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awoklzo
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1我们‖打〈败〉了敌人。
②我们‖〔把敌人〕打〈败〉了。
浙江大学医学院神经生物学实验室常用实验流程
目录
1、琼脂糖电泳分离的DNA片段的回收
2、感受态细胞的制备
3、DNA的转化
4、小量质粒DNA提取和纯化
5、中量质粒DNA提取和纯化
6、聚合酶链式反应操作(PCR)
7、点突变形成
8、诱导表达及检测
9、SDS-PAGE和WESTERNBLOT
10、免疫共沉淀(HEK293T细胞)
11、免疫组化
12、细胞培养注意事项及常用溶液配置方法
13、细胞传代培养(消化法)
14、细胞的复苏
15、细胞冻存
16、海马神经元原代培养
17、免疫细胞化学
18、HEK293T细胞转染(10cm培养皿)
19、磷酸钙介导的神经元转染
20Co--IP
21MBP-PICKI表达纯化
22RNA提取步骤
补充磷酸钙转染
溶液配置
1、琼脂糖电泳分离的DNA片段的回收
(详见Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒产品说明。
)
准备工作:
调整到75°C水浴;在BufferW2中按标签上指定的体积加入无水乙醇。
记录每个1.5mlEppendorf(自备)的重量:
为A重量(g)
分别将两小块胶(cDNA和载体)切下、切碎,放入1.5mlEppendorf,再次称重:
为B重量(g)
加入3×(B-A)ml的DE-A液,75°C×7min(使胶溶解完全)
加入1.5×(B-A)ml的DE-B液,混匀(翻转混匀即可)
短速离心,使管壁和管盖上的溶液沈降到管底。
将DNA制备管放入2ml离心管(试剂盒提供)中。
将以上混合液,加入DNA制备管,5000rpm离心1分钟
弃去滤液,将制备管放回到2ml离心管中,加入0.5mlW1溶液,5000rpm离心1分钟
弃去滤液,将制备管放回到2ml离心管中,加入0.7ml
W2溶液,5000rpm离心1分钟
重复一次
将DNA制备管放回到2ml离心管中,12000rpm×1min,弃此2ml离心管
将DNA制备管放入无菌1.5ml离心管(试剂盒提供)中,在DNA制备膜正中加25ulEluent
静置1min
12000rpm×1min,收集DNA,约25ul
2、感受态细胞的制备
实验准备:
无抗性LB平板,1ml装、6ml装LB小管,100ml装LB锥形瓶,0.1mol/L的氯化钙,0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油,50ml离心管。
实验步骤:
因为整个过程中没有使用抗生素所以要特别注意无菌操作!
1.铺无抗性的LB平板。
为避免意外,一般铺两块无抗性LB平板。
2.用1ml的枪戳几下菌库中的菌种,使得枪头上带有少量冰渣。
这个过程要迅速,避免菌种发生冻融或污染。
3.将冰渣溶于1ml37℃预热的LB中,充分混匀后,用枪吸取20ul转移至另一只装有1ml37℃预热的LB的EP中,混匀后取100ul涂板。
37℃孵育14个小时。
观察菌落数量和相关理化特征,用封口膜密封4℃冻存。
4.用牙签挑取单克隆至4~6ml无抗性LB小管中260rpm12小时(活化)。
这一步可以多挑几个克隆,以防其长不出来和有明显的污染。
5.取500ul菌液到100ml无抗生素的LB锥形瓶中300rpm3小时。
注意观察,控制菌的浓度在OD600时不要超过0.6。
6.把100ml菌液分装在两只50ml离心管(已灭过菌)中,冰浴10分钟。
7.5000rpm、4℃离心10分钟,弃上清。
离心机需要4℃预冷。
8.用0.1mol/l的氯化钙10ml重悬浮。
徒手将50ml离心管反复戳于冰上从而使细菌重悬浮。
因为感受态细胞比较脆弱易破损,故重悬浮时不宜使用震荡仪。
悬浮要充分!
9.5000rpm、4℃离心10分钟,弃上清。
10.用0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油2ml重悬浮。
注意事项同8。
11.以200ul每管分装,分装后冻存于-80℃。
注明制备日期和菌名。
注意事项:
因为培养基无抗性,故无菌操作是整个感受态制备的关键。
制备过程最好带上口罩,所有的用具需要充分灭菌。
为了保证感受态的质量所有的步骤都需在冰上进行。
方法二:
做感受态细胞步骤:
(材料要灭菌,并无菌冰上操作)
1,从-70度拿出库存的大肠杆菌,用划线涂布法接种于不加任何抗生素的基本培养皿上(取稀释之意,或拿1ml枪头在冰上没融化的菌中浸一下,放入1mlLB中,再吸20ul入另一个1mlLB中,再吸另一个的100ul铺板)37度倒置培养12-16小时(DH-5a)
2,挑一克隆于6ml不加任何抗生素的LB中,250r/min37度,振12小时。
培养皿挑好后放入4度冰箱
3,吸500ul菌液于不加任何抗生素的LB100ml锥形瓶中,300r/min37度,振3小时,然后把锥形瓶放在写有字的纸上,透过菌液可看清纸上的字,并测OD约为0.6(吸1ml),如果每到这个值就再大约摇半小时再测OD约为0.6就可以。
4,将两个50ml试管冰上预冷,再将培养液放入(倒入)其中,冰上10分钟。
5,7号转头4度5000rpm10分钟
6,弃干上清,扣干凉1分钟,再各加10ml0.1mol/LCaCl2(每50ml菌液10mlCaCl2)(CaCl2不含甘油,从4度拿出在冰上预冷,用无菌移液管吸)
7,冰上轻旋摩擦开菌斑(要轻,并且所有内容物保持在冰中)之后再放在冰上30分钟。
8,4度4100rpm10分钟
9,弃上清,扣干凉1分钟
10,两管各加含甘油CaCl22ml(每50ml菌液加2ml甘油CaCl2)(其中15体积甘油Glycerol85体积CaCl2,从4度拿出在冰上预冷,用枪吸),再用同样的方法冰上轻旋摩擦开菌斑
11,在冰上分装100ul或200ml的多个管子
12,-80度冷藏
3、DNA的转化
准备工作:
制冰,42°C水浴,37°C摇床,37°C预热LB
自制的感受态细胞
加20ul连接产物
冰上30'
42OC水浴90秒(热休克,时间要求精确)
冰上2'
加800ulLB(-)(预先37OC预热)
摇床,37OC225转/分45分钟
400ul菌液涂平板,37OC温箱中培养过夜
同时做两个对照:
对照组1:
以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2:
以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。
计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
[注意]本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
4、小量DNA提取和纯化
溶液配置:
LB液体培养基(1000ml)
蛋白胨(tryptone)10g
酵母提取物5g
NaCl10g
调pH到7.2,高压灭菌
LB固体培养基
100mlLB+1.5gAgarB->灭菌;
感受态细胞制备过程中所需平板不需加抗生素,灭菌后LB可直接铺板;
若用于制作转化平板,需待LB自然冷却至50-60oC,加入60μg/ml氨苄或30ug/ml卡那(实验室内氨苄和卡那浓缩液均为100mg/ml)后铺板。
挑克隆(摇菌扩增)
1.从冰箱里取LB培养基和转化平板.将氨苄青霉素取出后置于冰上自然融化
2.点燃酒精灯创造无菌圈.取15ml培养管(做好标记),分别加入4ml液体LB培养基和4μl的100mg/ml的氨苄青霉素,使终浓度达到100μg/μl
3.用中号镊子夹取牙签从转化平板挑取单克隆,迅速投入做好标记的15ml培养管中
4.将培养管盖子在酒精灯上烫一下,将培养管盖上(注意无菌操作)
5.将15ml培养管置于300rpm37oC的摇床上培养12h(扩增)
(详见Axygen日常型质粒DNA小量纯化试剂盒)
准备工作:
如果S2溶液出现沉淀,37℃水浴溶解沉淀后再使用(特别是冬天);将所有RNaseA加入到S1溶液中;在BufferW2中按标签上指定的体积加入无水乙醇;S3入4℃冰箱(冬天可以省略)。
12500rpm×1min×1.5mleppendorf(自备)2次回收沉淀
每管(3ml菌液)以0.25ml含RNaseA的S1溶液,使沉淀悬浮完全(votex)
每管加入0.25mlS2,上下翻转使菌液裂解,至形成透亮溶液(此步骤<5min,不得votex)
每管加入0.40mlS3(4℃),上下翻转,至凝集块完全产生
12,000rpm×10min
将DNA制备管放入2ml离心管中。
将上清加入DNA制备管,5,000rpm离心1分钟
弃去滤液,将制备管放回到2ml离心管中,加入0.5mlW1溶液,5000rpm离心1分钟
弃去滤液,将制备管放回到2ml离心管中,加入0.7ml
W2溶液,5000rpm离心1分钟
重复一次
将DNA制备管放回到2ml离心管中,12000rpm×1min,弃此2ml离心管
将DNA制备管放入无菌1.5ml离心管(试剂盒提供)中,在DNA制备膜正中加60ulEluent
静置1min
12000rpm×1min,收集DNA,约60ul
5、中量质粒DNA提取和纯化
天平,预冷离心机,三蒸水;预冷P3
1.将菌液倒入EP管,配平离心,4oC6,000g,离心15min倒掉上清(主菌斑足够);
2.加入4mlP1(从冰箱中取出),用振荡器重悬细菌;
3.加入4mlP2(P2在冬天可能有沉淀,应37oC温浴),温和但充分翻转4-6次(快而充分的混匀),室温静置5min;
4.加入4ml预冷的P3,温和但充分翻转4-6次,冰上静置15min;
5.4oC20,000g离心30min,迅速转移上清至另一50mlEP中;
6.4oC20,000g离心15min;
7.期间平衡柱子,4mlBuffQBT至QLAGEN-tip100,重力自然流尽;
8.将离心好的上清加入QBT至QLAGEN-tip100,重力自然流尽;
Note:
为避免白色沉淀倒入柱中,应在倒上清时缓慢旋转EB管,使飘浮的白色沉淀贴在EP管壁上
9.10mlbufferQC灌洗QLAGEN-tip100;
10.重复;
11.取一个7ml管放于柱下,5mlbufferQF洗脱DNA;
12.另取一个7ml管,将5ml溶液分别装入两管(如不分,下一步加完后会超过7ml);
13.每管加入1.75ml室温下保存的异丙醇(混匀),沉淀DNA;
14.换离心机转子,4oC15,000g离心30min,小心弃去上清(DNA沉淀有可能悬浮在液体中,千万不要将管中的DNA沉淀倒掉);
15.期间准备2ml70%乙醇;
16.每管加1ml70%乙醇清洗DNA沉淀.4oC15,000g离心10min,小心弃去上清;
17.倒扣风干5-10min.每种质粒加TE(Ph=8.0)或无菌水60-100μl(视菌斑大小)重溶DNA;
18.每种质粒取1μl,稀释至100μl,测OD值。
6、聚合酶链式反应操作(PCR)
实验准备:
灭菌的PCR管(0.2ml);灭菌的10μl、250μl枪头;一对引物;4种三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTP):
模板;DNATaq酶;10×PCR反应缓冲液(PCRBuffer)
实验步骤:
1.在PCR管中依次混匀下列试剂
5μl10×PCRBuffer(含有Mg2+)
8μldNTP(终浓度200-400uM/L)
2μl引物1(10μM)(终浓度0.5-5.0uM/L)
2μl引物2(10μM)
1μl模板(0.2-1.0ug)
31μlddH2O
1μlTaq酶(2.5U)
50ul反应体系
注意:
整个加样过程要在冰上操作,并且要特别注意,避免污染。
2.加样完毕混匀后迅速离心数秒,使管壁上液滴沈至管底,
3.DNA扩增仪条件设置:
95℃×5min;使得DNA模板完全解链
95℃×1min;变性
56℃×1min;退火
注意:
退火温度取决于所设计引物的Tm值,尽可能控制引物的(G+C)%在40-60%,并且两条引物的(G+C)%尽可能保持一致,退火时间根据模板长度设定。
72℃×1min;延伸
注意:
延伸的时间要根据模板设定。
gotostep2,for30circles;循环
72℃×10min;补齐
4℃forever
End
注意:
由于现在可供选择的Taq酶很多,要根据自己的实验选择合适的Taq酶,比如要拉长片段的产物要选用保真度高以及能够拉长片段的酶,可以用LATaq,Pyrobest酶;一般情况可以选用rTaq酶等等。
7、点突变形成
为突变位点
第一步:
准备质粒,选定突变位点
将含有突变碱基的引物和模板质粒退火
第二步:
PCR扩增
利用KOD-PLUS(Taq酶)扩增,将突变掺入,得到含有缺刻的环状产物
用Fermentas公司的Dpn(选择性剪切GmATC)
第三步:
酶切去除没有突变的模板质粒
利用大肠杆菌自身修复系统,将质粒的缺克修复,并且在大肠杆菌内复制扩增。
第四步:
将片段转化大肠杆菌
1.引物长度为在突变位点左右12-15BP,总长度为30-40BP,GC比大于40%,两边以G或C结尾。
根据经验,引物总长度短些更好,模版DNA必须为新鲜刚抽提的。
2.
5μlof10×KOD-Plusreactionbuffer
5μlofdNTP2mmeach
2ulMgSO4
1μl35ngofdsDNAtemplate(5–50ng)
1μl(125ng)ofoligonucleotideprimer#1
1μl(125ng)ofoligonucleotideprimer#2
34ulddH2O
1μlofKOD-Plus
afinalvolumeof50μl
SegmentCyclesTemperatureTime
1195°C30seconds
2X95°C30seconds
55°C1minute(55°C--50°C<先用55℃退火,如果PCR没有得到条带可再降低温度至50℃>)
68°C7minute (1minute/kbofplasmidlength)
3.切胶回收(由于突变所用引物比较长,必须切胶回收去掉引物二聚体)
4.酶切去除没有突变的模板质粒:
Dpn11ul
10×Tangobuffer5ul
50ul体系
37℃保温1hour
5.切胶回收
6.转化铺板
8、蛋白质诱导表达及检测
挑一克隆到5mlLB试管中
摇床,37OC280转/分(过夜)
用无菌吸管转移200ul菌液
摇床,37OC280转/分至OD=0.6
(约2-3h)
加入0.5mM的IPTG诱导表达2小时(即加3ul/管)
菌液转移到离心管中,12,000rpm离心2分钟
弃上清,沉淀加入1.5上样缓冲液,混合均匀,沸水中煮5分钟,12,000rpm离心10min
聚丙烯酰胺凝胶电泳
考马斯亮兰染色
用40%及20%脱色液脱色
9、SDS-PAGE和WESTERNBLOT
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
制胶模具的准备(根据厂家说明书,本实验室的模具购自Bio-Rad公司)
分别灌制分离胶和浓缩胶,分离胶浓度视目的蛋白的大小确定(7.5-15%)
蛋白样本加入4×加样缓冲液,100℃煮3-5min使蛋白完全变性,然后加样
100-200V电泳使分离
卸胶,考马斯亮兰染色或WesternBlot
WesternBlot
取硝酸纤维素膜或PVDF膜,盖在凝胶上,电转移1-3小时(电压100V)
(转移时间由抗原的特性以及转移缓冲液中SDS的含量而定,一般为1小时)
胶为负极,膜为正极
取出硝酸纤维素膜或PVDF膜,在TBST缓冲液中短暂漂洗
放入封闭液中,温和振荡30分钟
把膜放入第一抗体中,温和振荡30分钟后放入4℃冰箱过夜或室温下反应2小时
回收第一抗体,在TBST中洗膜30分钟,中间更换TBST2-3次
把膜置于近红外染料标记的二抗(1:
5000,用封闭液稀释,并可在4℃避光保存重复使用)中,温和振荡1-2小时(闭光)
在1×TBST中洗膜2-3小时,中间更换4次以上(闭光)
沥干膜(干燥状态下,闭光保存可使膜上的荧光信号保持数月甚至更久)
扫描(根据特定的红外染料标记的二抗选择700或800nm的Odysseychannel)
定量
扫描和定量在Odyssey荧光成像系统(LI-CORBiosciences,USA)中进行。
SDS-PAGE及Westerb-blot常用溶液配制:
4×sampleBuffer
终浓度
Stock液
10ml工作液
0.25MTris-HCl,pH6.8
2.5M
1ml
8%SDS
20%
4ml
0.2MDTT
1M
2ml
30%glycerol
100%
3ml
少量的溴酚兰
分装后置-20℃保存。
SeparatingGelPreparation
7.5%
10%
12%
12.5%
15%
ddH2O
3.83ml
3.2ml
3.35ml
2.4ml
1.83ml
30%丙烯酰胺
2ml
2.64ml
4ml
3.36ml
4ml
1.5MTris-HClpH<8.8
2ml
2ml
2.5ml
2ml
2ml
10%SDS
80l
80l
100l
80l
80l
10%APS
80l
80
50l
80l
80l
TEMED
8l
8l
5l
8l
8l
总体积
8ml
8ml
10
8ml
8ml
StackingGelPreparation(0.4%gel,0.125Mtris,pH6.8)
ddH2O
3.05ml
4.8ml
30%丙烯酰胺
0.67ml
1.064ml
0.5MTris-HClpH6.8
1.25ml
2ml
10%SDS
50l
80l
10%APS
50l
80l
TEMED
5l
16l
总体积
5ml
8ml
考马斯亮兰:
0.1%考马斯亮兰+40%脱色液
40%脱色液:
40%甲醇+10%冰乙酸
20%脱色液:
20%甲醇+10%冰乙酸
5×runningbuffer
Tris15g
SDS5g
甘氨酸72g---------1L,pH8.3
Transferbuffer
Tris3.03g
甘氨酸14.4g
10%SDS5ml
甲醇200ml------------1L,pH8.1-8.5
10×TBST
Tris30.3g
NaCl80.1g-----调pH至7.6+10mlTween-20----1L
Blottingbuffer:
10%脱脂奶粉-TBST
10、免疫共沉淀(HEK293T细胞)
HEK传代转染
1.第1天HEK传代:
4ml培养液重悬细胞,滴8滴到60mm培养皿,4ml培养液传代。
2.第2天磷酸钙法转染(ddH2O,质粒,HEPES,CaCl2体积均提高3倍)。
3.第4天co-IP。
Co-IP
1.准备:
Aprotinin1000X储存液:
1mgAprotinin,1mlH2O,分装,–20C保存
PMSF1000X储存液:
8.7mgPMSF,500ul无水乙醇,4C保存
1:
1slurrypre-cleanedProtein-A(orG)beads:
1:
1为体积比,配置时大约是100mg粉末+1000ulddH2O,4C存放
2.新鲜配置4mlPBS/1%TritonX-100plusAprotininandPMSFperIPsample,放于冰上。
3.取25-50ul1:
1slurrypre-cleanedProtein-Abeads,500ulPBS洗两遍(2000rpm,2min)
4.每25-50ul珠子加入10-20ug抗体,加PBS到500ul,4C下旋转孵育1h
5.期间取出细胞,观察细胞状态,如有荧光还可在荧光显微镜下观察转染效率。
6.倒去原培养液,用室温下的PBS洗细胞两次,每次2mlPBS,最后一次洗后尽量将残液吸尽。
7.用1mlPBS/1%TritonX-100plusAprotininandPMSF刮下细胞。
8.将细胞转移到7mlEP管中,4C下旋转孵育30min-1h促溶。
9.孵育后4C下14000rpm离心20min。
10.期间取出孵育好的珠子/抗体,2000rpm离心2min,500ulPBS/1%TritonX-100plusAprotininandPMSF洗一次。
11.从第9步的上清中取出22.5ul,加7.5ul4×samplebuffer做为input样本。
12.将其余上清(小心用枪吸出上清)加入珠子/抗体重悬珠子,4C下旋转孵育
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