合成的,如BHT、叔丁基羟基茴香醚(BHA)等。
人工合成的抗氧化剂会对机体产生一定毒性和致癌作用[11],而一些天然植物含有黄酮类、酸酚等多酚类抗氧化成分。
于是,我们对铁皮石斛的抗氧化性作了研究。
2、铁皮石斛的水分测定及其多糖的提取
2.1水分的测定
取三只烘干的烧杯,编号。
将样品切段后放入烧杯,称量其质量,放入1050C的烘箱中。
等四个小时后取出烧杯冷却称量,再放入烘箱中30min后再取出称量。
表2铁皮石斛含水量的测定
1号样
2号样
3号样
放样品烧杯质量(g)
46.166
55.602
37.319
第一次冷却称量(g)
42.603
50.907
33.290
第二次冷却称量(g)
42.599
50.907
33.288
含水量(%)
71.94%
81.54%
76.91%
平均含水量(%)
76.80%
2.2多糖的提取
多糖的提取[12]首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前是否做预处理。
植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。
我们这里选用溶剂提取法——水提醇沉法。
水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。
多糖为极性大分子化合物,根据相似相溶的原理,提取时我们选用极性强的水、醇为溶剂。
利用植物中大多数成分如生物碱盐、有机酸类、氨基酸、多糖等易溶于水和醇的特性,用水提取,并将其提取液浓缩,加入适当的乙醇反复数次沉降,除去其不溶物质。
由于多糖不溶于乙醇,我们加入80%的乙醇,使多糖从提取液中沉淀出来。
虽说该法提取比较耗时,提取率也不高,但是该法不需要特殊设备,非常适合实验室采用。
实验过程大致如下:
选材称量→切段→榨汁→乙醇回流提取(3—5次)→粗纤维与多糖细浆分离(过80目和50目筛子)→旋转蒸馏→回收→多糖浸膏。
铁皮石斛样为403.161g,得到的浸膏为19.088g,多糖的获得率为4.73%。
3、铁皮石斛乙酸乙酯萃取多酚物质抗氧化性的研究
3.1铁皮石斛乙酸乙酯萃取母液及浓度梯度的配制
称取铁皮石斛乙酸乙酯提取物0.5g,溶于95%乙醇溶液,并用乙醇定容至100mL容量瓶,取10个10mL容量瓶,分别配制成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL浓度梯度的乙醇样液。
主要试剂的配制
DPPH溶液(0.008mg/ml):
称取DPPH粉末0.002g,用乙醇定容于250mL棕色容量瓶中,避光保存,现配现用。
pH=7.4磷酸缓冲溶液:
称取磷酸二氢钠0.7800g,蒸馏水定容于25mL容量瓶中;称取磷酸氢二钠7.1628g,用蒸馏水定容于100mL容量瓶中;分别从中移取19mL和81mL于100mL容量瓶中。
H2O2(0.01%):
移取30%的过氧化氢0.25mL,用蒸馏水定容至25mL容量瓶中。
用水再稀释30倍。
邻二氮菲(0.75mmol/L):
称取邻二氮菲粉末0.0149g,用乙醇定容至100mL容量瓶中。
硫酸亚铁氨(0.75mmol/L):
称取硫酸亚铁氨0.0294g,用蒸馏水定容于100mL容量瓶中。
盐酸(0.1mol/L):
移取2.12mL浓盐酸用蒸馏水定容至250mL容量瓶中。
Tris-HCl缓冲液(pH=8.0,0.05mo1/L):
称取三羟甲基氨基甲烷2.4228g,用蒸馏水定容至100mL,并从中移取27.5mL与25mL0.1mol/L盐酸混合,用蒸馏水定容至100mL容量瓶,避光保存。
盐酸(10mmol/L):
移取10mL0.1mol/L盐酸,用蒸馏水定容至100mL容量瓶中。
邻苯三酚溶液(2.5mmol/L):
称取0.0316g邻苯三酚用10mmol/LHCl溶液溶解后定容至100mL,避光保存。
pH=6.6磷酸
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- 石斛 多糖 提取 及其 物质 氧化 研究
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