Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究.docx
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Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究
Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究
【摘要】 为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制,采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol/Lvelcade处理U266细胞活率,用流式细胞术分析Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基,用半定量RT-PCR法检测bcl-2mRNA的表达。
结果表明:
velcade抑制U266细胞增殖;诱导U266细胞凋亡,24小时Annexin-V阳性细胞比例增高,△ψM降低;12小时时活性氧明显增高,荧光强度增强;抗凋亡基因bcl-2表达降低。
结论:
velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用,其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。
【关键词】velcade;多发性骨髓瘤;细胞凋亡
MultipleMyelomaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcade
AbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemyelomacelllineU266apoptosisanditsmechanism,cellviabilitywasestimatedbytrypanbluedyeexclusion.Annexin-V,mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytometry,theexpressionofbcl-2mRNAwasdetectedbysemi-quatitativeRT-PCR.TheresultsshowedthatthevelcadeinhibitedthegrowthofU266cellsandreducedcellviabilityaccompaniedbyappearanceofmorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velcadeat50nmol/LincreasedAnnexinVpositivityandfluorescenceintensityofDCFbecauseofROSgenerationwhileitdecreasedtheΔψmofU266cells.Expressionofanti-apoptoticgenebcl-2mRNAalsodecreased.ItisconcludedthatvelcadeinhibitethegrowthandreducecellviabilityofU266cells.VelcadecaninduceU266cellsapoptosisbyintrinsiccellapoptoticpathway.
Keywordsvelcade;multiplemyeloma;apoptosis
多发性骨髓瘤是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤,多发生于老年人。
随着社会人口的老龄化,其发病率呈逐渐增高的趋势。
几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗,尽管近年来加用反应停抑制血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗,但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。
由此可见,开发新的治疗方法有重要的临床价值。
蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验,本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。
材料和方法
细胞培养
U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO2和95%空气湿度条件下进行培养。
实验过程中,细胞以×105细胞/毫升的密度接种培养,并与不同浓度velcade一起进行孵育,对照加DMSO。
细胞活率由台盼蓝拒染法检测,根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。
形态学观察,细胞用cytospin(Shandon,Runcorn,UK)收集至载玻片,用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。
每次试验重复3次。
生长抑制率及细胞活率按如下公式计算
生长抑制率=[(对照组细胞数-处理组细胞数)/对照组细胞数]×100% 存活率=[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]×100%
Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基的流式细胞仪分析
Annexin-V分析
使用FITC标记的AnnexinV和PI双染法检测细胞凋亡,根据BectonDickinsonBiosciences公司提供的说明书进行操作。
简单地说,取×105细胞,经PBS漂洗后加100μl结合缓冲液,重悬细胞,加5μlAnnexinV-FITC,10μlPI避光孵育15分钟后加400μl结合缓冲液,用流式细胞仪检测。
线粒体跨膜电位(Δψm)检测
取5×105细胞,用PBS清洗1次,加入10μg/mlRh12337℃孵育30分钟,用PBS漂洗1次,加入终浓度10μg/mlPI4℃暗处放置30分钟,用流式细胞仪检测。
活性氧测定细胞内活性氧测定方法参照文献[1]方法进行,DCFHDA(Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH,在活性氧存在下被氧化成DCF,DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。
DCF的激发波长为485nm,吸收波长为530nm。
将药物处理的细胞经过PBS洗涤,重悬于1ml含有10μmol/LDCFHDA的PBS中,以未加染料的样品作为对照,37℃孵育20分钟,以PBS洗涤2次,用流式细胞仪检测5000个活细胞的荧光强度。
velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266bcl-2mRNA表达的半定量RT-PCR检测
细胞总RNA抽提收集3×106细胞,用TRIzoL试剂按说明书抽提细胞总RNA。
cDNA合成及PCR扩增方法参见文献[2],PCR引物:
GAPDH:
有义链5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′;反义链5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。
bcl-2:
有义链5′-ACTTGTGGCCCAGATAGG-3′,反义链为5′-CGACTTCGCCGAGATGTC-3′。
PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照相,在双波长色谱扫描仪上扫描电泳带。
GAPDH片段长度216bp,bcl-2片段389bp。
结果
velcade对U266细胞增殖抑制和杀伤作用
研究结果表明,velcade可以抑制U266细胞的生长,同时伴有细胞活率的降低。
U266细胞经2、10、50和100nmol/L浓度velcade24小时处理后生长抑制率的3次均值分别为%、%、%和%,48小时时分别为%、%、%和%;在0、2、10、50和100nmol/L浓度时24小时活率分别为%、%、%、%和%,48小时时分别为%、%、%、%和%。
根据活率48小时时下降70%-80%选择药物浓度,因此选择velcade50nmol/L作为药物处理浓度。
velcade对U266细胞凋亡作用
50nmol/Lvelcade处理的U266细胞呈现出细胞形态学改变,表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整及出现多个凋亡小体等。
24小时AnnexinV-FITC/PI双标结果显示,凋亡细胞比例重复3次的均值为%,明显高于未用velcade处理对照组的%。
线粒体跨膜电位检测显示△ψM降低,Rh123阳性细胞比率重复3次的均值为%,对照为%。
活性氧检测
我们采用DCFHDA检测velcade处理的U266细胞活性氧及平均荧光强度。
结果发现,在12小时时活性氧明显增高,平均荧光强度显着增高,由对照的增强到,流式细胞仪直方图右移。
bcl-2检测
采用RT-PCR检测内源性细胞凋亡通路最主要的基因bcl-2。
结果显示,U266细胞经50nmol/Lvelcade处理后,随着作用时间的延长,其表达逐渐降低。
讨论
泛素-蛋白酶体通路是由泛素化系统和蛋白酶体组成,在调节细胞周期和肿瘤生长中有着重要的作用,该通路参与细胞内绝大多数的蛋白降解,如许多重要的涉及细胞信号转导、转录调控和细胞周期的调节蛋白。
蛋白酶体存在于所有的真核细胞中,蛋白酶体抑制剂可以通过干涉这些重要蛋白的降解,触发肿瘤细胞周期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡而使肿瘤进展延缓或静止[3-7]。
Velcade是一种硼酸二肽化合物,是高选择性、可逆性的26S蛋白酶体抑制剂,首先在美国国家肿瘤协会的一组60种肿瘤细胞系中表现出抗肿瘤作用。
velcade对MM细胞的作用表现在诱导细胞凋亡、抑制生长、抑制细胞黏附和骨髓血管生成等多个方面。
本研究显示,其对U266细胞具有增殖抑制作用,并随着时间的延长和剂量的增加呈现增殖抑制加强,活率降低趋势。
诱导细胞凋亡有3种信号通路:
FAS信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路,目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用。
细胞凋亡过程中,细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏,发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)由内层向外层的翻转,暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬,从而使凋亡细胞得以被清除。
AnnexinV为一种磷脂结合蛋白,可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸,所以经常被用于检测细胞凋亡[8]。
Rh123是一种亲脂性阳离子,可发射绿色荧光,它可被线粒体吸收,并且其吸收量与线粒体△ψm成正比[9]。
正常的活细胞因为线粒体△ψm高,所以其摄入的Rh123也高,因此细胞会发出绿色荧光。
而细胞发生凋亡时线粒体△ψm会降低,细胞表现为Rh123低染。
本研究结果显示,Velcade处理U266细胞24小时时凋亡细胞明显增高,△ψm明显降低,这说明细胞大部分是通过诱导细胞凋亡而死亡的,Velcade还可通过线粒体信号通路,即内源性凋亡途径诱导U266细胞凋亡。
ROS是细胞有氧呼吸过程中产生的一些小分子物质,主要包括O-2、OH-及其活性衍生物如H2O2、HOCl、O2等。
这些物质具有较高的反应活性,易与细胞内的大分子物质反应,导致细胞结构的广泛损伤,如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸等的氧化损伤等。
近年的研究认为,活性氧是细胞凋亡的信号之一,ROS的产生可直接或间接改变线粒体膜电位,促进CytC从线粒体内释放,启动线粒体信号通路,诱导细胞凋亡[10]。
线粒体是ROS产生的主要场所,内质网中同样会有ROS的生成。
Fribley等报道[11]蛋白酶体抑制剂velcade通过同时诱导ER应激和ROS生成引起人头颈癌细胞凋亡,ROS的抑制剂Tiron能够显着抑制凋亡,caspase-9和caspase-3的活化,并且能够阻碍ER应激相关蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表达。
这些结果提示,ROS在ER应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。
用DCFHDA作为荧光探针测定细胞内ROS水平时,发现velcade在24小时时能明显增高U266细胞内活性氧水平,这说明velcade可改变多发性骨髓瘤细胞内氧化还原状态,导致线粒体和内质网产生ROS增多,从而诱导U266细胞凋亡。
由此我们推测,不仅线粒体途径参与了velcade诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡,而且ER应激
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- Velcade 诱导 多发性 骨髓瘤 细胞株 U266 细胞 研究
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