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食品生物化学实验教案
食品生物化学实验指导
高建华曹劲松宁正祥编
华南理工大学
二OO六年三月
第一部分普通试验
实验一果胶的制备和特性测定-------------------------------------------------------------------
1
一、从果皮中提取果胶-----------------------------------------------------------------------------
1
二、果酱的制备--------------------------------------------------------------------------------------
1
实验二卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验---------------------------------------------------
2
实验三蛋白质的盐析透析-----------------------------------------------------------------------
5
一、蛋白质的盐析---------------------------------------------------------------------------------
5
二、蛋白质的透析---------------------------------------------------------------------------------
6
实验四氨基酸纸电泳分离鉴定-------------------------------------------------------------------
7
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响------------------------------------
9
一、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响----------------------------------------------
10
二、温度和pH值对а-液化淀粉酶活力的影响--------------------------------------------
10
实验六果蔬中过氧化物酶活力测定-------------------------------------------------------------
12
实验七酶催化转氨基反应的纸层析鉴定-----------------------------------------------------
14
实验八焦糖的制备极其性质----------------------------------------------------------------------
17
实验九酶促褐变的抑制及叶绿素的性质-------------------------------------------------------
19
第二部分综合设计性实验:
一、酵母蔗糖酶的分离纯化
实验一活性干酵母蔗糖酶的提取--------------------------------------------------------------
23
实验二蔗糖酶的分级沉淀提取-----------------------------------------------------------------
25
实验三蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐-----------------------------------------------------
28
实验四离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶-----------------------------------------------------
30
实验五蔗糖酶的交联葡聚糖凝胶色谱分离纯化--------------------------------------------
35
实验六聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蔗糖酶纯度-------------------------------------------
38
实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量--------------------------------------
43
实验八蔗糖酶的酶活特性研究------------------------------------------------------------------
辅助性实验
45
实验一蔗糖酶活力测定--------------------------------------------------------------------------
46
实验二Folin-酚法测定蛋白质含量-------------------------------------------------------------
48
实验三考马斯亮蓝染料比色法测定蛋白质含量----------------------------------------------
50
实验四紫外吸收法测定蛋白质浓度-------------------------------------------------------------
51
附表:
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
附表10℃下由S1提高到S2时每100mL样品加固体硫酸铵的克数--------------------
53
附表2室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数-------------------------------
二、天然活性物质植物黄酮的提取及应用
实验一藤茶植物黄酮的提取-------------------------------------------------------------------
实验二重结晶法纯化黄酮提取物--------------------------------------------------------------
实验三植物黄酮重结晶晶体形态观察----------------------------------------------------------
实验四紫外分光光度法测定总黄酮含量-------------------------------------------------------
实验五高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量-----------------------------------
实验六植物黄酮稳定性试验--------------------------------------------------------------------
实验七 植物黄酮在油脂中的抗氧化活性测定-----------------------------------------------
辅助性实验:
实验一油脂过氧化物值的测定----------------------------------------------------------------
实验二油脂酸价的测定---------------------------------------------------------------------------
54
55
56
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60
62
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70
72
实验一果胶的制备和特性测定
一、果胶的制备
(一)目的要求了解果胶的基本结构、果胶的分类及提取原理和方法。
(二)实验原理
果胶物质可分为三类,原果胶、果胶及果胶酸,其基本结构是不同程度甲酯化和被
钠、钾离子中和的α-半乳糖醛酸以1,4-苷键形成的聚合物,分子量高达200000左右。
原果胶不溶于水,主要存在于出生细胞壁中,在一定温度经稀酸长时加热条件下,果皮
层细胞壁的原果胶发生水解,由于结构甲酯化程度降低及部分苷键断裂而转变成水溶性
果胶。
水溶性果胶经脱水干制有利于保藏和运输,果胶干制有直接干燥法和沉淀脱水两种方
法。
直接干燥通常是把浓缩的果胶水溶液通过喷雾干燥获得。
沉淀脱水则是根据果胶不溶
于高浓度乙醇特性,采用乙醇沉淀提取。
乙醇沉淀提取果胶,控制酒精浓度极为关键,浓
度太高或太低都是不利的,浓度过高等于水分减少,水溶性的非胶物质没有机会溶解在水
中,会随果胶一起沉淀出来,使果胶纯度降低;反之如果乙醇浓度太低,水分含量过高,
果胶沉淀不完全,因此用乙醇沉淀提取果胶,乙醇用量最好为55%—60%左右。
果胶溶液
中存在有微量电解质时,加入乙醇果胶将以海绵絮状沉淀析出,反之不易聚集析出。
柑橘类果皮是提取果胶的优良原料,新鲜果皮含果胶约1.5%—3%,干果皮则含9%-18%,柠檬皮果胶含量更多,新鲜果皮内含2.5%—5.5%,干果皮内含量高达30%—40%。
(三)试剂及材料
1、0.5%HCl溶液量取12mL浓盐酸,加水稀释至1000mL。
2、1mol/LNaOH溶液称取40gNaOH,用水溶解并稀释至1000mL。
3、95%乙醇。
4、柑桔皮和柚子皮。
(四)操作方法
1、称取50—100g果皮,分切,把果皮放入沸水中煮沸3分钟,而后用清水漂洗,以除
去色素、苦味等非胶物质,并把多余水分除去。
2、把上述处理后的果皮放入600mL烧杯中,加入0.5%HCl200—300mL,一般以浸没
果皮为度,在搅拌条件下保持微沸提取20min。
3、趁热用4层纱布过滤,用少量50℃的热水分次将滤渣洗涤2—3次,合并滤液,冷
却至室温。
4、用1mol/LNaOH调整滤液的PH值至3—4。
5、缓缓向提取液加入95%乙醇约300mL,并略加搅拌,待果胶呈棉絮状沉淀后,用四层纱布过滤,压干除去大量水分,滤渣则为粗制的果胶产品。
二、果酱的制备
(一)目的要求了解果胶的性质和用途
(二)实验原理
果胶是亲水性多糖,在PH=3-3.5、蔗糖含量为65%—70%、0.7%—1%的果胶水溶液经煮沸冷却后,可形成具有一定强度的三维网状结构凝胶,其主要作用力是分子间的氢键及静电引力。
在凝胶过程中,溶液中的水含量对凝胶影响很大,过量的水阻碍果胶形成凝胶。
果胶水化后和水分子形成稳定的溶胶,由于氢键的作用水分子被果胶紧紧地结合起来不易分离,向果胶溶液中添加糖类,其目的在于脱水,糖溶解时形成夺取水分的势能,促使果胶粒周围的水化层发生变化,使原来果胶表面吸附水减少,胶粒与胶粒易于结合成为链状胶束,促进果胶形成凝胶。
在果胶-糖溶液分散体系内添加一定量的酸,可起到中和果胶所带的负电荷,减少了果胶分子变成阴离子的作用,促进它聚结成网状结构,而形成凝胶。
果酱、果冻等食品就是利用这些特性生产的。
(三)试剂及材料
白砂糖、柠檬酸、柠檬酸钠、自制果胶。
(四)操作方法
1、配方
蔗糖70g、柠檬酸0.5g、柠檬酸钠0.4g、水20g、自制果胶适量。
2、将柠檬酸、柠檬酸钠溶解于20g水中,用蔗糖把果胶充分拌匀,加入柠檬酸水溶液。
3、在不断搅拌下,小火加热至沸,保温熬煮约10—15min,待水分含量为一定时,以
溶胶糖液以挂珠为度,冷却、观察、描述形成凝胶的体态。
三、实验结果讨论分析。
四、思考题
1、提取果胶前,用沸水处理果皮的目的是什么?
2、沉淀提取果胶前,为何需调整果胶溶液PH值?
3、若提取的果胶溶液含水量过大,采用何种方法浓缩果胶提取液,以减少乙醇用量?
4、提取果胶后,采用何种方法回收乙醇?
正确绘制回收乙醇的实验装置图。
5、用什么简易方法测定回收乙醇的浓度?
6、果胶形成凝胶所需的条件是什么?
实验二、卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验
一、目的要求学习提取卵磷脂的方法,了解卵磷脂的乳化特性性质。
二、实验原理
磷脂是分子中含磷酸的复合脂,分为磷酸甘油脂和鞘氨醇磷脂类,其醇类物质分别为甘
油和鞘氨醇。
磷脂酰胆碱属磷酸甘油脂,俗名为卵磷脂,在生物体内以及食品工业应用中起着重要的作用。
卵磷脂是一种在动、植物中分布及广的磷脂,如植物的种子、动物的卵、脑及神经组织
均含有之,其中大豆中含量约为2.0%、卵黄中含量高达8%—10%、。
卵磷脂在细胞中以游离态或与蛋白质结合成不稳定的化合物存在,易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂,不溶于丙酮。
本实验采用乙醇提取蛋黄中的卵磷脂。
纯卵磷脂为白色的蜡状物,与空气接触后,因结构含不饱和脂肪酸被氧化后而呈黄色至黄棕色,粗制品中色素的存在可使之呈淡黄色。
卵磷脂中的胆碱基在碱性条件下可分解成三甲胺,三甲胺有特异的鱼腥味,利用此性质可鉴别卵磷脂。
在生物体中的作用是保持细胞膜的通透性,控制动物体内脂肝代谢,防止脂肪肝的形成。
在食品工业中广泛充当乳化剂、抗氧化剂和营养添加剂。
使互不相溶的两种液体中的一种呈微滴状分散在另一种液体中的作用称为乳化剂。
这两种不同的液体称为“相”,在体系中量大的称为连续相,量小的为分散相,能使互不相溶的两相中的一相分散在另一相中的物质称为乳化剂。
由卵磷脂的分子结构可知:
卵磷脂分子中的R1脂肪酸为硬脂酸或软脂酸,R2脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等不饱和脂肪酸。
脂肪酸残基端具有憎水性,其胆碱残基端具亲水性,因此是一种天然的乳化剂。
在乳化过程中,当少量的油与乳化剂一起在大量水中用高速搅拌混合机混合,油滴将以微滴状分散在水相中,在细滴的表面上乳化剂以亲油的非极性端相对,而以其亲水的极性端伸向水中。
由于极性相斥,体系中微滴之间的斥力比相互间的引力要大,因而形成稳定的乳浊液。
乳浊液的稳定性与系统中各组分间的比例、乳化剂种类及其用量、乳化的机械条件等密切相关。
食品工业中可从大豆油精练过程中获得廉价卵磷脂。
三、试剂及材料
1、95%乙醇
2、10%NaOH溶液称取10g氢氧化钠,用蒸馏水溶解并稀释至100mL。
3、鸡蛋
4、花生油
四、仪器设备
1、电热恒温水浴锅
2、磁力搅拌器
3、高速电动搅拌机
4、摄像显微系统(由电脑、摄像头、显微镜、摄像控制软件组成)
五、操作方法
(一)卵磷脂的提取
选新鲜鸡蛋一个,轻轻在鸡蛋两头击破一小孔,让蛋清从小孔流出,破壳取出蛋黄置小烧杯内,捣烂,搅拌下加入50℃95%乙醇60mL,,保温提取5min,冷却过滤,将滤液置于瓷蒸发皿,水浴蒸干,残留物即为卵磷脂。
(二)鉴定卵磷脂
1、三甲胺试验:
取少量本实验提取的卵磷脂于试管内,加入2mL10%NaOH,混匀,水浴加热,嗅之是否产生鱼腥味。
2、丙酮溶解试验:
加入约5ml丙酮于装有卵磷脂提取物的瓷蒸发皿,不断用玻棒搅拌卵磷脂观察其在丙酮中的溶解情况。
同时也是提纯卵磷脂的过程。
(三)乳化试验:
1、乳化液制备:
按下表选择乳化液制备方法。
序号
蒸馏水
花生油
卵磷脂
乳化处理方法及处理时间
1
100mL
1mL
/
2
100mL
1mL
适量
2、利用显微摄像系统观察油脂在水中的乳化效果并对乳化液与非乳化液进行摄像,根据油脂在水相中的分散情况,评价油脂乳化试验的效果。
乳化效果摄像操作步骤:
(1)水平放置显微镜,开启并调节照明光源,装上合适的目、旋上适当的低倍物镜。
(2)用点滴管取少量乳化液滴在载玻片上,小心把盛有样品的载玻片放上光学显微镜的物台,用标本固定夹固定。
移动标本移动器,使观察的部位对准聚光器上面的透镜中心。
(3)上下移动显微镜的粗调选钮,使物镜下至距离标本片最低的位置,但不能接触载玻片以免损坏镜头或标本。
(4)用眼睛在目镜上观察,两手向上慢慢旋动粗调使显微镜上升至视野中出现较清晰的被检物。
(5)移动载片标本,寻找具有代表性的被检物点放在视野中心,反复调整微调旋钮使被检物至最清晰为止。
(6)把摄像头放入摄像连接管,拉开摄像光路开关,进入电脑摄像软件应用程序,把鼠标移至USB2.0相机菜单,出现连接按钮,点击连接→调整显微镜微粗细调旋钮至要检测的图象在视屏中清晰为止→点击捉捕图象键,对图象进行摄像→对摄影像片进行保存。
点击视屏键可以返回图象观察状态,重新对另一图象进行摄像。
(7)测量摄像图中物体的大小:
进入DN-2应用软件→调处所存图片文件→点击测量菜单→选择线测量键→从测定物的起点拉动鼠标把测量连线连至测定物终点,从屏幕中可直接读出物体相关长度值(单位:
μm)→点击融合键,将测量值标注在图片中→保存测量图片结果。
(8)打印分析摄像图谱。
3、乳化结果记录
乳化液处理静置15min后,观察比较各乳化实验结果并记录。
乳化剂种类
油水分散处理
方法及条件
描述油水乳化体系
感官分析
描述显微镜观察油水乳化体系情况(油滴分散、大小等)
无
卵磷脂
六、实验结果讨论分析
七、思考题
1、向卵磷脂粗品添加丙酮的作用是什么?
可去除何种杂质?
2、乳化过程要形成稳定的乳浊液,可采用什么仪器方法实现?
3、使用生物显微镜的操作要点是什么?
实验三、蛋白质的盐析透析
一、蛋白质盐析
(一)目的要求了解蛋白质的沉淀作用,加深对影响蛋白质胶体分子稳定性因素的认识。
(二)实验原理
水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷,增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒,水膜和电荷一旦被除去,蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。
向蛋白质溶液中加入无机盐(如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等)后,蛋白质便从溶液中沉淀析出,这种沉淀作用称为蛋白质盐析。
其过程是一个可逆过程,当除去引起蛋白质沉淀因素后,被盐析的蛋白质仍可重新溶于水中,其天然性质不发生变化。
用不同浓度的盐可将不同种类蛋白质从混合溶液中分别沉淀的过程,称为蛋白质的分级盐析。
例如蛋清溶液中的球蛋白可被半饱和的硫酸铵溶液沉淀提取,饱和的硫酸铵溶液可使清蛋白沉淀析出。
因此,盐析法常被用于分离和提取各种蛋白质及酶制剂。
(三)试剂及材料
1、10%蛋清溶液选新鲜鸡蛋,轻轻在蛋壳上击破一小孔,取出蛋清,按新鲜鸡蛋清1份,九份0.9%NaCl溶液的比例稀释配制蛋清液,混匀,用四层纱布过滤后备用。
2、饱和硫酸铵溶液称取76.6g硫酸铵溶于100mL25℃蒸馏水中。
3、固体硫酸铵。
(四)操作方法
1、取两支试管,分别加入10%蛋清溶液5mL,饱和硫酸铵5mL,静置5min,观察有否沉淀物产生,沉淀物为何物?
2、取其一试管,用点滴管弃去上清夜,加水至沉淀物,观察沉淀是否会再溶解,说明沉淀反应是否可逆。
3、用滤纸把另一试管的沉淀混合物过滤,向滤液中添加固体硫酸铵至溶液饱和,注意观察溶液有否蛋白质沉淀产生,此沉淀又为何物?
注意:
把溶液中硫酸铵固体沉淀与蛋白质沉淀区别开来。
二、蛋白质的透析
(一)目的要求学习透析的基本原理和方法
(二)实验原理
透析是利用小分子能通过,而大分子不能透过半透膜的原理,把不同性质的物质彼此分开的一种手段。
透析过程中因蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中,不断更换透析用水即可将蛋白质与小分子物质完全分开。
蛋白质和酶的提取过程,常用此法使之脱盐。
如果透析时间过长,可采用低温条件下进行,以防止微生物滋长、样品变质或降解。
透析袋材料通常有火棉胶、商品化透析袋等。
利用硝酸银和双缩脲反应的透析结果进行检验:
(三)试剂及材料
1、氯化钠蛋清溶液取一个鸡蛋清蛋白,加入30%NaCl溶液100mL、250mL蒸馏水混合均匀后,四层纱布过滤。
2、1%AgNO3称取1gAgNO3,溶解于100mL水中,贮存棕色瓶保存。
3、1%CuSO4称取1gCuSO4,用水溶解并稀释至100mL。
4、10%NaOH称取10gNaOH,用水溶解并稀释至100mL。
5、5%火棉胶分析纯。
(四)操作方法
1、透析袋的制备直接把5%火棉胶试剂约10mL倒入洁净、干燥的100mL三角锥瓶底部,然后徐徐转动三角瓶,使火棉胶由底部至瓶口均匀分布于瓶内壁,同时弃去多余的火棉胶,将三角瓶倒置,自然风干10min。
小心剥离三角瓶口薄胶,引自来水沿瓶内壁与袋膜间流入,使透析袋与瓶壁逐渐分离,取出透析袋,同时检查透析袋的完好性。
2、透析把10mL氯化钠蛋清液注入透析袋内,扎紧透析袋顶部,系于一横放在盛有蒸馏水的烧杯的玻璃棒上,调节水位使透析袋完全浸没蒸馏水中。
3、透析情况检验
(1)无机盐透析检验:
透析10min后,自烧杯中取透析用水2mL于试管中,用1%AgNO3检验氯离子是否能被透析出。
(2)蛋白质透析检验:
自烧杯中另取透析用水2mL于试管中,加入2mL10%NaOH,摇匀,再加1%CuSO4数滴,进行双缩脲反应,检验蛋白质是否被透析出。
(3)不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析进行,经数小时侯烧杯中的水不再有氯离子检出为止,则表明透析完成。
因为蛋清溶液中的清蛋白不溶于纯水,此时可观察到透析袋中有蛋白沉淀出现。
三、实验结果讨论分析。
四、思考题
1、制作透析袋时能否用采用热风干燥加速其成膜?
为什么?
2、高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响,为什么?
3、盐析与透析在蛋白质、生物酶提取纯化中的意义。
4、蛋白质可逆沉淀反应与不可逆沉淀反应的区别在哪里?
举例说明。
实验四、氨基酸纸电泳分离鉴定
一、目的要求通过电泳分离氨基酸,了解氨基酸的性质以及电泳分离技术的应用。
二、实验原理
带电粒子(胶体或分子)在直流电场作用下,能向异性电极迁移,这种现象称为电泳。
带电粒子之所以能在电场的作用下迁移,是因为在一定PH环境条件下,不同的物质所带的电荷种类、数量不同,在一定的电场作用下,就以不同的速度向不同的电极方向移动,从而达到分离混合物和鉴定未知物的目的。
带电粒子在电场内移动的方向及电泳速度,除取决于粒子的分子量和电荷量外,还与电场强度、溶液PH、缓冲溶液的离子强度以及电渗等因素有关。
电泳是离子在电场中通过介质的移动,按支持介质的不同可分为:
(1)纸电泳:
以滤纸、玻璃纤维等为支持物。
(2)凝胶电泳:
以聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等为支持物。
(3)薄膜电泳:
醋酸纤维素为支持物。
氨基酸分离选用滤纸为支持介质进行电泳。
氨基酸在水溶液中通常解离成两性离子,它在酸性和碱性介质中的变化可用下式表示:
在酸性介质中,氨基酸主要以阳离子状态存在,电泳时向阴极移动;在碱性介质中,氨基酸主要以阴离子状态存在,电泳时向阳极移动,当介质的PH值为氨基酸的等电点时,氨基酸以中性偶极离子存在,电泳时不向阴阳电极移动。
实验在pH=5.9的缓冲溶液中进行,一张被PH5.9缓冲溶液所湿润的滤纸的两端加上直流电压,在电场的作用下,加在滤纸支持介质的各种氨基酸样品,由于所带电荷性质不同,分别向正负极方向移动,电泳体系缓冲溶液偏离氨基酸的等电点越远,氨基酸所带的电荷越多,离子移动的速度也就越快,因各氨基酸迁移的速度均不相同,从而达到分离的目的。
三、试剂及材料
1、PH5.90.025mol/L邻苯二甲酸氢钾—氢氧化钠缓冲溶液称取邻苯二甲酸氢钾
5.10g,加水溶液至950mL,用氢氧化钠调整PH=5.9,补水至1000mL。
2、氨基酸溶液0.5%亮氨酸、0.5%赖氨酸、0.5%天门冬氨酸。
3、氨基酸混合液。
4、氨基酸显色液0.1%茚三酮丙酮溶液。
四、仪器设备中压电泳仪、电泳槽。
五、操作方法
1、电泳滤纸的裁剪取层析滤纸裁成250×25mm的滤纸条,用铅笔在滤纸的中心位置标记样品电泳时的起始位置,在滤纸的两端标上正负极符号。
如下图所示。
(+)×(-)
2、向电泳槽添加适量的缓冲溶液,要求两槽缓冲液液面保持同一
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