PGM测序方法.docx
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PGM测序方法.docx
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PGM测序方法
314芯片测序方法
文库构建:
PCR扩增基因组DNA的目标区域
1.选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。
对每一个DNA和引物池的混合,将以下组分加入PCR管内。
以下表格提供了包含和未包含IonAmpliSeq?
SampleIDPanel的反应体系。
对多个反应可准备配置混合溶液。
2X引物池(Cat.nos.4477685,4477686,andcustompanels)
成分
不包含IDpanel(ul)
包含IDpanel(ul)
5XIonAmpliSeq?
HiFiMix
4
4
2XIonAmpliSeq?
PrimerPool
10
10
可选:
20XIonAmpliSeq?
SampleIDPanel
--
1
gDNA,10ng
Y
Y
Nuclease-freeWater
6-Y
5-Y
总体积
20
20
5X引物池(Cat.nos.4471262and4475346)
成分
不包含IDpanel(ul)
包含IDpanel(ul)
5XIonAmpliSeq?
HiFiMix
4
4
5XIonAmpliSeq?
PrimerPool
4
4
可选:
20XIonAmpliSeq?
SampleIDPanel
--
1
gDNA,10ng
Y
Y
Nuclease-freeWater
12-Y
11-Y
总体积
20
20
2.充分震荡,简单离心。
3.将PCR管置于PCR仪内,运行一下程序以扩增基因组上目标区域。
阶段
步骤
温度
时间
持续
酶活化
99℃
2分钟
循环数(根据下表格设置)
变性
99℃
15秒
退火/延伸
60℃
4/8/16*分钟
持续
--
10℃
持续+
*4分钟是对≤1536对引物池;8分钟是对1537-6144对引物池;16分钟是对6145-24576对引物池。
+PCR产物可置于10℃过夜储存。
引物对数目
循环数
标准DNA
石蜡包埋DNA
12-24
21
24
25-48
20
23
49-96
19
22
97-192
18
21
193-384
17
20
385-768
16
19
769-1536
15
18
1537-3072
14
17
3073-6144
13
16
6145-12288
12
15
11
14
注意:
Ready‐to‐usepanels:
当加入IonAmpliSeq?
SampleIDpanel时不需要调整循环数。
Customprimerpools:
如果一个custom设计的panel中包含两个引物池,并分别落在不同的循环数分类中,请选用更大的循环数来扩增这两个引物池。
一般标准样品可以增加一个循环,从而保证其扩增效率,石蜡切片样品可增加2-3个循环。
如果引物池有两管及以上,应当分别扩增(10μl体系)。
扩增完后混合取20μl进行下轮实验。
暂停点–PCR产物可以储存在10°C过夜,需要更长时间储存,可以置于–20°C.
部分消化引物序列
1.轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。
往每个混合反应液中加入2微升FuPa?
Reagent?
,总体系达到22微升。
2.充分振荡混匀,轻度离心将液体收集到管底。
(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)
3.将PCR管放入PCR仪,按以下程序运行。
温度
时间
50℃
10分钟
55℃
10分钟
60℃
20分钟
10℃
持续(最长至1小时)
将接头连接至扩增产物并纯化
配置并运行连接反应
1.如果有可见的沉淀物在Switch溶液中,通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。
2.小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。
在加入之前可先混合Switch溶液和接头。
成分
体积(μL)
SwitchSolution
4
稀释的barcode接头混合物
2
总体积
28
3.在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。
4.充分振荡混匀,轻度离心将液体收集到管底。
(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)
5.将PCR管放入PCR仪,按以下程序运行。
温度
时间
22℃
30分钟
72℃
10分钟
10℃
持续(最长至1小时)
暂停点–产物可以置于–20°C保存。
纯化未扩增的文库
使用Agencourt?
AMPure?
XP试剂样本体积
重要事项!
–将AMPure?
?
XP?
reagent?
置于室温并充分振荡将磁珠混匀,使用时缓慢吸取.接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。
对每个样品,混合230微升无水乙醇和100微升无核酶水。
1.将加完接头的文库转移至离心管内,加入45微升(样本体积)的Agencourt?
AMPure?
XP试剂。
用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。
2.将混合液置于室温5分钟。
3.将离心管置于DynaMag?
‐96?
Side?
Magnet?
(Cat.?
no.?
12331D)磁力架上,静置2分钟或者等溶液变清澈。
小心地吸走并弃掉上清,不要扰动磁珠。
4.向离心管中加入150μL新鲜配制的70%乙醇,在磁力上来回移动离心管来洗涤磁珠,然后小心地弃去上清,不要扰动磁珠。
5.重复第4步,进行第二次洗涤。
6.确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。
将离心管放置于磁力架上,室温空气干燥5分钟,注意不要过度干燥。
7.将离心管从磁力架上拿开,在每管中加入50μLLowTE充分浸润磁珠。
充分振荡混匀,轻度离心将液体收集到管底。
(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)
8.将离心管置于磁力架上2分钟。
上清液中含有文库。
文库扩增:
1.将EP管从磁力架上取下,加50μlPlatinum?
?
PCR?
SuperMix?
High?
Fidelity和2?
μlof?
Library?
Amplification?
Primer?
Mix。
Platinum?
PCRSuperMixHighFidelity和LibraryAmplificationPrimerMix需要事先混合好。
充分漩涡震荡后简单离心,或者用枪上下吹吸5次。
2.将EP管放在磁力架上至少2分钟,将上清约50μl转移到一个干净的200μLPCR内。
3.运行一下PCR程序
纯化扩增后的文库
第一轮纯化
1.加入25μl(的样品体积)?
Agencourt?
?
AMPure?
?
XP?
Reagent到每个样品管中,用移液枪吹吸5次。
2.室温下静置5分钟。
3.将样品管放在磁力架上至少5分钟,直至溶液变澄清。
4.小心的将上清移入另一个干净的PCR管中。
第二轮纯化
1.在第一轮纯化取到的上清中加入60μlAgencourt?
?
AMPure?
?
XP?
Reagent,用枪头反复吹吸5次
2.室温下静置5分钟。
3.将样品管放在磁力架上至少3分钟,直至溶液变澄清,将上清吸除。
4.加入150μl新鲜配置的70%的酒精,缓慢旋转两圈,将上清吸除。
5.重复步骤4
6.确保酒精完全被移除,打开管盖,常温干燥5分钟。
7.将样品管从磁力架上取下,加入50μl?
LowTE,充分漩涡震荡,简单离心,或将移液枪调至40μl?
吹吸5次。
8.将样品管放入磁力架后,静置两分钟,将上清转移到新的离心管。
Qubit定量
1.制备?
Qubit?
?
dsDNA?
HS?
reagent稀释液:
1μlQubit?
?
dsDNA?
HS?
reagent加199μl?
Qubit?
?
dsDNA?
HS?
Buffer。
2.在10μL?
的?
amplified?
Ion?
AmpliSeq?
?
library?
中加入190μL?
的dye?
reagent,混合充分后静置2分钟。
3.1μL样品中加入199μLdyereagent进行测样。
定量完成后,不同引物的相同样品的管合为一管(相同浓度)每管定到300PM,混合后能达到100PM。
IonPGM200bp自动模本制备
在IonOneTouch2instrument上制备模板ISP
IonOneTouch2仪器准备
打开IonOneTouch2背面的电源开关;按触摸屏上OPENLID,等待离心机盖打开;
参照图1将RecoveryTubes(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放置于IonOneTouch2离心收集器的转子中,随后将RecoveryRouters(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放置于相应位置,手动盖上离心机盖;
图1
参照图2顺序将IonOneTouch?
2AmplificationPlate(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放置于加热模块中,将加热模块手柄压向自己身体方向,盖上IonOneTouch?
Lid,导管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上,将AmplificationPlate的注射针垂直插入IonOneTouch?
DLInjectorHub,直至接触到底部的RecoveryRouter,然后松开注射针
5
6
图2
IonOneTouch?
Oil和IonPGMOT2RecoverySolution添加
每次开始使用新的IonPGM?
TemplateOT2200Kit,丢弃掉前一个试剂盒使用的IonOneTouch?
Sipper和IonOneTouch?
Tubes,戴上新的乳胶手套,装上新的IonOneTouch?
Sipper;将IonOneTouch?
Oil瓶(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)上下颠倒10次,倒入任意一个新的IonOneTouch?
Tube中,约1/2满,安装至标示有
的下方相应位置拧紧;IonPGMOT2RecoverySolution(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)倒入另一个新的IonOneTouch?
Tube中,约1/3满,安装至标示有
的下方相应位置拧紧;
同一个IonPGM?
TemplateOT2200Kit的后续使用准备时,将IonOneTouch?
Oil(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)瓶上下颠倒10次,取下有IonOneTouch?
Oil的IonOneTouch?
Tube,剧烈混匀至产生微小的气泡(图3),加入IonOneTouch?
Oil,约1/2满,安装至标示有
的下方相应位置拧紧;将IonPGMOT2RecoverySolution(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)倒入另一个的含有IonPGMOT2RecoverySolution的IonOneTouch?
Tube中,约1/3满,安装至标示有
的下方相应位置拧紧;
图3
IonOneTouch反应液相准备及上机
按照如下表格顺序室温配置体系,试剂来自IonPGMTMTemplateOT2Reagents200
顺序
试剂
管盖颜色
体积(ul)
处理方式及状态
1
Nuclease-FreeWater
——
25
——
2
IonPGM?
TemplateOT2200ReagentMix
紫色
500
提前室温放置,充分溶解至无沉淀,漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于4℃
3
IonPGM?
TemplateOT2200PCRReagentB
蓝色
300
充分溶解至无沉淀,漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于室温
4
IonPGM?
TemplateOT2200EnzymeMix
褐色
50
短暂离心后,冰上放置
5
测序用文库
——
25
将定量好的文库稀释至15ng/ml,取2ul稀释到25ul
——
Total
——
900
——
将上述体系涡旋震荡5s,稍离心;
将IonPGM?
TemplateOT2200IonSphere?
Particles最大速漩涡混匀1min,上下吸打5次上下吸打混匀,室温放置备用;
1IonPGMOneTouch?
PlusReactionFilter(IonPGMTMTemplateOT2Reactions200移液器将所有的液相缓慢从距离另外两个孔较远的样品孔(图4)注入reactionfilter,注意移液头与样品孔紧密接触插紧;
图4
用1000ul移液器从此孔缓慢加入1000ulIonOneTouch?
ReactionOil(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200),更换一个新的1000ulUniversalFitFilterTip移液头(防止交叉污染),再缓慢加入500ulIonOneTouch?
ReactionOil;
如图5,将加样孔置于左侧,顺时针倒转reactionfilter,避免管内导管接触反应液相;
图5
如图6,将reactionfilter插入IonOneTouch?
相应位置,边缘凸起位置朝向自己;
凸起部分
图6
1
图7
选择IonPGMTMTemplateOT2200kit(图8)
图8
1xpert,最后点击NEXT开始运行。
运行结束及IonOneTouch?
清洗
图9
1RecoveryRouter,小心缓慢将RecoveryTubes取出放于板架上,模板ISP位于RecoveryTubes底部外侧(图10)
图10
拿掉ReactionFilter,将CleaningAdapter(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)凸出部分面向自己插入相应位置(图11)
图11
1
1
1AmplificationPlate和废液管一起扔进专门的垃圾桶,关闭电源
IonOneTouchTMES的操作及阳性模板富集
沿远离沉淀一侧,自液面开始小心将两管RecoveryTubes中的上清液吸掉,各剩余约50uL;
取一个新的的Non-StickTube,将RecoveryTubes中剩余50uL液体吹打10次后吸入其中;
在两管RecoveryTubes中各加入100uLWashSolution(IonOneTouch?
200SolutionsKitv2Non-StickTube中;
在的Non-StickTubes中再加入1000uL200uLWashSolution,最大转速漩涡振荡10s混匀,15500g离心3min;
沿远离沉淀一侧,自液面开始小心吸掉上清液,剩余100uL在管底,低速漩涡振荡10s混匀;
配制好新鲜的1MNaOH(1MNaOH最长可在一周内使用);
取一个普通离心管,按如下表格配制Melt-OffSolution(每次新鲜配制)
顺序
试剂
体积(ul)
1
Tweensolution(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)
280
2
1MNaOH
40
Total
320
吸取130uLMyOne?
BeadsWashSolution到一个新的的Non-StickTube中;将Dynabeads?
MyOne?
StreptavidinC1Beads最大转速漩涡震荡30s,取到上述的Non-StickTube,漩涡振荡混匀30s,短暂离心2s;
将的离心管置于DynaMag?
-2magnet上2min或至溶液澄清,小心吸掉上清,避免碰触沉淀;将离心管从DynaMag?
-2magnet上取下,吸取130uLMyOne?
BeadsWashSolution到离心管中,漩涡振荡悬浮Dynabeads?
MyOne?
StreptavidinC1Beads;
取一个8-wellstrip(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200),方头永远放在面朝自己的左面,从左到右依次编号为1到8(图12);
图12
按如下表格在8-wellstrip中加入相应试剂(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)
孔编号
对应孔试剂
1(方头第一个)
中的100ul模板ISP(U)
2
中130ulDynabeads?
MyOne?
StreptavidinC1Beads(B)
3
300uLIonOneTouch?
WashSolution(W)
4
300uLIonOneTouch?
WashSolution(W)
5
300uLIonOneTouch?
WashSolution(W)
6
空
7
吸取中新鲜配制的Melt-Offsolution(M)
8
空
将8-wellstrip放入IonOneTouch?
ES前方白色模块中的凹槽中,方头在左,紧靠在凹槽右侧;
取一个新的Tip(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放入TipLoader
中,从支架上取下TipArm插入TipLoader中,用力向下按紧1s,松开,取下TipArm放回支架上(一定要放到位),新的Tip已装在TipArm下方(图13);
图13
在TipArm下方的洞中放一个开口的的PCR管,里面加入NeutralizationSolution10ul(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200);
打开IonOneTouch?
ES电源,按Start/Stop键,运行过程中显示屏上一直显示“run”,IonOneTouch?
ES自动开始阳性模板富集;
富集过程结束是,IonOneTouch?
ES会有蜂鸣提示,并且显示屏显示“End”,整个过程约40min;
结束后,将用过的Tip取下,和8-wellstrip一起扔进专门的垃圾桶,关闭电源
取出PCR管扣上盖子,15500g离心3min;
沿远离沉淀一侧,从液面开始小心吸掉上清,剩余10uL在管底;
加入200uLIonOneTouch?
WashSolution,上下吹打混匀10次,15500g离心3min,沿远离沉淀一侧,从液面开始小心吸掉上清,剩余10uL在管底;
加入100uLIonOneTouch?
WashSolution,上下吹打混匀10次,若不立即进行后续的测序,可置于4℃保存2-3天。
IonPGM200bp读长上机测序操作
PGM的清洗
氯片清洗(如果PGM超过48个小时未使用,请首先用氯片清洗);
将W1氯片清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次,备用;W1清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次后,加满250ml18MΩ去离子水,备用;
将1L的容器用每次100ml18MΩ去离子水漂洗3次,装满1L18MΩ去离子水,放入一片PGMCleaningTablet(IonPGM?
SequencingSolutions200Kitv2),静置10min;
10min后,加入1ml1MNaOH,混匀(该溶液请在2-3小时之内使用);
用μm滤器过滤250ml以上氯片溶液到W1氯片清洗瓶中;
打开PGM电源,氩气输出气压调至30psi;
PGM启动完毕后,点击进入Clean菜单,确保芯片座上有一块旧芯片;
按屏幕提示,勾选Chloritecleaning,点击NEXT;
通过后按提示将W1氯片清洗瓶拧上W1位(保证有吸管);
将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管,清空废液瓶的废液;
1去掉前端四种dNTPs尖底管,不要取下吸管,在吸管下放置废液缸;
1按next,进入清洗程序;
1第一轮清洗结束后,用18MΩ去离子水涮洗W1位的吸管,将含250ml18MΩ去离子水的W1清洗瓶拧上W1位,按next进入第二轮清洗程序;
1第二轮清洗结束,整个PGM清洗结束,可进入初始化步骤;
18MΩ去离子水清洗(两次初始化之间小于24h);
W1清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次后,加满250ml18MΩ去离子水,备用;
打开PGM电源,氩气输出气压调至30psi;
PGM启动完毕后,点击进入Clean菜单,确保芯片座上有一块旧芯片;
按屏幕提示,勾选18-MOhmwatercleaning,点击NEXT;
通过后按提示将W1清洗瓶拧上W1位(保证有吸管);
将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管,清空废液瓶的废液;
去掉前端四种dNTPs尖底管,不要取下吸管,在吸管下放置废液缸;
按next,进入清洗程序,18MΩ去离子水清洗只进行一轮,结束后可以开始PGM初始化。
PGM初始化
将试剂盒中dNTPs(IonPGM?
SequencingReagents200Kitv2)取出,在冰上融化备用;
将W2试剂瓶(IonPGM?
SequencingSupplies200Kitv2)用每次200ml18MΩ去离子水漂洗3次,在上部接线处用记号笔标记(见图1,如果有两条接缝线,标记下面的那条),加入18MΩ去离子水至标记处;
图1
将整瓶IonPGM?
Sequencing200v2W2Solution
加100mMNaOH140ul到W2试剂瓶中,盖上瓶盖,上下倒置数次混匀后备用;
W1,W3(IonPGM?
SequencingSupplies200Kitv2)试剂瓶用18MΩ去离子水漂洗,每次50ml,漂洗3次;
在W1试剂瓶中加入350ul100mMNaOH溶液,盖上瓶盖备用;
在W3试剂瓶中1XW3Solution至50ml刻度处,盖上瓶盖备用;
在主菜单界面中选择Initialize,保持芯片座上有一块旧芯片,按Next检测是否有漏气;
按Next,根据屏幕提示,穿戴新的乳胶手套,将新的长吸管(IonPGM?
SequencingSupplies200Kitv2)换到W2位置的盖上(避免碰触其它表面),拧上制备好的W2试剂瓶(见图2);
图2
按Next,同样将制备好的W1和W3试剂瓶拧上各自的位置(用新的短吸管),确认密封无误;
按Next,开始第一阶段的初始化过程,大约需要30min;
将冰上融化的四种dNTPs漩涡振荡混匀,短暂离心后放置于冰
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