祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠组织蛋白酶B和肿瘤坏死因子α表达的影响.docx
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祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠组织蛋白酶B和肿瘤坏死因子α表达的影响
祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠组织蛋白酶B和肿瘤坏死因子α表达的影响
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
【摘要】研究祛湿化瘀方防治大鼠非酒精性脂肪肝的作用机制。
方法:
除正常对照组5只外,Wistar雄性大鼠30只运用四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)皮下注射联合高脂低蛋白饮食建立非酒精性脂肪肝模型。
自造模2周后,随机分为模型组、祛湿化瘀方组和甘乐(复方二氯醋酸二异丙胺)组,每组10只,分别予祛湿化瘀方和甘乐10ml/kg灌胃。
用药2周后取材,检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)活性和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNFα)含量、肝组织甘油三酯(triglyceride,TG)和游离脂肪酸(freefattyacid,FFA)含量;并分析其指标间的相关性。
蛋白印迹法检测肝组织组织蛋白酶B(cathepsinB,Ctsb)、磷酸化κB抑制蛋白(phosphoinhibitorkappaB,PIκB)和TNFα蛋白表达。
免疫组织化学染色检测肝组织中Ctsb表达。
结果:
祛湿化瘀方可显著降低模型大鼠肝组织TG(P0.05)、FFA(P0.01)含量和血清ALT活性(P0.05),而对照药物甘乐只显示有降低ALT活性(P0.05)作用;模型组肝组织Ctsb、PIκB、TNFα蛋白表达均高于正常对照组,同时血清TNFα水平显著上升;而祛湿化瘀方组的上述蛋白表达则低于模型组。
肝组织TG与FFA含量、血清ALT活性呈正相关;血清TNFα与肝组织FFA含量、血清ALT活性呈正相关。
结论:
祛湿化瘀方抑制肝脏脂肪沉积和炎症作用可能与其抑制FFA以减轻其下游“FFACtsbTNFα”肝脂毒性通路有关。
【关键词】非酒精性脂肪肝祛湿化瘀方游离脂肪酸瘤坏死因子织蛋白酶B大鼠Methods:
ThirtyfiveWistarmaleratswererandomlydividedintonormalgroup,untreatedgroup,QHDgroupandGanle(diisopropylaminedichloroacetate)group.Theratsexceptthoseinnormalgroupweresubcutaneouslyinjectedwithcarbontetrachloride(CCl4)for4weeks(twiceperweek)andsimultaneouslyfedwithhighfatandlowproteindietfor2weekstoinduceNASH.Then,theratswereadministratedwithQHD,Ganle,ordistilledwaterfor2weeks,respectively.Afterharvest,alanineaminotransferase(ALT)activityandtumornecrosisfactorα(TNFα)contentinserumaswellastriglyceride(TG)andfreefattyacid(FFA)inlivertissuewereevaluated,andrelativityanalysisamongtheseparameterswasperformed.CathepsinB(Ctsb),phosphoinhibitorkappaB(PIκB),TNFαproteinexpressionsinlivertissuewereassayedwithwesternblot.Theexpressionanddistributionofctsbinlivertissuewereobservedwithimmunohistochemicalmethod.Results:
ThecontentsofTG,FFAandactivityofALTweresignificantlydecreasedinQHDgroup.WhileintheGanlegroup,onlytheactivityofALTinserumwasdecreasedsignificantly.ExpressionsofCtsb,PIκBandTNFαproteinsinlivertissuesandserumTNFαlevelwereallenhancedinuntreatedgroupwhich,however,weresignificantlyinhibitedintheQHDgroup.Andasexpected,thereweresignificantrelativitiesamongcontentsofTGinlivertissuesandthecontentofFFAinlivertissueandactivityofALTinserum,contentofTNFαinserumandcontentofFFAinlivertissueandactivityofALTinserum.Conclusion:
TheinhibitingeffectsofQHDonfatdepositionandinflammationinliverarerelatedwithitsinhibitiononthe“FFACtsbTNFα”pathwayoflipotoxicity.Keywords:
nonalcoholicfattyliverdisease;QushiHuayuDecoction;freefattyacid;tumornecrosisfactorα;cathepsinB;rats我们前期实验发现祛湿化瘀方(QushiHuayuDecoction,QHD)对四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)联合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠脂肪肝有显著的防治作用[1],能显著降低大鼠肝组织甘油三酯(triglyceride,TG)和游离脂肪酸(freefattyacid,FFA)含量,减轻肝损伤。
FFA可以通过肝细胞溶酶体途径,促使组织蛋白酶B(cathepsinB,Ctsb)释放到胞浆,刺激肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNFα)的表达,造成肝脏脂毒性肝损伤[2]。
我们推测该方可能对“FFACtsbTNFα”通路有重要影响,并初步经体外实验证实[3]。
为此,本实验运用CCl4复合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)动物模型,观察Ctsb和TNFα的变化及祛湿化瘀方的干预作用,进一步探讨其作用机制。
1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物Wistar雄性大鼠35只,体质量(170±10)g,SPF级,购自中国科学院上海实验动物中心。
动物合格证号为SCXK(沪)20030003。
1.1.2药物和试剂祛湿化瘀方由虎杖、姜黄、茵陈、田基黄和栀子5味中药组成。
采取乙醇提取和水提合煎的提取工艺,配制成含生药1.16g/ml的祛湿化瘀方药液,由上海中医药大学科技中心协助制备。
复方二氯醋酸二异丙胺片,商品名为甘乐,2mg/片,批号H21023819,购自辽宁丹东制药厂,将片剂碾成粉末状,按2mg甘乐︰1ml蒸馏水,配成浓度为2mg/ml的悬浊液。
CCl4和橄榄油均购自中国医药集团上海化学试剂公司,用时配成40%CCl4橄榄油溶液;血清丙氨酸转移酶(alanineaminotransferase,ALT)、TG和FFA试剂盒均购自南京建成生物制品研究所;大鼠血清TNFα酶联免疫吸附检测试剂盒和多克隆羊抗大鼠TNFα一抗,购自R&D公司;单克隆小鼠抗大鼠磷酸化κB抑制蛋白(phosphoinhibitorkappaB,PIκB)一抗、多克隆兔抗大鼠Ctsb一抗均为CellSignalingTechnology公司产品;单克隆小鼠抗大鼠甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase,GAPDH)一抗,为康成生物科技公司产品;多克隆兔抗羊二抗,为JacksonImmunoresearchLaboratories公司产品;羊抗兔IgG多克隆二抗、兔抗小鼠单克隆二抗,均为SantaCruzBiotechnology公司产品。
1.2实验方法1.2.1模型选择和制备方法CCl4联合高脂低蛋白饮食因素诱导的大鼠脂肪肝模型[1]:
首次用100%CCl45ml/kg体质量在大鼠背部作皮下注射,后以40%CCl4橄榄油溶液按3ml/kg体质量在大鼠背部作皮下注射,每周2次,共4周。
造模的第1和第2周饲以高脂低蛋白玉米粉饲料(79.5%玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇),第3和第4周以纯玉米粉饲养。
1.2.2动物分组与用药除正常对照组外(n=5),造模2周后将30只大鼠随机分为模型组、甘乐组和祛湿化瘀方组,每组10只。
治疗组大鼠分别予祛湿化瘀方和甘乐10ml/kg灌胃,1/d,共2周。
正常对照组和模型组大鼠予等量生理盐水灌胃。
祛湿化瘀方组和甘乐组大鼠在实验过程中因意外因素各死亡1只。
1.2.3观察指标及方法治疗2周后,下腔静脉采血,并取肝组织。
(1)血清ALT活性测定:
按生化试剂盒说明书进行检测。
(2)肝组织TG含量检测:
取200mg湿肝,加入乙醇丙酮(1︰1)液3ml,制备肝组织匀浆液,用TG试剂盒检测,以每克肝组织含多少毫克TG来表示。
(3)FFA含量检测:
取100mg湿肝,加0.9ml生理盐水,制备10%肝组织匀浆液,按试剂盒步骤检测。
(4)酶联免疫吸附法检测血清TNFα含量:
用酶联免疫吸附试剂盒检测正常对照组、模型组和祛湿化瘀方组大鼠血清TNFα含量,按试剂盒说明书进行。
(5)蛋白印迹法检测肝组织中TNFα、PIκB和Ctsb蛋白表达:
半定量分析运用计算机图像分析系统光密度扫描,求出蛋白表达的灰度值。
将目的蛋白灰度值除以内参照灰度值,并以正常组为单位1,作柱状图。
(6)免疫组织化学染色检测肝组织Ctsb表达:
石蜡切片进行脱蜡至水,胰蛋白酶消化,小牛血清白蛋白封闭,然后分别滴加一抗、二抗及显色液。
其中,阴性对照组是指正常组不滴加Ctsb一抗,用PBS代替。
1.3统计学方法所有数据使用SPSS11.0软件包进行统计学分析。
相关性分析采用Bivariate相关分析。
多组间比较用方差分析,组间比较用多重检验。
计量资料数据用x±s表示。
2结果2.1各组大鼠血清ALT活性和TNFα含量模型组大鼠血清ALT活性高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.01)。
祛湿化瘀方及甘乐均能降低模型大鼠血清ALT活性(P0.01),其抑制率分别达67.7%和66.1%。
模型组大鼠血清TNFα含量高于正常对照组(P0.05),而祛湿化瘀方组大鼠血清TNFα含量低于模型组(P0.05),其抑制率达75.8%。
见表1。
2.2各组大鼠肝组织TG和FFA含量模型组大鼠肝组织TG和FFA含量高于正常组(P0.01),分别达正常对照组的5.3倍和1.9倍。
祛湿化瘀方组大鼠肝组织的TG含量低于模型组(P0.05),其抑制率为25.8%。
甘乐组大鼠肝组织TG含量较模型组有下降趋势,但差异无统计学意义。
祛湿化瘀方组大鼠肝组织中FFA含量低于模型组和甘乐组(P0.01),抑制率高达82.7%,并低于甘乐组(P0.01)。
甘乐组和模型组比较,差异无统计学意义。
见表1。
表1大鼠血清ALT活性和TNFα含量及肝组织TG、FFA含量2.3肝损伤指标和肝脂肪含量相关性分析相关性分析结果表明,肝组织TG与FFA含量(y=0.0382x+10.15,r=0.628,P0.01)、血清TNFα与肝组织FFA含量(y=0.0063x+10.321,r=0.577,P0.05)存在正相关,血清ALT活性与肝组织TG含量(y=0.2796x+31.73,r=0.504,P0.01)、血清ALT与TNFα(y=5.8931x-11.567,r=0.528,P0.05)之间呈显著正相关。
见图1。
2.4各组大鼠肝组织TNFα、Ctsb蛋白表达及IκB磷酸化水平的变化正常组大鼠肝组织少量表达TNFα、Ctsb蛋白,几乎检测不到IκB磷酸化,而模型组肝组织TNFα、Ctsb蛋白表达及IκB磷酸化水平均显著增加,祛湿化瘀方组TNFα、Ctsb蛋白表达及IκB磷酸化水平低于模型组。
见图2、3和4。
2.5各组大鼠肝组织Ctsb免疫组织化学染色变化正常大鼠肝脏中,Ctsb棕色颗粒呈点状分布(和溶酶体定位一致),正常组(阴性对照)无Ctsb表达。
模型组Ctsb蛋白表达显著增加,胞浆中可见大量的棕色颗粒,而祛湿化瘀方组Ctsb表达明显减少。
见图5。
3讨论本实验结果提示,祛湿化瘀方有抗肝脏炎症和降低肝脏脂质的作用。
该方能明显降低模型大鼠肝组织中FFA、TG含量和血清ALT活性、TNFα含量。
我们对上述指标进行相关性分析,肝组织TG与FFA含量、血清ALT活性呈正相关;血清TNFα与肝组织FFA含量、血清ALT活性呈正相关。
提示其脂肪沉积含量与肝损伤程度密切相关。
那么,FFA是通过什么途径引起TNFα表达,导致肝损伤的呢?
Feldstein等[2]研究发现,FFA可以通过肝细胞溶酶体途径刺激TNFα表达,造成肝脏脂毒性。
经FFA刺激后,首先Bax向溶酶体内转位,促使Ctsb释放到胞浆,激活IκB激酶β(IKKβ)使IκB磷酸化降解,导致NFκB的活化,使之向细胞核内移位,启动炎症因子如TNFα的基因转录,大量表达引起TG的蓄积,发生脂肪变性;TNFα又能进一步促进溶酶体渗透,激活NFκB,这样形成一个加重肝损伤的循环即“FFACtsbTNFα”通路。
因此,我们鉴于本实验中“FFATNFα(肝损伤)”存在显著正相关,进一步观察Ctsb的变化以及该方对Ctsb环节的影响。
本实验通过蛋白印迹检测发现模型组大鼠肝组织Ctsb表达增加,而祛湿化瘀方明显降低了Ctsb的表达。
同时免疫组织化学染色结果表明模型组胞浆中可见大量的Ctsb棕色颗粒,而祛湿化瘀方组Ctsb表达明显减少。
Ctsb是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶,参与多种疾病的病理过程[4,5]。
Werneburg等[6]在研究中发现,Ctsb在TNFα诱导的肝脏损伤中发挥着重要的作用,TNFα通过caspase8和Bid介导可引起溶酶体释放Ctsb。
Guicciardi等[7]敲除小鼠Ctsb基因后,发现能够对抗TNFα相关的肝细胞凋亡,其作用机制在于抑制线粒体释放细胞色素C和caspase活化;另有报道提示抑制Ctsb活性可以部分减轻TNFα引起的肝损伤[8]。
本实验结果表明祛湿化瘀方可通过抑制FFA以减轻其下游Ctsb的表达。
那么,该方是否抑制了NFκB的活化?
NFκB是细胞中普遍存在的一种介导细胞内信号传递的转录因子,在炎症反应的复杂细胞因子网络中,NFκB的激活可能是一中心环节[9]。
当细胞处于静息状态时,NFκB与其抑制蛋白IκB结合,以三聚体失活状态存在于细胞质中,当机体受到外界因素刺激时,IκB发生磷酸化,并从NFκB二聚体上解离,暴露p50的核定位信号,NFκB得以激活并移位进入细胞核,结合免疫炎症相关靶基因上特异的κB结合位点,启动炎症因子如TNFα的基因转录,导致炎症反应和肝损伤[10,11]。
本研究Westernblot检测表明,祛湿化瘀方能抑制PIκB蛋白表达,从而抑制了NFκB的活化,通过NFκB/IκB信号转导途径抑制TNFα蛋白表达、阻断TNFα的生物活性和靶效应。
由此可见,祛湿化瘀方抑制肝脏脂肪沉积和炎症的作用机制之一在于抑制了“FFACtsbTNFα”肝脂毒性信号通路。
该方可通过抑制FFA以减少其下游Ctsb的表达进而抑制NFκB的活化和TNFα的表达,从而减轻肝损伤。
【参考文献】1ZhangH,FengQ,HuYY,etal.Preventionandtreatmentof“QushiHuayuDecoction”onfattyliverofratsinducedbycarbontetrachloridealongwithhighfatandlowproteindiet.ShanghaiZhongYiYaoZaZhi.2006;40(3):
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