不同激素处理对银条根生长发育的影响剖析.docx

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不同激素处理对银条根生长发育的影响剖析

不同激素处理对银条根生长发育的影响

摘要

银条（StachysfloridanaSchuttl.exBenth），又名地灵，系唇形科水苏属多年生蓄根草本植物，其地下根状茎圆状细长，肉质洁白，酷名银条似白银，故；据传是唐僧取经过程中所得，又被誉为“唐僧肉”。

目前，全国人工种植面积很少，洛阳偃师县（市）是主要产地，约占全国产量的95%，仅春节左右大量上市，同时远销国内外，在市场上常供不应求[2]。

本研究通过对银条根部分化的培养条件、不同处理对提高生根率的效果进行了研究，并利用不同外植体探讨了银条再生快繁的适宜途径。

目的是获得脱毒种株并进性大量、快速的繁殖，以解决生产中银条由于结籽率低，且难以培养成苗，长期以根状茎进行无性繁殖所造成的病毒累积的问题，并为进一步进行银条的营养利用、生理代谢、生物育种研究奠定基础。

试验结果表明：

银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。

茎段在MS+0.2mg/LNAA+活性炭3%的培养基中有最佳的生长状态，在较高的NAA或IBA浓度下，茎段下端愈伤样化严重，不定根产生量少，在IBA的作用下，银条茎叶纤弱不利于移栽成活。

在MS+0.2mg/LNAA的培养基中，茎段生根量大，根型良好，茎叶粗壮，加入活性炭后，根的长度进一步增长，呈乳白色，移栽成活率达90%以上。

关键词：

银条茎段不定根植株再生MS培养基

StachysfloridanaMreistemCultureandPlantletRegenerationofVenomTissueRemoval

ABSTRACT

Stachysfloridana,alsoknownasLing,LamiaceaeStachysisabuildrootperennialherb,itsundergroundrhizomesroundedslender,whitemeat,resemblessilver,hencethenameStachysfloridana;AccordingtolegendJourneytotheWest.,alsoknownasthe"officialtoldus.Theplantedareararely,LuoyangYanshicounty（city）isthemainproducer,accountingforabout95%ofnationaloutput,alargenumberoflistedonlyaroundtheSpringFestival,andsoldathomeandabroad,ofteninshortsupplyinthemarket.Inthisstudy,onStachysfloridanaapicalmeristemcultureconditions,differenttreatmentstoimprovetheeffectofshoottipsregeneratedplantsdetoxificationrateanddifferentexplantssuitablewaytoexploretheStachysfloridanarenewablerapidpropagation.

Theresultsshowed:

SilverCulturedwithMSasbasicculturemediumwasthemostsuitableregenerationseedlinggrowth,rapid,robustplants.StemsgrowbestintheculturemediumMS+0.2mg/LNAA+3%ofactivatedcarbon,thehigherNAAorIBAconcentration,thelowerendofseriousstemscallus,adventitiousrootsproducedinsmallamounts,inthepresenceofIBA,silverleafdelicateisnotconducivetothetransplantingsurvival.IntheculturemediumwithMS+0.2mg/LNAA,stemsegmentlargerquantityrooting,root,stemandleafstout,addingactivatedcarbon,rootlengthincreased,milkywhite,thetransplantingsurvivalratereachedmorethan90%.

Keywords:

Stachysfloridana，Stemsegment，Adventitiousroot，Plantregeneration，MSmedium

缩写词

英文

中文名称

cm

Centimeter

厘米

d

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小时

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分钟

s

Second

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Gram

克

mol/L

PorLitreMoore

摩尔每升

mg/L

PorLitermilligram

毫克每升

MS

MSmedium

MS培养基

Lx

Lux

勒克斯

2,4-D

2,4-DiehlorophenoxyaceticAcid

2,4-二氯苯氧乙酸

6-BA

6-Benzylaminopurine

6-苄氨基嘌呤

NAA

α-NaphthaleneaeeticAcid

萘乙酸

IAA

Indole-3-aceticacid

吲哚乙酸

KT

Kinetin

6-糖基氨基嘌呤

第一章前言

银条（StachysfloridanaSchuttl.exBenth），又名地灵，系唇形科水苏属多年生蓄根草本植物，其地下根状茎圆状细长，肉质洁白，酷似白银，故名银条；据传是唐僧取经过程中所得，又被誉为“唐僧肉”。

银条作为功能性食品具有很高的药用价值，对治疗高血压、高血脂和肥胖等常见疾病有着显著疗效。

近年来，我国专家首次发现银条内含有丰富的水苏糖，并证明其水苏糖的含量比国际上通用的大豆原料提取的含量要高出2～3倍，而水苏糖能迅速改善人体消化道内环境，调节微生态平衡，可软化血管、降低血脂、改善血液循环具有独特的功效，还具有润肺、益肾之功效，其益寿延年的作用非常显著，是目前国际上非常畅销的保健药品之一[1]。

银条还具有独特的食用价值，其肉质脆嫩，无纤维、可盐渍和凉拌等，风味独特，2001年6月上海APEC会议，六国首相品尝后称其为“世界奇菜”。

银条主产于华北和新疆等地，处于半野生状态，喜温暖和湿润的气候，对土壤要求较严格，需有水而不湿、有沙而不松的沙白土。

目前，全国人工种植面积很少，洛阳偃师县（市）是主要产地，约占全国产量的95%，仅春节左右大量上市，同时远销国内外，在市场上常供不应求[2]。

1.1银条的生产现状与价值

1.1.1银条的形态特征及生产现状

偃师银条根系较浅．地上茎直立。

株高59～70cm。

叶对生。

叶卵圆形，绿色。

花紫色。

轮伞花序。

花期5～6月份。

地下有膨大的根状甸甸茎，根状茎侧生有具鳞叶。

质地细密、嫩脆多汁、色白、味甘。

果实为小坚果，含1粒种子，黑色。

卵圆形或长卵圆形[9]。

偃师银条现种植面积400hm，产量1万t，占国内银条产量的95以上，每667m银条能为当地农民带来4000~6000元收入。

偃师银条种植面积受市场销售量影响较大，产品销售旺时，种植面积达700hm，产量2万t，常年种植面积400hm左右，产量1．1万t左右。

偃师银条集中种植在城关乡、三化乡，城关乡的后庄、东寺庄、西寺庄等沿河一带生产的银条质最好，被定为“河南省无公害农产品种植基地”。

偃师市银条加工企业现有14家，有5家银条生产企业通过IS09001国际质量体系认证。

其中西银公司等三家企业在国家商标局注册了商标，并获国家标准化管理委员会和河南省质监局颁发的“无公害产品标志”证书，产品销往北京、上海、广州等32个大中城市，出口到日本、韩国、新加坡、泰国、俄罗斯等8个国家和地区。

在第二届中西部国际博览会上，偃师银条获2项金奖，5家参展企业的产品被抢购一空，签订合同订单1万t[8]。

1.1.2银条的食用价值

银条菜富合蛋白质、脂肪、碳水化合物和氨基酸，是食用和药用兼备的名特蔬菜品种。

对人体有多种保健效果，延年益寿作用明显，在《中国蔬菜品种志》中已有详细的记载。

河南偃师地区的“偃师银条”最为有名，具有悠久的食用历史。

它富含一种被世界食品医药界誉为“健康宝贝”和“超强双歧因子”的物质-水苏糖。

作为天然四糖的水苏糖，简单的结构表示为半乳糖-半乳糖-葡萄糖-果糖。

是功效最优越的益生元，是已获得美国FDA认证的寡糖产品。

添加水苏糖的食品，因为具有抗衰老、健康防病的功效，日渐风靡于日本和欧美市场。

据现代科学测定：

银条富含糖类、酚类、维生素C、粗蛋白、氨基酸、有机酸等物质，对软化血管、降低血脂、改善血液循环具有独特的疗效[6]。

1.2植物组织培养的快繁技术及应用

1.2.1组织培养技术简介

自从1943年怀特（White）提出植物细胞“全能性”（Totipotency）学说及诸多后学者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相继证实后，引发植物组织和细胞培养快繁技术的勃然兴起。

我国的专家学者在20世纪70年代后也在此领域做了大量的研究和开发工作，创造了很多新方法、新技术，提出不少新成果，开拓了植物组织培养快繁技术的新局面。

脱毒株苗具有无杂菌、繁育较快、质量优、繁殖系数高、大批量生产、便于运输等优点，已得到有关专家的鉴定及高度评价。

例如脱毒马铃薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓、苗木、花卉等等都是运用组培脱毒技术得到的。

植物组织培养（Planttissueculture）是指在无菌的条件下，将离体的植物（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。

由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。

植物组织培养脱毒快繁是人工在无菌条件下利用植物体的一部分，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物，脱除病毒得到无毒苗株，继而在大田快速繁殖的技术。

脱毒主要是进行茎尖培养脱除病毒，它是现代生物技术中植物组织培养和细胞工程中的一项具有重要应用价值的技术。

对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺物种、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，繁殖比传统的方法高达数百倍以上。

植物脱毒技术的利用及脱毒良种的推广，带来一场新的农业技术革命。

通过脱毒，使作物恢复种性，增强抗性，生长健壮。

1.2.2唇形科相关植物的组培及根诱导介绍

冬凌草RabdosiaRubescens（Hcnsi）Hara又名冰凌草,属唇形科香茶菜属，多年生草本或亚灌木植物，主要分部在我国河南、四川、安徽等中西部地区以MS为基本培养基，运用正交设计方法，利用植物组织、细胞培养技术，成功地建立了冬凌草的组织培养快繁技术体系。

研究出：

不定芽诱导的最适培养基为MS＋0.2mg·L-1IBA＋0.1mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA；生根培养基为1/2MS+1mg·L-1IBA+1g·L-1活性炭；以冬凌草茎段为外植体诱导愈伤最佳培养基为MS+1.5mg·L-16-BA+2mg·L-12,4-D无菌苗的增殖快繁培养切取含2个腋芽的无菌苗茎段，长约1～1.5cm，采用L9（34）正交设计法，正交设计表头见表2.1，以MS为基本培养基,添加不同浓度IBA、NAA和6-BA激素配比的9种培养基，每种培养基接种30株，每瓶3株，重复3次。

培养条件：

温度为（25±2）℃，光强2000lx光照时间13h/d，培养周期为30d。

根的诱导,挑选经1.2.2步骤获得的长势较好且长度超过5.0cm的无菌试管苗，分别以1/2MS、MS和2MS为基本培养基，添加不同浓度的IBA和NAA激素，每种培养基接种10瓶，每瓶3株，重复3次。

培养条件同上，培养时间20d.不同激素配比对生根的影响冬凌草试管苗接种到生根培养基上20d后，将其取出洗净根部培养基，记数生根情况，结果见表2.4，从表2.4可以看出1号培养基的生根率最高，达到100%，2号和4号培养基生根率虽然也很高达到90%以上，但是根长和根数都没有1号培养基中的好，而且1号培养基中小苗长势较好。

并且通过极差分析得出，三个试验因素影响的主次是：

活性炭>IBA>基本培养基，而且当活性炭的量达3g·L-1时效果最好，因此诱导生根的最佳培养基是：

1/2MS+1mg·L-1IBA+1g·L-1活性炭。

从方差分析可以看出，活性炭对冬凌草生根影响达到显著水平（P值<0.05），其他两个因素影响不大，作用不显著[11]。

唇形科鞘蕊花属彩叶草（Coleusblumeibenth）．彩叶草不定芽的最适生根培养基是1/2MS+0.5mg/LNAA组合，其平均生根率为92.5%[12]。

1.2.3脱毒材料的保存快繁

银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。

茎尖分生组织培养在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖4％+琼脂6.5g/L上，成苗率可达74.1％，最适宜茎尖的培养；经指示植物法、电镜观察检测，再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低[13]。

0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，分别为71.4％、30.0％，较为适合培养；茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。

植株在42℃高温下，经15d热处理后，0.5mm大小茎尖切割培养成苗率与脱毒率分别达到50.0％、57.1％，重复切割培养3次后则分别为28.6％、87.5％。

为减小操作难度，缩短周期，银条植株经42℃，15d热处理后，切取0.5mm大小茎尖进行一次培养较为适宜。

不同生育时期的外植体愈伤组织的诱导能力不同，刚展开的幼嫩叶片、粗壮的幼嫩茎段及花蕾长度在0.5cm左右时的花药最适宜愈伤的诱导，诱导率最高。

幼嫩茎段与花药在MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+IAA0.5mg/L培养基上，幼嫩叶片在MS+6-BA2.5mg/L+NAA1.5mg/L+IAA1.0mg/L上，愈伤组织诱导效果最好，愈伤生长快速，颜色鲜艳，继代培养不褐化。

愈伤组织不定芽的分化中，花药诱导形成的愈伤难以形成不定芽；叶片与茎段诱导的愈伤可以在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.8mg/L+GA_32.0mg/L上分化形成不定芽，诱导分化率分别为71.4％、78.6％。

对幼嫩叶片、幼嫩茎段与茎尖进行不定芽的直接诱导与增殖，发现银条叶片组织未能再生；茎尖、茎段组织直接诱导较大不定芽的再生率较低，平均每个外植体最多可诱导不定芽5～7个。

而通过茎段先诱导出不定芽芽团，再进行芽的伸长这一途径，每个外植体诱导的不定芽数平均可提高到14.3个，且芽团经5次继代增殖再生能力没有衰退表现，再生植株生产潜力非常巨大，是一条较优的再生途径。

茎段不定芽芽团诱导培养基为添加6-BA5.0mg/L的MS培养基;增殖培养基为MS+6-BA4.5mg/L;不定芽伸长培养基以MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.4mg/L较好。

对不同温度、光照条件、以及蔗糖、6-BA浓度对离体培养条件下银条根状茎诱导的影响进行研究表明:

全黑暗的培养条件是银条根状茎诱导的必需因子，短日照与长日照均促使甸旬茎发育成侧枝;高浓度蔗糖有利于根状茎的诱导，单独使用低浓度的蔗糖（3%）不能诱导根状茎产生而形成黄化的侧枝，再添加6-BA5..0mg/L后虽然可以形成根状茎，但单株产量很低。

6-BA对根状茎形成具有明显的促进作用，能增加根状茎数，提高单株产量。

银条根状茎的诱导温度以20℃为宜，提高温度会降低根状茎数[23]。

1.3银条的研究现状

1.3.1银条茎尖玻璃化法超低温保存及其植株再生

为长期稳定保存银条种质,建立了玻璃化法超低温保存其茎尖的技术体系。

选择继代4次的银条无菌壮苗,5℃低温驯化14d;剥取5mm的茎尖,在含有0.5mol.L-1蔗糖的MS（无Ca2+）液体培养基预培养1d;25℃条件下经改良MS+2PVS2装载20min;在-20℃,95%乙醇浴中以PVS2脱水处理4h;更换新鲜的PVS3后投入液氮,保存24h后取出冷冻管在40℃水浴中化冻1min;以含有1.2mol.L-1蔗糖的改良MS（无Ca2+）溶液洗涤2次,每次10min;冻存后的茎尖相对存活率超过70%。

将冻存后的茎尖转接到再生培养基上,暗培养20d后转入正常光照条件下培养,存活率达63.7%;继续培养得到正常分化和生长的再生植株,生根后可移栽成活。

1.3.2关于银条的茎尖分生组织的脱毒及再生

以“二细一粗”银条作为研究试材，对银条茎尖分生组织的培养条件、不同处理对提高茎尖再生植株脱毒率的效果进行了研究，并利用不同外植体探讨了银条再生快繁的适宜途径。

目的是获得脱毒种株并进性大量、快速的繁殖，以解决生产中银条由于结籽率低，且难以培养成苗，长期以根状茎进行无性繁殖所造成的病毒累积的问题，并为进一步进行银条的营养利用、生理代谢、生物育种研究奠定基础。

试验结果表明：

银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。

茎尖分生组织培养在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖4％+琼脂6.5g/L上，成苗率可达74.1％，最适宜茎尖的培养；经指示植物法、电镜观察检测，再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低。

0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，分别为71.4％、30.0％，较为适合培养；茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。

植株在42℃高温下，经15d热处理后，0.5mm大小茎尖切割培养成苗率与脱毒率分别达到50.0％、57.1％，重复切割培养3次后则分别为28.6％、87.5％。

为减小操作难度，缩短周期，银条植株经42℃，15d热处理后，切取0.5mm大小茎尖进行一次培养较为适宜。

不同生育时期的外植体愈伤组织的诱导能力不同，刚展开的幼嫩叶片、粗壮的幼嫩茎段及花蕾长度在0.5cm左右时的花药最适宜愈伤的诱导，诱导率最高。

幼嫩茎段与花药在MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+IAA0.5mg/L培养基上，幼嫩叶片在MS+6-BA2.5mg/L+NAA1.5mg/L+IAA1.0mg/L上，愈伤组织诱导效果最好，愈伤生长快速，颜色鲜艳，继代培养不褐化。

愈伤组织不定芽的分化中，花药诱导形成的愈伤难以形成不定芽；叶片与茎段诱导的愈伤可以在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.8mg/L+GA_32.0mg/L上分化形成不定芽，诱导分化率分别为71.4％、78.6％。

对幼嫩叶片、幼嫩茎段与茎尖进行不定芽的直接诱导与增殖，发现银条叶片组织未能再生；茎尖、茎段组织直接诱导较大不定芽的再生率较低，平均每个外植体最多可诱导不定芽5～7个。

而通过茎段先诱导出不定芽芽团，再进行芽的伸长这一途径，每个外植体诱导的不定芽数平均可提高到14.3个，且芽团经5次继代增殖再生能力没有衰退表现，再生植株生产潜力非常巨大，是一条较优的再生途径[24]。

1.3.3银条加工中烫漂护色工艺的研究

郭香凤，史国安以银条为实验材料，以成品的褐变度为指标，对银条加工中烫漂护色工艺参数进行了研究。

实验结果表明：

在95℃烫漂温度下，烫漂3．0min，最佳褐变抑制剂组合为0．05％L-cys、0．05％VC、1％CA，产品的外观色泽洁白；不同抑制剂抑制银条褐变作用的顺序是CA>L-cys>VC。

单独使用各种物理和化学抑制措施时，在95℃温度下，热烫3．0min，或分别在烫漂水中添加1％CA、0．05％L-cys、1％亚硫酸氢钠时护色效果显著。

单独使用抗坏血酸对银条护色效果不显著。

鉴于亚硫酸氢钠的副作用，建议银条加工过程中应避免其危害[20]。

银条采后加工过程中发生的褐变主要是由酶促褐变引起的。

单独或复合使用烫漂、柠檬酸、L．半胱氨酸等酶促褐变抑制措施对防止银条的褐变是有效的[3]。

1.3.4银条根茎膨大过程中生理生化变化的研究

张书玲，刘建凤以银条为材料，探讨了银条根状茎中维生素C（VC）、抗坏血酸氧化酶（AAO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）在其根茎膨大时期含量的积累变化。

结果表明：

在根茎开始膨大60d后，VC含量最高达61rag／100g；AAO酶活性在根茎膨大后30d达最大值0．147rag／g；SOD和POD酶活性在银条根茎膨大后75d达到最高值为9．O5U／mg和l3．6Onmol·min-1·g-1；PPO在根茎膨大过程中出现上升一下降一上升的趋势[9]。

银条根茎含有丰富的VC，特别是在根茎膨大中后期VC含量达到最大值。

根据各国对成年人推荐的VC日摄人量，每日只需食用100~200g的银条就能满足人体的需要。

VC含量在根茎膨大后75d出现稍微下降现象，可能是因为霜降后地上部分开始枯死导致。

所以，在霜降前（10月中下旬）采收银条会含有较高的VC。

同时抗坏血酸氧化酶（AAO）和抗坏血酸过氧化物酶是VC代谢过程中主要的氧化分解酶u。

在植物细胞内，VC的含量受这2个酶的影响。

所以VC的含量和抗坏血酸氧化酶的活性大致相反而不会完全相反[1]。

植物在生命过程中会产生活性氧（包括过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基和单线态氧等），而组织衰老的机理多归于超氧自由基引起的膜脂氧化与过氧化的损害。

SOD、POD是植物抗氧化酶系统中2种重要的酶。

它们在活性氧的清除、抑制膜脂过氧化等植物抗逆生理方面发挥作用。

随着银条根茎的生长，在膨大后60d（11月上旬），银条的SOD和POD活性迅速上升，可能是因为霜降以后，天气逐渐变冷，在逆境下植物产生更多的氧自由基，加剧膜脂过氧化，SOD和POD酶活性的上升，是植物细胞对低温逆境的一种保护性应激反应。

另外，PPO能催化各种酚类物质氧化成为醌，再聚合成黑色素，并随时间的延长而逐渐变黑，是果蔬的储藏和加工过程中引起褐变的主要酶类，从而降低果实色泽和品质[27]。

银条在生长的不同成熟期PPO的活性不同，在膨大后30～45d（9月下旬至l0月上旬）时PPO的活性较低，随后缓慢上升，可以利用这个时期加工银条，以提高其抗褐变作用[28]。

1.3.5银条组培研究

为给草食蚕（银条）的快繁研究提供参考，以草食蚕无菌苗为材料，比较研究不同激素配比条件下不同外植体愈伤组织的诱导及植株再生。

结果表明，草食蚕无菌苗叶片、叶柄和茎段均可作为离体培养的外植体，但叶柄效果最好。

将外植体接种于添加6