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树形分子doc
树形分子
树形分子(dendrimer)是20世纪80年代出现的一类新型合成大分子。
由于分子本身具有独特的结构,赋予其各种功能而成为高分子领域的研究热点之一。
树形分子在结构上表现出精确的分子组成、高度支化的结构、分子内存在空腔、分子量具有可控性、分子本身具有纳米尺寸、表面带有大量官能团等特征。
树枝状大分子与传统的线性大分子相比有以下几个显著特点:
(1)树枝状大分子有明
确的分子量及分子尺寸,结构规整,分子体积、形状和功能基都可在分子水平上精确控制;
(2)树枝状大分子一般由核心出发,不断向外分支,代数较低时一般为开放的分子构型,随代数的增加和支化的继续,从第四代开始,分子由敞开的松散状态转变为外紧内松的球形三维结构分子内部具有广阔的空腔,分子表面具
有极高的官能团密度;(3)树枝状大分子有很好的反应活性及包容能力,在分子中心和分子末端可导入大量的反应性或功能性基团,用作具有特殊功能的高分子材料。
树枝状大分子特殊的结构赋予其与线型分子不同的物理和化学性能。
树枝状
大分子具有广阔的应用前景,可用于生物制药、催化剂、物质分离技术、自组装及“光天线”等各个领域。
1.0以氨基酸为单体的树形分子
树状多肽(peptidedendrimer)广义的定义指所有包含多肽的树枝状大分子,树
状多肽具有一般树枝状大分子的普遍特性,如规则的多分支类球型结构、密集的表面集团、分子中较大的空腔等[8,11]。
它相对于线性多肽具有更好的水溶性、更强的耐水解酶能力和对细胞更小的毒性,其上众多的结合位点可以结合更多有用的基团,因此树状多肽在生物化学、分子生物学及化学生物学中具有很广阔的应用前景。
1963年Merrifield首先介绍了固相多肽合成法,该方法简便易行,至今已经发展成为合成多肽、寡核苷酸甚至某些有机小分子的通用方法。
1988年Tam首先介绍了以赖氨酸为核心的树状多肽的合成。
发散法合成树状多肽多采用此法,具体的合成步骤与线型多肽相同。
通常合成开始于以di-Boc或di-Fmoc保护的赖氨酸合成二级或三级的分支结构,然后其它多肽序列被一步一步合成到该赖氨酸骨架上。
合成结束后,将所得的树状多肽
从树脂上切割下来,进行进一步的提纯和表征。
除赖氨酸外,Crespo等人介绍了以顺式4-氨基-L-脯氨酸(Amp)为分支单位的
树状多肽。
分步发散合成法的一个变体是在赖氨酸骨架上连接不同的肽链,该问题通过使赖氨酸的a和&氨基端具有不同的保护基而解决,通常分别为BOC和
Fmoc]1]。
2.0生物可降解树形分子
和所有的聚合物医疗一样,以树形分子为基础的药物载体的尺寸大小,分子量决定了它们在血液循环中的存留时间,累积在肿瘤处的量和从体内清除的速率。
制作生物可降解的树形分子可以在提高分子量的同时增加在肿瘤出的积累,提高循环时间,并通过在体内的降解而得以清除。
生物可降解的树形分子通常含有酯键,可以通过化学水解,也可以通过特定酶的作用而降解。
Grinstaff等成功合成了不同代数的聚甘油-丁二酸poly(glycerol-succinicacid)(PGLSA)树形分子,这种树形分子中还有大量的酯键和醚键。
并研究了其在体液环境中的降解行为。
结果表明还有酯键的分子比含有酰胺键的分子降解的速率要快很多。
[2]
Fig.1-7biodegradablePGLSAdendrimer
Cleavageby\Hydrolysis+jEsterases丿
yX"rxf
3.0憎水性树形分子
所有的基于聚合物的药物载体都要求其良好的水溶性,以方便血液注射。
而增加树形分子内部的憎水性可以大大增加其载药量并提高增溶的药物在体液运输环境中的稳定性。
特别的,具有疏水的核和亲水的表面的树形分子是一种良好的结构,这和两亲行聚合物组成的胶束类似,但是其稳定性较高,因为不必担心
注射后由于浓度的突然下降而造成的胶束的解离。
Frechet3]等人报道了以4,4-二(4-羟苯基)戊醇为单体合成疏水性树形分
子,并在其表面修饰750分子量的聚乙二醇,从而得到两亲性的树形分子。
这种
图1-2具有两亲性结构的Dendrimer
4.0聚酰胺-胺类树形分子PAMAM(polyamido-amine):
4.1发展历史及合成方法
聚酰胺-胺(PAMAM)是最早被合成并商业化的树状大分子。
PAMAM的合成由一个脂肪胺(例如乙二胺或丁二胺等)与丙烯酸甲酯的Michaeladdition,得到一个甲酯基结尾的中间体,这个中间体可以被转化为COOH,NH2,OH结尾
的最小代数的分子。
这个中间体与过量乙二胺(EDA)继续反应就可以得到表面有4个氨基的G0分子。
重复这个过程就能得到高代数的单分散的PAMAM分子。
但由于树状分子采用重复增长手段合成,要得到高代数产品需要十几步反应而且每一步要有高产率合成才有意义,产物的提纯也比较困难。
另外文献报道的合方法,高代产物的合成周期长,合成成本也大,致使产品价格非常昂贵,从20世
纪80年代中期出现至今仍然没有被广泛地投入商业化应用[4]。
随着代数的增加,
通过这种发散性合成的方法碰到了空间位阻的问题。
这种现象表现在分子量分布
的大幅度的上升和其他的一些方面,这在合成G7的分子中观察到,被称为是
Gennes堆积效应。
而合成G10以上的树形分子几乎已经不可能[5,6,7]。
图1-3PAMAM合成的一般路线
除了PAMAM树形分子,及其表面改性的分子外,PAMAMDendron-linear
polymerhybrids,也不断涌现出来。
其中最为常用的以聚乙二醇为线性单元的聚合物,这种合成方法用双端基为氨基的聚乙二醇为核,在其两端进行控制增长而
得到的。
比起单纯的PAMAM,这类分子的毒性和引起免疫的能力更低[8]。
4.2特点
龙飞等测定了树枝状高分子PAMAM(聚酰胺2胺型,乙二胺为内核)及其季铵盐在水溶液中的特性粘度[G].结果表明,PAMAM的[G]在代数G=2〜3处有最大值,而其季铵盐则在此处有最小值.同时发现高分子的流体力学等效圆球半径RG随G增大近似线性增长[9]。
张波等通过对不同代数的树状高分子材料的热重曲线研究表明,树状高分子材料的热分解行为为逐层分解。
在树状高分子中,半代产物外层分解温度较高,在200r左右,而整代产物外层分解温度较低,从加热开始即发生分解[1°]。
曲祥金等研究发现随着PAMAM代数的增加,荧光峰位置没有变化,但相对强度变化较大,在浓度相同的情况下,随着代数的增加,整代PAMAM的荧光强度除4.0G外,由a到d依次减弱,4.0G的荧光略强于3.0G。
这是由于树枝状化合物PAMAM在低代时,链间的自由运动空间逐渐增大,在3G时分子密度达到最小,分子链的舒展程度最大。
进一步增加代数,分子内部结构也变得更加紧密趋向于一个较为坚硬0的球体,荧光强度又开始增加。
他们同时发现pH对PAMAM荧光强度的影响较大,荧光物质为弱酸或弱碱时,溶液pH的改变对荧光有很大的影响。
PAMAM树状大分子显弱碱性,为了探讨pH对荧光强度的影响,他们配制了不同pH值的一系列溶液,测定了其荧光强度的变化,当pH为8~9时,PAMAM溶液的荧光强度较大。
溶液在酸性或强碱性时,荧光强度都会相应减小I11]。
4.3应用
PAMAM树状大分子在药物载体、毛细管气相色谱固定相、纳米复合材料、催化剂、高分子材料的流变学改性剂、废水处理、单分子膜、光电传感、基因载体等多方面已显示出广阔的应用前景[12]。
Roberts]13]等以45mg/g-1的剂量小鼠静脉注射G3,G5,G7阳离子型
PAMAM,给药后每隔2h观察1次,结果发现小鼠不仅体重无明显变化而且行为也无异常表现。
Kukowska-Latallo等将PEG化的三聚氰胺PAMAM以不同剂量注入雄性C3H大鼠体内,检测尿素氮的含量,结果无明显变化。
将PEG修饰的酯基末端PAMAM以1.3mg/g-1的剂量注入小鼠体内,器官病理学检测无明显改变。
Bhadra等[14]将PEG25000修饰的G4PAMAM作为52氟尿嘧啶的药物载体,尾静脉分别注射相同剂量的52氟尿嘧啶、G4PAMAM252氟尿嘧啶和PEG25000修饰的G4PAMAM252氟尿嘧啶,发现血药峰浓度依次分别为200〜220,21〜23和6〜7mg•L-1,给药后12hPEG25000修饰的G4PAMAM252氟尿嘧啶组血中仍可检测到药物浓度,提示PAMAM载药后具有明显的缓释作用。
Asthana等以角叉菜聚糖引发的大鼠脚水肿为模型,以PAMAM
作为非甾体抗炎药氟布洛芬的药物载体,结果发现静脉给药后4h75%的大鼠症
状减轻,8h后仍有50%的大鼠症状减轻。
而氟布洛芬静脉给药后3h发挥最佳疗效,65%的大鼠症状减轻,4h后只有低于50%的大鼠症状减轻,表明PAMAM作为静脉注射给药的药物载体能够延缓药物的释放,达到缓释的目的。
Kong[15]等将PEG修饰的PAMAM作为甲氨蝶呤肿瘤靶向给药载体,与游离药物相比,肿瘤抑制率提高了2.1倍。
Chandrasekar等将叶酸修饰的G4PAMAM作为模型药物吲哚美辛的靶向药物载体,发现炎症部位的血药浓度、滞留时间以
及半衰期均高于游离药物吲哚美辛。
Shukla等将叶酸硼酸盐修饰的PAMAM作为靶向肿瘤的药物载体,结果表现出明显的肿瘤靶向性。
上述研究提示,
PAMAM经修饰后可作为介导药物主动靶向输送的靶向药物载体并控制药物释放、延长药物的滞留时间。
PAMAM以其特殊的结构,较小的尺寸和表面大量的官能团等性质,弓I起了研究人员的广泛兴趣。
李亚鹏,赵义丽等通过乙二胺与丙烯酸甲酯的迈克尔加成反应成功合成了不同代数的PAMAM树枝状大分子。
他们研究了树枝状大分子的紫外及荧光性质,发现整代的树枝状大分子和半代的树枝状大分子由于端基不同,从而导致其紫外吸收峰位有明显的区别,而其吸收强度是与分子骨架有密切关系的。
同时PAMAM树枝状分子的荧光强度是随着代数的增加而逐渐增强[16]o
积极拓展其在生物和药学领域中的应用,这从评价其毒性和引起免疫的能力
(immunogenicity)开始的。
Axel等利用所得超支化聚合物作为PMMA的粘度调节剂,解决了因超支化聚合物端基为极性基团而与本体不相容所引发的问题。
Hong等采用超支化聚合物作为低密度聚乙烯纤维的加工助剂,降低了共混体系的粘度,降低了材料挤出所需功率,节省了能源,同时也减少了熔体破裂和鲨鱼皮现象,提高了材料的力学性能[17]。
胡晖等人采用原子转移自由基聚合法(ATRP)制备了不同支化度的超支化氯甲基苯乙烯(PCMS),并以PCMS为引发剂,再次运用ATRP聚合甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯(DMA),得到核为超支化聚合物,外层为环境敏感性聚合物PDMA的功能高分子。
该方法可控制超支化分子的尺寸和外形,从而控制药物在体内的释放和分布[18]。
王瑜,王春磊等通过发散法合成了各代聚酰胺2胺(PAMAM)树状大分子。
处理胜利油田孤岛四号联合站污水实验表明,合成的3.0代PAMAM树状大分子除油效果最佳,除油效果好于现场使用的进口药剂罗曼哈斯,在加剂量为70mg/L时,含油从888.7mg/L降到132.5mg/L,除油率可达到85.1%,悬浮物从138mg/L降到73mg/L[19]。
刘军安等通过在3.0G树状大分子PAMAM外围修饰十八碳酰长链,以获得外围疏水、内核亲水的新型树状大分子,考察其作为基因载体的转染效率。
通过控制十八碳酰的用量,将十八碳酰修饰在树状大分子外围,应用外光谱和1HNMR对目标产物进行表征,结果表明树状大子外围能够接上十八碳酰长链。
在基因转染过中能够更好的结合DNA,从而提高基因转染效率[20]。
陈枫等合成了不同代数GO(零代)、G2(二代)的树枝状大分子PAMAM,同时对GO、G2代PAMAM进行了季铵化改性,得到了PAMAM季铵盐,进一步用PAMAM季铵盐插层改性钠基蒙脱土(Na+—MMT)得到了PAMAM季铵盐改性蒙脱土(PAMAM/MMT)。
XRD分析表明,PAMAM季铵盐己与Na+--MMT中的Na+进行了离子交换,同时提出了GO、G2代PAMAM季铵盐对MMT的双分子和单分子插层模型。
进一步研究了PAMAM/MMT对聚碳酸酯(PC)的流变性能的影响规律,结果表明PAMAM/MMT可明显降低聚碳酸酯熔融剪切粘度,有利于提高其加工性能[21]。
周婷等用发散法合成以乙二胺为核的聚酰胺一胺(PAMAM0.5〜6.0代)。
研究发现随着添加剂PAMAM的增加,铝酸钠溶液的表面张力急剧降低,半代数的PAMAM具有较好的表面活性,有望成为新一代的表面活性剂;整代数的PAMAM也有一定的表面活性。
PAMAM属于非离子型表面活性剂,因此随着PAMAM的加入,铝酸钠溶液的电导率改变不大[22]。
杨云云等用发散法合成1-5代PAMAM大分子及PEG化PAMAM,采用IR、NMR、端基滴定、GPC等方法对其进行表征,并以阿霉素为模型药物,比较PAMAM和PEG2PAMAM载药能力及释放效果。
结果FTIR、NMR、端基滴定、GPC测定结果表明所合成的产物确为125代PAMAM树状大分子,I
R测定结果表征PEG化PAMAM合成,PAMAM大分子及PEG2PAMAM对难溶性药物具有较强包载能力,其中PEG2PAMAM能够更好地延缓药物释放。
结论PEG2PAMAM大分子具有良好的作为难溶性药物载体的潜力[23]。
陆珺珺等研究PAMAM树状聚合物对灯盏花素体内药代动力学的影响。
测定和比较了G1、G1.5、G2、G2.5代PAMAM在不同浓度和不同pH时对灯盏花素的增溶量;另将12只大鼠随机均分为2组,每组6只,分别以灯盏花素及灯盏花素-PAMAM灌胃,采用反相高效液相色谱法检测血浆药物浓度。
在pH小于7.0时,PAMAM树状聚合物对灯盏花素的增溶量随着PAMAM代数、浓度和溶液pH的增加而增大,其增溶机制为灯盏花素的羧基与
PAMAM的伯胺和叔胺发生静电作用;灯盏花素、灯盏花素-PAMAM口服给药的Cmax分别为(119.65±.36)和(518.17±7.07)ng•mL-1AUC0-8h分别为(370.09±63.08)和(1219.47±201.87)ng•h•mL-两者具有极显著性差异(P<0.01)。
说明PAMAM能显著提高灯盏花素在水中的溶解度;大大改善灯盏花素口服给药的生物利用度鬥]O
申毅等使用PAMAM树形分子处理油墨废水。
研究了树形分子的代数溶液的酸度以及树形分子的加药量对色度和COD去除率的影响研究表明
PAMAM树形分子对油墨废水具有良好的治理效果在pH值为5.0左右
PAMAM投加量为20mg/L的条件下色度和COD去除率可分别达到
98.6%和98.3%[25]
Duncan和她的团队报道了G1-G4PAMAM对三种肿瘤细胞的作用,发现PAMAM分子在细胞中培养72小时后,树形分子表现出明显的毒性,IC50的数值分布在50到30011g/mL之间。
把B16F10murinemelanomacellline培养在G4-NH2dendrimer(51g/mL)的溶液中时,为一个小时后发现了细胞的死亡。
PAMAM的这种毒性归因于表面大量的氨基电离而造成的聚阳离子效应,随着PAMAM的代数,浓度,培养时间的增加,这种毒性有明显的上升趋势。
而将PAMAM表面的氨基转化为其他带负电荷或是中性的基团的时候,这种毒性大幅
度的下降[26]。
而表面为氨基的PAMAM却是小分子药物或是DNA片段的优良载体,通常客体分子和dendrimer本身通过静电或配位作用可以形成complex,这大大提高了客体分子的承载数量。
Kohle[27]等人研究了表面为氨基的PAMAM分子与布洛芬(ibuprofen)的作用。
氨基可以通过和药物分子中的羧基的离子作用,而增强其在树形分子中的承载量。
Ibuprofen分子不仅可以增容在树形分子的空腔内部,也可以在表面形成作用。
平均每个表面为氨基的PAMAM分子可以增容多达78
个客体分子,远远大于表面为羟基的聚酯超支化分子。
马丽芳等合成新型树状大分子聚酰胺胺一泊洛沙姆(PAMAM-Poloxamer),考察其作为药物载体的可行性。
将泊洛沙姆188一端羟基以硫酸二甲酯甲基化,另一端羟基经过对硝基苯基氯甲酸酯活化,与PAMAM
G2.0连接,目标产物PAMAM-Poloxamer用FT—IR、1HNMR进行结构
表征。
MTT研究其细胞毒性。
通过体外增溶实验研究该药物载体对难溶抗癌药物喜树碱的增溶作用,以及pH对增溶作用的影响;通过光敏性试验研究其对喜树碱光敏性的稳定能力。
通过上述方法成功合成树枝状大分子PAMAM-Poloxamer,其细胞毒性与PAMAM相比有所降低;对喜树碱有较好的增溶作用;对喜树碱光不稳定性具有很好的稳定作用。
树枝状大分子PAMAM-Poloxamer有望成为一种新型药物载体材料[27]。
PAMAM分子进入细胞内部的速度也是非常快的。
Kannan等人也使用
ibuprofen作为模型药物来研究PAMAM进入A549humanlungepithelialcarcinoma的过程。
PAMAM-NH2和PAMAM-OH可以在一个小时内进入细胞,快于超支化聚酯进入细胞的速度(需要两个小时)。
如果将ibuprofen通过化学键作用,并通过FITC进行荧光标记,则PAMAM分子进入细胞的速度会更快,仅仅需要15分钟左右[28]。
通过化学键连接的药物-PAMAM可以增加其在体液环境中的稳定性,除此之外,还可以降低药物引起的免疫,并通过连接基本身的性质来调控药物释放的速率。
虽然这方面的研究工作已经有广泛的开展,但是仍有许多具有挑战性的问题存在。
Duncan等人将3.5GPAMAM分子和顺铂(cisplatin)反应得到了树形分子-铂的化合物,产品在水中的溶解度很大,并在体外实验中反先铂有缓慢的释放。
同时也发现Dendrimer-Pt在肿瘤处聚集的数量是单纯药物的50倍,但是同时药性也有明显的降低(小3-15倍)[29]。
化学键结合的树形分子-小分子药物化合物的释放行为也有其特点,因为其进入细胞的速率更快,所以带来的治疗作用也有明显的区别与传统线性聚合物的特点。
JayantJ.Khandare[31等人比较研究了PEG-drugcomplex和PAMAM-drug的释放行为,使用己二酸作为连接基,用pacitaxel为模型药物。
对比两者的释放曲线,因为连接基的相同,两者的释放速率并没有出现明显的差别。
PEG-drug
的毒性要比纯药物的低,归因于分子量的增加和较慢的进入细胞的速率。
而PAMAM-drug比纯药物却要高出10倍,这是由于PAMAM-drug进入细胞较快的速率。
1.4展望
目前,PAMAM已与许多药物如非甾体抗炎药、抗癌药物、抗菌药物等通过某种或多种载药机制形成复合物,并已作为新一代药物载体用于不同给药途径。
随着研究的深入,树枝状聚合物也将引起生物医学领域学者的广泛关注。
但是,目前
临床前研究发现树状高聚物仍存在一定的细胞毒性,通过对其结构进行修饰以减少其毒性将是今后研究的方向和重点。
1.5论文提出的背景及意义
树形分子因为其规整、明晰的分子结构,单分布的分子量,以及分子内的空腔结构,作为纳米载体和药物控制释放体系有很好的发展前景。
树形分子因为合成制备过程周期长,要求高,所以目前的研究热点更多得集中在已有的树形分子的改性及功能化的研究上。
本文设计、合成了具有pH敏感的以聚酰胺-胺(PAMAM)树形分子为基础的纳米载体体系,并进行了小分子的包覆及释放研究。
第二章实验部分
2.1实验原料与试剂
聚乙二醇单甲醚2000(mPEG2000),aidrich,使用前使用甲苯共沸干燥除水或90C真空干燥;对羧基苯甲醛(CBA)纯度95%,sigma-aldrich;氯化铵NH4CI,
分析纯,国药,80C干燥过夜后使用;N-二环己基碳二亚胺(DCC);对二甲
胺基吡啶(DMAP),多肽合成级,上海吉尔生化;
2.2合成部分
2.2.1mPEG-A合成
将mPEG(Mw=2000)和CBA(5equiv)溶解于THF中,将溶有DCC(4equiv)
的DCM溶液逐滴加入到上面溶液中,室温搅拌2小时后加入DMAP(1equiv),
持续搅拌48小时。
结束后过滤去副产物DCU,溶液浓缩,沉淀在大量乙醚中,
干燥后,在异丙醇中重结晶,得到白色粉状固体。
222mPEG-A与PAMAM大分子的连接
PAMAM溶解于少量的DMSO中,加入定量的mPEG-A的氯仿溶液,在敞口瓶中将溶液加热至沸腾,持续48小时,期间需要要补充加入氯仿。
结束后,浓缩溶液,加入少量的异丙醇,沉淀于大量的乙醚中,得到白色固体。
产物重新溶解在超纯水中,使用超滤的方法除去过量的聚乙二醇链。
2.2.5PAMAM-Ab-PEG的合成
2.2.6
取PAMAM-A-PEG(按照223.4合成),溶解于甲醇中,加入3倍摩尔当量的NaBH4,室温搅拌24小时,反应结束后,加入超纯水稀释,转移至透析袋中,先对10mMHCl透析3小时,再对水透析6小时,得到的溶液冻干,得到白色固体粉末,收率58%。
图3-3合成PAMAM-Ab-PEG的反应式
Fig.3-3synthesisofPAMAM-Ab-PEG
2.2.3PAMAM-GLY-OH的合成
取500ulPAMAM-NH2甲醇溶液(质量分数10%左右),在30C旋转蒸发,
去除溶剂,使用差重法求得PAMAM-NH2-4G的重量,重新溶解在二甲基亚砜中<
取摩尔当量十倍于PAMAM的缩水甘油溶解于5mL的DMSO中,在氮气保护下,
冰水浴中,将其逐滴滴加至上述溶液中,保持低温一小时后恢复至室温,持续反
应二十四小时。
反应结束后将溶液用超纯水稀释,转移至截留分子量为1000的
再生纤维素透析袋中,对超纯水透析48小时,每隔6小时,换一次透析外液,
透析后的液体冻干,得到白色絮状固体,收率79%
图3-1合成PAMAM-GLY-OH的反应式
Fig.3-1synthesisofPAMAM-GLY-OH
2.2.4PAMAM-PEG的合成
mPEG的活化:
取mPEG(Mw=2000)4g,甲苯共沸除水,溶解于二氯甲烷中(10mL),加入3倍摩尔当量的氯甲酸对硝基苯酯和三乙胺,室温搅拌反应48小时。
反应结
束后,滤去产生的三乙胺盐酸盐,使用旋转蒸发仪浓缩,沉淀在乙醚中,干燥沉淀,得到淡黄色粉末,采用异丙醇重结晶,收率72%。
称取活化的mPEG(290mg,
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