生物分子高效分离与表征研究组.docx

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生物分子高效分离与表征研究组

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告

项目编号：

2012CB910600

项目名称：

蛋白质定量新方法及相关技术研究

课题编号：

2012CB910604

课题名称：

集成化蛋白质组定量分析系统

2012年11月21日

一、年度计划执行情况

1.年度计划完成情况

按照项目任务书要求，本课题在2012年度主要针对集成化蛋白质组定量分析系统，侧重开展了低残留蛋白质传质膜材料、缓冲溶液置换接口、亲水性酶解反应器等方面的研究工作，另外还开展了在线固相标记、集成化蛋白质定性和定量技术以及超高灵敏度蛋白质定量分析技术和系统的初步研究工作。

按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。

在低残留蛋白质传质膜材料方面：

发展了一种中空纤维膜的制备方法，该膜对蛋白质的回收率可达到95%；

在缓冲溶液置换接口方面：

制备了一种基于中空纤维膜的缓冲溶液置换接口，接口对蛋白质的回收率可达到94%，可用于进一步蛋白质的定量分析；

在酶解反应器方面：

1）制备了基于聚合物微球基质的亲水性微酶解反应器（IMER），该酶解反应器亲水性好、酶解速率快等特点，能够在1.5min完成酵母提取蛋白的酶解，共鉴定到271个蛋白group；2）制备了基于磁性氧化石墨烯基质的亲水性IMER，结合微波辅助，可在15s完成标准蛋白质的酶解，5min完成鼠肝蛋白酶解，鉴定到456个蛋白group；3）制备了基于聚乙烯乙二胺修饰的聚丙烯酰胺整体材料的可再生型亲水性IMER，可在30min内完成再生，在80s内完成对大肠杆菌提取蛋白的酶解，鉴定到333个蛋白质；4）建立一种集蛋白质酶解、糖基化肽段富集以及去糖基化三个过程为一体的微反应系统，降低了样品损失，对蛋白质灵敏度比传统方法提高了5倍；

在固相标记技术方面：

1）发展了磷酸肽富集-在线标记分析系统，实现了磷酸肽的富集及原位同位素标记，可从0.1L血清中成功检测到4个磷酸肽；2）建立了在肼微球上固相富集和二甲基标记糖肽的一体化定量分析技术，将其用于人正常和癌症血清的糖蛋白差异化研究，发现galectin-3bindingprotein可以作为潜在的临床肿瘤标记物；3）发展了一种双通道固相萃取标记系统，可实现蛋白质的变性、还原、烷基化、酶解和同位素标记以及除盐等过程，应用于高/低转移细胞株蛋白提取物分析，发现了24种蛋白质发生了明显变化；

在集成化蛋白质分析平台方面：

1）构建了集成化蛋白质定量分析系统，实现了蛋白质酶解、在线标记、肽段分离以及质谱检测的集成化，可从10万个细胞中定量到约1700个蛋白质；2）构建了基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱的集成化蛋白质组分析平台，可将复杂蛋白质体系蛋白质鉴定数量提高10%左右，分析时间缩短1倍；3）建立了离子交换色谱-在线酶解-反相色谱-质谱的集成化蛋白质定量分析系统，该系统的定量RSD值为19.63%，用于小鼠腹水型肝癌淋巴道高/低转移细胞系蛋白质提取物分析，发现7种蛋白质在低转移细胞中高表达，9种蛋白质在高转移细胞中高表达；

在超高灵敏度蛋白质定量分析技术和系统方面：

1）发展了一种基于色谱绝对定量的蛋白质组学新方法，该方法对标准蛋白最低定量检测限为0.34amol，相对偏差RSD<1.58%，动态范围1-105；2）构建了二维阵列液相色谱高丰度蛋白去除系统，提高了样品预处理的自动化程度和通量。

此外，发展了一种细胞表面捕集新方法，可以通过同时分析糖蛋白的糖肽和非糖肽来实现蛋白质组样品准确定量分析。

应用到两种人类细胞系ChangLiver和HepG2细胞表面糖蛋白的鉴定和定量中，发现33个糖蛋白在两个细胞系间的表达具有显著差异性，并对其中2种蛋白质进行了验证。

发表SCI论文7篇，申请发明专利2项，培养博士后1名，博士研究生3名。

2.研究工作的主要进展

2.1中空纤维膜的制备

将锥形枪头（枪头出口端内径为450μm）垂直固定在一铁夹中。

用注射器吸取一定量的聚砜浆料注满枪头。

取一段毛细管垂直正中插入枪头的浆料内并穿过枪头的出口端，再将毛细管上端垂直固定在一环内，并在毛细管的下端悬挂一重物。

在枪头的正下方放置一杯纯净的去离子水，然后松开毛细管上端的环，毛细管在重物的重力作用下自由落入盛水烧杯中，2min后将毛细管从水中取出。

毛细管在下落的过程中管壁外表面均匀粘附一层聚砜，聚砜遇水即刻水解成膜。

将毛细管从成形的膜中抽取出来便可得到一中空纤维膜，膜内径即为毛细管的外径，膜外径即为枪头出口端内径。

利用该中空纤维膜制备了一种在线除盐接口，可将溶液中的盐浓度降低2个数量级，同时以肌红蛋白为例，对该膜接口的非特异性吸附进行了考察，该膜接口对蛋白质的回收率可达95%。

2.2缓冲溶液置换接口

在集成化蛋白质分析平台中，各维之间溶剂的兼容性是实现在线分离的关键因素之一。

因此，利用溶剂置换接口来进行溶剂交换是解决该问题的有效途径。

本课题在前期工作的基础上，改进了制作方法，研制了无胶粘接卡套式中空纤维膜接口，用于提高蛋白质在处理过程中的回收率，具体制作步骤如下：

1）根据交换液腔管的长度截取适当长度的中空纤维膜一根。

2）将石英毛细管插入中空纤维膜两端，插入长度约1cm。

3）将内插有石英毛细管的中空纤维膜两端套入两段Peek管内，Peek管的长度根据Peek接头的长度适当调整，大致为4cm。

4）将两段带有Peek管的中空纤维膜装配入置换液腔管中。

5）将两段的Peek管套入Peek接头中，用二通将中空纤维膜卡住。

膜接口即制作完成。

为了考察该接口对蛋白质样品的回收率，采用0.11mg/mLBSA为样品，进样20μL，通入中空纤维膜接口，收集组分通过BCA法测定浓度，BSA过膜后的回收率可达94%±1.3%（n=3），可满足定量分析的需求。

2.3亲水性IMER

2.3.1基于聚合物微球基质的亲水性IMER

本课题利用N-乙烯基-2-吡咯烷酮所带有的双键与聚合物微球表面双键反应进行修饰，然后将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺对胰蛋白酶的羧基进行活化后与微球表面的氨基键合，制备了一种新型亲水性IMER。

利用牛血清白蛋白（BSA）对其性能进行评价，通过质谱鉴定和数据库搜索得到序列覆盖率为66.3±1.3%（n=3），鉴定肽段数目为37±2.7%（n=3）；利用浓度分别为100,1and0.01μg/mL的肌红蛋白（Myo）、细胞色素c（Cyt-c）和BSA的混合物进行评价，鉴定到的Myo、Cyt-c和BSA的序列覆盖率分别为57%、40%和17%，鉴定肽段数目为8、7和9，而自由溶液酶解，只有浓度最高的Myo得到鉴定，序列覆盖率为36%，鉴定肽段数目为5，说明制备的新型IMER的较高的酶解效率。

将其应用于酵母提取蛋白，酶解1.5min，通过LC-MS共鉴定到271个蛋白group，而自由溶液鉴定到192个蛋白group（鉴定到至少两条唯一性肽段），两者之间的overlap达到了88.5%，说明该IMER具有应用于实际样品分析的潜力。

2.3.2基于磁性氧化石墨烯基质的亲水性IMER

本课题通过引入氧化石墨烯改善基质的亲水性，利用磁性氧化石墨烯作为基质，制备了一种基于磁性氧化石墨烯基质的亲水性IMER。

首先在EDC/NHS活化下制备磁性氧化石墨烯，然后通过氢键和π-π作用，在磁性氧化石墨烯表面固载胰蛋白酶，酶固载量可达到0.275mg/mg。

磁性的引入不仅简化操作，而且作为微波吸收材料，可以加快酶解速度。

将上述IMER对标准蛋白（BSA,Cyt-c,Myo.0.1mg/mL）进行15s微波辅助酶解，鉴定到的序列覆盖率分别为67%、64%、84%，鉴定肽段数目为36、14、13，酶解效率同自由溶液酶解12h相当。

将其进一步应用于鼠肝蛋白提取物分析，采用5min微波辅助酶解，鉴定到456个蛋白group。

2.3.3基于聚丙烯酰胺整体材料的可再生型微酶解反应器

以丙烯酰胺和N’N-双甲基丙烯酰胺分子为单体，采用二甲亚砜作为溶剂和致孔剂，制备了一种聚丙烯酰胺整体柱，经聚乙烯乙二胺修饰后，通过金属螯合反应，制备了一种新型基于可再生型IMER。

同传统方法相比，该IMER的再生只需要进行胰酶的解吸和吸附，而不必进行金属离子的再次固定化，因此可在30min内完成再生。

这种IMER对与飞摩尔的样品仍然表现出良好的酶解能力。

将其应用于大肠杆菌提取蛋白质分析，酶解80s，采用LC-MS进行分析，共鉴定到2362条肽段（1163独一肽段，FDR<1%）,对应333种蛋白质。

2.3.4糖基化蛋白微反应器

针对糖基化蛋白分析中样品预处理操作繁琐以及已损失等问题，建立一种集蛋白质酶解、糖基化肽段富集以及去糖基化三个过程为一体的微反应系统，避免除盐冻干和样品转移的会带来样品损失的操作。

在该系统中，使用了乙腈辅助酶解的方法对蛋白样品进行酶解，然后使用亲水色谱对糖基化多肽进行富集，最后加入PNGaseF对富集后的糖基化多肽进行去糖基化处理，整个样品预处理过程能在2h内完成，显著缩短了样品预处理时间。

采用标准糖基化蛋白IgG（免疫球蛋白G）对该系统进行考察，结果显示，该系统对IgG分析的检测限为30fmol，灵敏度比传统方法（150fmol）提高了5倍。

最后，将该系统用于复杂样品人血清的分析，在100nL血清中，鉴定到了80个糖基化蛋白和178个糖基化位点。

2.4在线固相标记系统

2.4.1磷酸化肽段富集-标记分析系统

本课题制备了EPO-Ti4+材料，其骨架中含桥联硅烷偶联试剂，具有比较宽的pH稳定范围；同时在制备过程中引入磷酸基团，避免了后修饰基团的操作繁琐。

基于EPO-Ti4+材料的介孔体积排阻性能及对磷酸肽的亲和性，可实现磷酸化肽段的选择性富集。

此外，将磷酸肽的富集与原位标记结合起来，实现了磷酸肽的富集及原位同位素标记。

通过将磷酸肽的富集、除盐和标记一步完成，有效提高了鉴定灵敏度与通量。

以β-酪蛋白酶解液为标准，考察了反应条件，并且与传统衍生方法进行比较，发现原位标记具有操作简便、样品损失少、灵敏度高等优点。

将其应用用于人血清中内源性磷酸肽的富集和衍生，并通过MALDI-TOFMS进行相对定量。

从0.1μL血清中成功检测到4个磷酸肽，并进行二甲基标记后比较了10例正常人与10例肝癌患者的血清中磷酸肽的相对含量，发现二者存在明显的差异。

该方法结合MALDI-TOFMS，可以进行高通量的筛选，在疾病的临床快速诊断方面具有很好的应用前景。

2.4.2糖肽富集-在线标记分析系统

本课题通过将富集糖肽特异性高达90%的肼化学的方法与二甲基标记方法联用，发展了在肼微球上固相富集和二甲基标记糖肽的一体化定量分析技术。

采用标准糖蛋白的混合物（卵清白蛋白、转铁蛋白、α-酸性糖蛋白、胎球蛋白）对一体化定量分析方法的准确性、线性、回收率以及灵敏度进行了系统研究。

首先证实了这一分析方法在定量糖蛋白组学分析中是准确可靠的，定量准确性可达到97%，其次研究表明该方法在糖肽的定量分析中，可以在两个数量级内保持良好线性。

通过与基于溶液的标记方法比较，新发展的方法具有良好的富集回收率（对于不同糖基化位点对应的糖肽，回收率有10-330%的改善）。

同时还具有高的检测灵敏度（在使用0.01mg标准蛋白混合物以及400gBSA作为起始物质，仍然能定量到42%的标准糖蛋白中已被标注的糖基化位点；而基于溶液的标记方法只能定量到26%）。

将这一方法用于人正常和癌症血清的糖蛋白差异化研究，发现galectin-3bindingprotein可以作为潜在的临床肿瘤标记物。

2.4.3双通道固相萃取标记系统

定量蛋白质研究过程需要多步预处理过程包括蛋白质提取、变性、还原、烷基化、酶解和同位素标记以及除盐等过程。

诸多的样品处理过程都会导致样品的损失，尤其对于微量或者痕量的蛋白质处理，不平行的处理会导致样品的损失而导致定量结果的错误。

因此本课题设计了一种用于微量蛋白质处理的双通道的样品预处理装置。

该装置实现了在固相萃取（SPE）管中完成蛋白质处理的全过程。

首先，考察了在SPE中处理样品的回收率；将得到肽段（轻标和重标）与自由溶液中处理得到的肽段（重标）的混合，结果发现SPE的回收率接近100%。

其次，考察了定量的准确度；将等量的肿瘤低转移细胞株蛋白提取物平行重复7次，发现所有3次以上重复定量的结果的平均值为1.01，RSD值为16.47%，与理论值较好的相符，且RSD值低于常规的溶液酶解的18.4%。

说明该装置处理定量蛋白质样品具有较好的准确度和精密度。

将其应用于肿瘤高/低转移细胞株蛋白提取物分析，平行重复四次，共定量到了354种蛋白质，发现了24种蛋白质发生了明显变化，其中16种蛋白在高转移细胞株中稳定高表达，8种蛋白在低转移细胞株中高表达。

2.5集成化分析平台

2.5.1自动化蛋白质定量分析系统

本课题在前期在线同位素标记的自动化蛋白质组定量分析系统的基础上，进一步引入蛋白质在线酶解，构建了从蛋白质提取液上样到定量分析的全自动化定量分析系统。

选用强阳离子交换预柱作为吸附型酶反应器，蛋白质样品和胰蛋白酶在pH3左右上样到阳离子柱，然后通过改变柱内缓冲液调节至pH8实现酶解。

通过在线酶解可以极大提高蛋白质组的鉴定覆盖率（2µg鼠肝蛋白质在线酶解后鉴定肽段数目与常规溶液酶解相比从2271提高到5097）。

考察了在线酶解结合在线二甲基化同位素标记对相同量的鼠肝提取蛋白质进行了定量比较，发现即使在重复分析并且保正两次定量结果相对标准偏差<50%时，仍然有约10%的肽段的相对定量结果超过2倍（在未整合在线酶解的系统中为1%）。

为了消除在线酶解所引起的不完全酶解对后续定量准确性的影响，随后我们使用SILAC技术在细胞水平对蛋白质进行活体同位素标记，然后将不同标记的细胞混合后同时进行蛋白质提取后后续的在线酶解及液质联用分析。

结果表明，由于不同标记的蛋白质同时进行在线酶解，漏切率保持一致，仍然能够得到准确的定量结果，重复分析后在相对标准偏差<50%时只有小于1%的肽段相对量超过了2倍。

同时，由于在线酶解的使用，极大提高了定量灵敏度，从10万个细胞中定量到了约1700个蛋白质。

2.5.2反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱

本课题构建了一个基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱的集成化蛋白质组分析平台。

以三种标准蛋白质混合物为样品，考察了该平台的性能，三种蛋白质（cyt-c、-乳球蛋白和BSA）的序列覆盖率分别为10%，55%和81%，与传统离线方法相当，但分析时间由传统离线方法的16小时缩短到4小时，且色谱总离子流信号强度也提高了接近4倍。

此外，考察了该平台的分析重现性，三种蛋白质序列覆盖率的相对标准偏差分别为0%，2.3%和6.8%，显示出良好的操作重现性。

将该平台进一步应用于鼠脑提取蛋白质的分析，与传统离线方法相比，无论是鉴定的肽段数（4404vs.3942）还是蛋白质数目（1420vs.1250）均得到了显著提高，且分析时间缩短了近一倍（19.5hvs.41.5h）。

该平台的成功构建为后续开展蛋白质定量分析提供了技术支撑。

2.5.3集成化蛋白质定量分析系统

针对现有的定量方法存在样品处理过程繁多，定量准确度差等不足等问题，构建了集成蛋白质样品预处理过程的蛋白质定量分析平台。

该平台包含弱阴弱阳离子交换色谱蛋白质分离、在线酶解和酶解产物的反相色谱在线分离与质谱分析三个部分。

将二甲基化标记的蛋白质进样到平台中可以实现蛋白质的快速定量，和常规的定量方法相比时间可以至少缩短24h。

利用该平台对等量轻标记和重标记的小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞系蛋白质提取物进行分析，结果表明，定量结果假阳性率低于2%，所有定量到蛋白质比值的平均值为1.04，与理论值1较为接近，而RSD值为19.63%，对于以质谱而言，该结果优于自由溶液的结果（<25%）,体现该平台用于蛋白质定量具有比较高的准确性和良好的重现性。

最后，将该平台用于小鼠腹水型肝癌淋巴道高/低转移细胞系蛋白质提取物，共定量到7种蛋白质在低转移细胞中高表达，而同时9种蛋白质在高转移细胞中高表达。

分析前者，发现其中Cytochromec,somatic这种蛋白参与抑癌基因P53的信号传导和促进癌细胞的凋亡的功能；分析后者发现多种热休克蛋白参与MAPK信号通路，该通路对细胞增殖与分化起到重要作用，进一步生物学验证正在进行中。

2.6超高灵敏度蛋白质定量分析技术和系统

2.6.1基于色谱技术的绝对定量技术

发展了一种基于色谱绝对定量的蛋白质组学新方法。

该方法充分利用了多维色谱的分离能力以及荧光检测器的高灵敏度的优势，实现了蛋白质的高灵敏定量，同时利用质谱对定量蛋白质进行定性。

方法选择标记于蛋白质半胱氨酸位点的荧光标记试剂进行标记，选用荧光标记的标准合成肽段作为内标，使用二维液相色谱进行蛋白质分离定量检测。

该方法对标准蛋白的最低定量检测限为0.34amol，相对偏差RSD<1.58%，动态范围1-105。

通过优化二维色谱的色谱柱组合、色谱条件，对人肝蛋白组样品中进行了绝对定量分析与质谱定性，从其中一个二维馏分中共鉴定出22个带有半胱氨酸残基的蛋白质。

2.6.2二维阵列液相色谱高丰度蛋白去除系统构建与关键技术研究

本研究构建了弱阴离子交换/反相液相色谱平台系统，工作流程如下：

单根弱阴离子交换色谱（WAX）柱进行第一维的分离，8根反相色谱（RPLC）柱同时作为第一维馏分的预富集柱和分析柱对其进行并行式富集和分离。

蛋白质样品上样到WAX柱上，用盐溶液进行洗脱，通过切换十通阀，第二维的每一个通道和WAX色谱柱逐一在线相连，从而每步洗脱出的组分都会保留在相对应的RPLC色谱柱上，进行样品的浓缩和除盐。

在第二维的分离中，采用设计制作的8通道的分流器，将流动相均匀分配到8根RPLC色谱柱上进行并行式分离。

将WAX作为第一维可以减少样品酸化过程的损失，增大蛋白的上样量，RPLC对多维液相色谱总峰容量的贡献很大，可以提高复杂蛋白质样品的分辨率，将其作为第二维还可以在线富集蛋白和除盐。

整个平台系统仅需要一台多元液相泵、一个十通阀、两个六通阀、8个三通和一个自行设计加工的多通道分流器进行连接即可实现在线两维切换，从而提高了自动化程度和仪器的集成度。

2.7复杂样品定量蛋白质组学分析

由于具有修饰的肽段在全蛋白的消化产物中只占很小一部分，很明显糖肽的数目在样品的消化产物中远远小于非糖肽的数目。

所以使用数目较多的非糖肽定量更准确更可靠，而且可以增加鉴定低丰度糖蛋白的灵敏度，特别是对于只有一个糖基化位点的蛋白。

另外，通过多次采样非糖肽可以平均和减少随机误差。

因此，为了实现可靠和特异性定量细胞表面的糖蛋白，本课题设计了一种细胞表面捕集新方法，可以通过同时分析糖蛋白的糖肽和非糖肽来实现蛋白质组学样品准确定量分析。

在这一方法中，细胞表面蛋白的糖链在细胞还是存活的状态就被氧化，接着裂解细胞，使氧化的蛋白偶联键合到肼微球上。

然后让肼微球先与胰蛋白酶孵育，再与糖苷酶孵育，可以让非糖肽和糖肽顺序从肼微球上释放下来。

在这一方法中，糖肽保证了鉴定的特异性，而非糖肽的收集可以给定量提供更多的信息。

将这一方法应用到两种人类细胞系ChangLiver和HepG2细胞表面糖蛋白的鉴定和定量中，共鉴定到341个糖蛋白（使用Gominer分析，细胞膜蛋白的特异性能够达到82.4%），其中33个糖蛋白被定量到在两个细胞系间的表达具有显著差异性。

在这33个糖蛋白中选定了2个，EMMPRIN和BCAM，用western印记方法证明了它们的变化趋势。

说明该方法可以用于细胞表面糖蛋白特定且准确的分析，在生物标记物和药物靶点发现领域可能具有更广泛的应用。

二、重要阶段性成果或突破（每项300-500字，另附图片）

2.1糖基化蛋白微反应器

本课题建立了一种集成式的微反应系统，将三步样品预处理过程，包括酶解、糖肽富集以及去糖基化在一个系统中进行，避免了除盐冻干和样品转移的会带来样品损失的操作，能够对微量的生物样品进行处理。

在该系统中，采用乙腈辅助酶解的方法对蛋白样品进行酶解，然后使用亲水色谱对糖基化多肽进行富集，最后加入PNGaseF对富集后的糖基化多肽进行去糖基化处理，整个过程均在建立的微反应系统中进行，而且不需要任何除盐冻干和样品转移等操作，避免了样品的损失，去糖基化后采用LC-MS进行分析鉴定。

其中采用乙腈辅助酶解方法可以极大地节省操作的时间，使得整个样品预处理过程能在2h内完成（传统方法的1/20-1/30）。

随后，采用标准糖基化蛋白免疫球蛋白G（IgG）对该系统进行考察；检测限为30fmol，灵敏度比传统方法（150fmol）提高了5倍。

将该系统用于复杂样品人血清的分析，在100nL血清中，鉴定到了80个糖基化蛋白和178个糖基化位点。

该工作发表在AnalyticalChemistry（2012,84,5146−5153）杂志上。

图1蛋白质组学分析流程

2.2反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱

本课题构建了一个基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱的集成化蛋白质组分析平台（如图2所示），蛋白质样品首先通过微柱反相色谱分级，洗脱组分依次通过溶剂置换接口去除有机溶剂并调节溶液pH值，再进入固定化酶反应器酶解，酶解产物通过反相色谱预柱捕集，最后通过微纳RPLC-MS分析。

以三种标准蛋白质混合物为样品，考察了该平台的性能，三种蛋白质（cyt-c、-乳球蛋白和BSA）的序列覆盖率分别为10%，55%和81%，与传统离线方法相当，但分析时间由传统离线方法的16h缩短到4h，且色谱总离子流信号强度也提高了接近4倍。

此外，我们还考察了该平台的分析重现性，三种蛋白质序列覆盖率的相对标准偏差分别为0%，2.3%和6.8%，显示出良好的操作重现性。

将该平台进一步应用于鼠脑提取蛋白质的分析，与传统离线方法相比，无论是鉴定的肽段数（4404vs.3942）还是蛋白质数目（1420vs.1250）均得到了显著提高，且分析时间缩短了近一倍（19.5hvs.41.5h），该平台的成功构建为后续开展蛋白质定量分析提供了技术支撑，该工作发表在AnalyticalChemistry（2012，84，5124-5132）上。

图2、反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-质谱分析平台（上图：

微柱系统；下图：

纳升级系统）

2.3高灵敏度蛋白质绝对定量分析方法与系统

建立了基于色谱定量与质谱定性联合工作原理的蛋白质绝对定量与鉴定技术（FLAQ），如图3所示。

使用荧光标记的标准合成肽段作为内标，对蛋白质进行绝对定量。

选择标记于蛋白质半胱氨酸位点的荧光标记试剂（IAF）。

荧光标记试剂的选择原则包括：

荧光量子产率、MALDI质谱鉴定的兼容性。

荧光标记试剂IAF在质谱串级谱图中不产生碎片离子，对蛋白质搜库后的鉴定结果不产生干扰。

将荧光探针IAF标记于蛋白质的半胱氨酸位点，使用二维液相色谱进行蛋白质分离定量、激光诱导荧光技术进行检测。

FLAQ对标准蛋白最低定量检测限为0.34amol，相对偏差RSD<1.58%，动态范围1-105。

通过优化二维色谱的色谱柱组合、色谱条件，对人肝蛋白组样品中的一个馏分作为例子进行了绝对定量与定性，对第34号馏分进行分析，共鉴定出22个带有半胱氨酸残基的蛋白质。

该工作发表在Proteomics（2012,12,2258–2270）杂志上。

图3.蛋白质分离鉴定FLAQ技术流程

三、项目执行过程中存在的问题及其对策。

课题按任务书要求顺利实施。

四、下年度研究工作计划和进度安排。

根据项目任务书，本课题下年度工作计划如下。

2013.1-4月，优化