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双盲罗鹏辉
学位类别:
学术型
毕业时间:
2011年6月
所学专业:
肿瘤学
研究方向:
鼻咽癌的综合治疗
学位论文:
鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小RNA29c表达研究
论文编号:
目录
论文
鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小RNA29c表达的研究
摘要
中文摘要…………………………………………………………
1
英文摘要…………………………………………………………
3
前言
……………………………………………………………………
6
材料与方法……………………………………………………………….
9
结果……………………………………………………………………….
20
讨论……………………………………………………………………….
26
小结……………………………………………………………………….
34
参考文献
………………………………………………………….........
35
附表
……………………………………………………………………
41
综述
微小RNA与鼻咽癌……………………………………….
44
致谢
……………………………………………………………………
59
攻读硕士学位期间发表的文章
………………………………….
60
鼻咽低分化鳞状细胞癌患者
血清中微小RNA29c表达的研究
摘要
目的检测鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小RNA29c(miR29c)的表达量,探讨miR29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的关系。
方法24例鼻咽低分化鳞状细胞癌患者和24例健康人分为鼻咽癌组和正常组,收集两组的血清,用Q-PCR方法检测血清中miR29c的表达量。
结果
(1)鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量明显低于健康人血清中miR29c的表达量(P<0.05);
(2)有淋巴结转移的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量明显低于无淋巴结转移的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量(P<0.05);(3)鼻咽癌2008分期Ⅳ期的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量明显低于Ⅱ-Ⅲ期的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量(P<0.05);(4)不同性别的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量无明显差异(P>0.05);(5)不同年龄的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量无明显差异(P>0.05)。
结论鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c表达量明显降低,有淋巴结转移和临床分期晚的患者,miR29c的表达量更低。
miR29c可能具有抑制鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移的作用。
鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量可反映鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移的情况。
关键词microR29c,鼻咽癌,淋巴结转移,临床分期
THERESEARCHABOUTTHEEXPRESSIONLEVEALOFMICRORNA29CINTHESERUMOFPATIENTSWITHNASOPHARYNGEALPOORLYDIFFERENTIATEDSQUAMOUSCELLCARCINOMA
ABSTRACT
ObjectiveTodetecttheexpressionlevelofmicroR29c(miR29c)intheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinoma.AndtoexploretherelationshipbetweenmiR29candtheoccurrence、progression、invasionandmetastasisofnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinoma.
Methods24patientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomaweredividedintothegroupofnasopharyngealcarcinoma(NPC),and24healthypeopleweredividedintothenormalgroup.Collectserumfromthetowgroups,anddetectedtheexpressionlevelofmiR29cintheserum.
Result
(1)TheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawasobviouslylowerthantheexpressionlevelofmiR29cintheserumofhealthypeople(P<0.05);
(2)TheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawhohadlymphnodemetastasiswasobviouslylowerthantheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawhohadnotlymphnodemetastasis(P<0.05);(3)TheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawhosestageswerenasopharyngealcarcinoma2008stageⅡ-ⅢwasobviouslylowerthantheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawhosestageswerenasopharyngealcarcinoma2008stageⅣ(P<0.05);(4)Intheserumofmaleandfemalpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinoma,theexpressionlevelofmiR29chadnodifference(P>0.05);(5)Amongthepatientswithnosepharynxpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawhoseagewerediferent,theexpressionlevelofmiR29cintheirserumofhadnodifference(P>0.05).
ConclusionTheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomawasobviouslyreduced,andtheexpressionlevelofmiR29cwasmorelowerintheserumofpatientswhohadlymphnodemetastasis,andwhoseclinicalstagewasmorelater.MiR29cmayhavetheeffectionofsuppressingtheoccurrence,development,invasionandmetastasisofnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinoma.TheexpressionlevelofmiR29cintheserumofpatientswithnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinomacouldreflectthestatesabouttheoccurrence,development,invasionandmetastasisofnasopharyngealpoorlydifferentiatedsquamouscellcarcinoma.
KEYWORDSmiR29c,nasopharyngealcarcinoma,lymphnodemetastasis,clinicalstage
前言
鼻咽癌的发病具有明显的地域聚集性,我国鼻咽癌的发病率在世界范围内最高。
鼻咽癌的发生、发展和侵袭转移是多因素、多阶段的过程,由基因、生物与环境等因素协同作用产生,基因在鼻咽癌的发生、发展和侵袭转移方面起到重要的作用,寻找与鼻咽癌发生、发展和侵袭转移有关的基因是目前研究鼻咽癌的热点[1]。
鼻咽部复杂的解剖结构,以及我国97%的鼻咽癌组织病理学类型为低分化鳞状细胞(2005WHO组织病理学分类标准中的非角化性癌),使我国的鼻咽癌有早期侵袭转移的倾向,治疗效果和预后比较差[2]。
因此,研究鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移的机制,在提高鼻咽癌治疗效果和改善患者预后等方面具有重要的意义。
微小RNA(microRNA,miRNA)是长度仅有18~25核苷酸(nt)
的一类内源性非编码小RNA[3]。
从1993年LeeRC等[4]在线虫体内首次发现miRNA到2010年9月,已经在生物体中找到15172种miRNA[5],其中至少有721种在人体中表达。
miRNA能编码人类30%的基因,调控50%的蛋白质[6]。
miRNA进化高度保守,不直接编码蛋白质,而是通过与靶mRNA的特异性碱基互补配对,促使靶mRNA降解或抑制靶mRNA转录,在转录后水平负向调节蛋白质的表达,影响细胞生长、增殖、分化和凋亡,调节生物的多种功能[7]。
miRNA在生物中的表达具有明显的组织特异性,在肿瘤组织中这种特异性尤为突出,可反映肿瘤的发生、发展和侵袭转移情况,用于肿瘤的诊断和预后判断。
体液中表达的miRNA被称为循环miRNA,此概念由研究者的在进行实验研究的推论【】中提出:
在肿瘤患者的体液中可以检测到循环DNA和RNA[8],在福尔马林固定的肿瘤组织有稳定而特异性表达的miRNA[9],那么在肿瘤组织中稳定而特异性表达的miRNA可能在肿瘤患者体液中稳定而特异性表达,循环miRNA可能是理想的肿瘤标志物,可用于肿瘤的诊断和预后判断[10]。
之后,研究者发现miRNA可通过超微小泡和外来体穿过肿瘤细胞膜到达体液中,或在核磷蛋白(RNA结合蛋白,NPM1)作用下穿过肿瘤细胞膜到达体液中,在体液中核磷酸蛋白保护miRNA不被核酸酶降解而稳定表达[11,12]。
近年来研究者在非霍奇金淋巴瘤[13]、乳腺癌[14]和胃癌[15]等多种肿瘤患者体液中检测到稳定而特异性表达的循环miRNA,这些循环miRNA与肿瘤的发生、发展和侵袭转移有关。
检测循环miRNA在鼻咽癌患者血清中的表达量,研究循环miRNA在鼻咽癌发生、发展和侵袭转移过程中的作用,可能对鼻咽癌的诊断、治疗和预后判断等方面具有重要作用。
大量研究表明miRNA29c在恶性肿瘤组织中表达量降低,与肿瘤的发生、发展和侵袭转移有关[16-18]。
miR29c在鼻咽癌组织中表达量也明显降低,可通过调节鼻咽癌组织中细胞外基质蛋白(Extracellularmatrix,Ecm)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)信号通路中的多种蛋白生成和功能表达,抑制鼻咽癌的发生、发展和侵袭转移[19,20]。
目前,在鼻咽癌患者血清中miR29c是否有表达,未见报道。
本研究采用Q-PCR技术检测鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中miR29c的表达量,分析miR29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌患者淋巴结转移和临床分期的关系,进一步探讨miR29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的关系。
材料和方法
1研究对象
鼻咽癌组
24例鼻咽低分化鳞状细胞癌患者。
鼻咽低分化鳞状细胞癌患者为2009年6月-2010年3月期间在广西医科大学第一附属医院首诊住院的患者。
入组条件
①所有患者均在广西医科大学第一附属医院病理科经鼻咽部肿瘤组织病理学检查,确诊为鼻咽低分化鳞状细胞癌;
②所有患者治疗前均在广西医科大学第一附属医院放射科行头颈部MRI检查,以明确临床分期和淋巴结转移;
③所有患者一般情况良好(用KPS评分标准判定,详见附录1),器官功能正常;
④所有患者除患本病外无其它合并症和既往特殊疾病史,无家族重大疾病史和肿瘤病史;
⑤所有患者经超声、胸部X线、ECT等检查排除远处转移。
亚组
(1)按患者性别分:
男性亚组(13例),女性亚组(11例);
(2)按患者年龄分:
<45岁亚组(11例),≥45岁亚组(13例),年龄在14~56岁间,平均年龄43岁;
(3)按淋巴结转移情况分:
有淋巴结转移亚组(14例),无淋巴结转移亚组(10例);
(4)按临床分期分:
Ⅱ-Ⅲ期亚组(13例),Ⅳ期亚组(11例)。
淋巴结转移根据影像学淋巴结诊断标准(详见附录2)诊断,临床分期根据鼻咽癌2008分期(详见附录3)确定,鼻咽低分化鳞状细胞癌患者的临床资料详见表1-1。
正常组
24例健康人。
健康人为2009年11月-2010年3月期间在广西医科大学第一附属医院体检中心进行健康体检的人。
入组条件
1所有人一般情况良好(用KPS评分标准判定),器官功能正常;
②所有人未患全身性疾病,无既往特殊疾病史,无家族重大疾病史和肿瘤病史;
③所有人与鼻咽癌组年龄相近(经t检验,p>0.05,证实两组年龄有可比性,详见表1-2);
④健康人与鼻咽癌组的性别比例相同。
表1-1鼻咽低分化鳞状细胞癌患者临床资料
编号
患者
年龄(岁)
性别
淋巴结情况
鼻咽癌2008分期
1
npc1
45
男
-
T3N0M0
Ⅲ
2
npc2
34
男
-
T2N0M0
Ⅱ
3
npc3
35
男
+
T3N2M0
Ⅳ
4
npc4
52
女
+
T4N2M0
Ⅳ
5
npc5
48
男
-
T4N0M0
Ⅳ
6
npc6
23
男
+
T4N1M0
Ⅳ
7
npc7
47
女
+
T4N2M0
Ⅳ
8
npc8
46
男
-
T3N0M0
Ⅲ
编号
患者
年龄(岁)
性别
淋巴结情况
鼻咽癌2008分期
9
npc9
43
男
+
T3N2M0
Ⅲ
10
npc10
40
男
+
T4N1M0
Ⅳ
11
npc11
52
男
+
T4N2M0
Ⅳ
12
npc12
52
女
+
T3N3M0
Ⅳ
13
npc13
51
男
-
T3N0M0
Ⅲ
14
npc14
39
女
+
T3N1M0
Ⅲ
15
npc15
41
女
+
T3N2M0
Ⅲ
16
npc16
43
女
-
T3N0M0
Ⅲ
17
npc17
42
女
-
T3N0M0
Ⅲ
18
npc18
50
男
-
T3N0M0
Ⅲ
19
npc19
48
男
-
T2N0M0
Ⅱ
20
npc20
50
男
+
T3N1M0
Ⅲ
21
npc21
45
女
+
T4N2M0
Ⅳ
22
npc22
42
女
+
T4N3M0
Ⅳ
23
npc23
56
女
-
T2N0M0
Ⅱ
24
npc24
14
女
+
T4N3M0
Ⅳ
注:
“-”指无淋巴结转移,“+”指有淋巴结转移。
表1-2鼻咽癌组与正常组年龄的比较
分组
例数
年龄
t
p
鼻咽癌组
24
43.25±9.49
0.176
0.862
正常组
24
43.17±10.02
2材料
2.1主要试剂
反转录试剂盒
广州复能基因有限公司
Q-PCR试剂盒
广州复能基因有限公司
Trizol-A+
北京天根生化技术有限公司
DNAMark
北京天根生化科技有限公司
DEPC处理水
北京天根生化科技有限公司
无水乙醇
天津四有生物医学技术有限公司
三氯甲烷
上海振兴化工一厂
5×Tris-硼酸(TBE)
北京鼎国公司
溴化乙锭(EB)
美国Sigma公司
异丙醇
衡阳有机化学试剂厂
琼脂糖(Apoose)
Spanish
2.2主要仪器
7500型实时荧光定量PCR仪
美国ABI公司
凝胶成像分析系统
美国Bio-Rad公司
凝胶成像扫描仪
美国Bio-Rad公司
紫外分光光度计
美国PE公司
-80℃低温冰箱
日本三洋公司
4℃、-20℃冰箱
美的公司
AB240-E分析天平
瑞士海特勒-托利多公司
高速低温离心机
德国Eppenndorf公司
多通道PCR扩增仪
美国MJ公司
电泳仪
美国Bio-Rad公司
颗粒制冰机
上海安亭科学仪器厂
高压灭菌消毒锅
日本TOMY公司
烤箱
上海跃进医疗仪器厂
所有仪器由广西医科大学实验中心提供。
3方法
3.1鼻咽低分化鳞状细胞癌组织病理检查
所有鼻咽低分化鳞状细胞癌患者均在广西医科大学第一附属医院耳鼻喉科经电子纤维鼻咽镜检,取鼻咽部肿瘤组织,在广西医科大学第一附属医院病理科行组织病理学检查,经常规HE染色,病理科医生在光学显微镜下仔细阅片诊断,确诊为鼻咽低分化鳞状细胞癌。
3.2鼻咽组和正常组血清中miR29c的检测
3.2.1标本采集
经鼻咽低分化鳞状细胞癌患者和健康人同意,分别在入院后治疗前或体检当天,清晨空腹条件下,抽取外周静脉全血5ml于无菌无RNA酶和无抗凝剂的10ml干燥试管中,室温凝固后离心(3000rmp10min),提取2.5ml血清于10ml离心管中,放入-80℃超低温冰箱保存,待用。
3.2.2总RNA提取
3.2.2.1方法
采用Trizol法提取鼻咽低分化鳞状细胞癌患者和健康人血清中的总RNA。
3.2.2.2步骤
(1)标本处理
取出-80℃下保存的血清,在冰上自然解冻,常温下加入2.5ml
裂解液Trizol-A+,剧烈震荡5min,室温静置10min,重复一次。
(2)相分离
在经裂解液Trizol-A+裂解处理后的混合液中加入1.5ml氯仿,剧
烈震荡1min,室温静置5min,4℃离心12000rmp15min,小心取出离心管。
观察发现离心管中液体分为三层,无色透明的上层液中含总RNA,稀薄的中间层液中含DNA,固体状的下层物质中含蛋白质。
小心转移上层液5ml于10ml离心管中,避免接触中间层或管壁。
用同样方法进行第二次相分离,以保证总RNA纯净,即加入1.5ml氯仿,剧烈震荡1min,室温静置5min,4℃离心12000rmp15min,转移上层液4ml于10ml离心管中。
(3)总RNA沉淀
在上层液中加入4ml异丙醇,小心震荡混匀1min,冰上静置10min,4℃离心12000rmp10min,使总RNA贴于离心管底壁,小心倾倒,去掉液体。
(4)总RNA洗涤
在管底贴有总RNA的离心管中加入2ml75%乙醇(用DEPC处
理水配制,保存于4℃冰箱中)漂浮沉淀,4℃离心12000rmp5min,小心倾倒,去掉液体。
再用2ml75%乙醇洗涤一次,4℃离心12000rmp5min,小心倾倒,去掉液体,倒置离心管,室温干燥20min。
(5)总RNA溶解
在管底贴有总RNA的离心管中加入25ulDEPC处理水,溶解总RNA,制成总RNA溶液。
(6)总RNA浓度测定
取1ul总RNA样品加入99ulDEPC处理水中,稀释至100ul,用DEPC处理水作空白对照,校正调零,在紫外分光光度计下测总RNA的光吸收值A260,计算总RNA的浓度,公式如下:
RNA浓度(ug/ul)=40×A260×稀释倍数/1000
(7)总RNA纯度测定
取1ul总RNA样品加入99ulDEPC处理水中,稀释至100ul,
用DEPC水作空白对照,校正调零,在紫外分光光度计下测定总RNA的光吸收值的比值A260/A280,A260/A280低于1.8或高于2.0表明总RNA被污染或降解。
(8)总RNA完整性测定
1﹪琼脂糖凝胶制备:
用AB240-E分析天平称取0.4g琼脂糖粉末,
加入40ml1×TBE电泳缓冲液中(0.4/40=1/100),混匀,加热使琼脂糖完全溶解,稍冷却后加入2ul溴化乙锭(EB),充分混匀,倒入装好宽口梳子的胶槽中,室温下冷却凝固,得到1﹪琼脂糖凝胶,水平放置待用。
总RNA样品制备:
取3μl总RNA样品,加入18μlDEPC处理水中,
65℃变性10min后立即冷却,加入2μl10×RNA上样液,得到总RNA样品。
总RNA电泳:
取出制备好的1﹪琼脂糖凝胶,平放入盛有1×TBE
电泳缓冲液的电泳槽中,使缓冲液没过凝胶表面1mm,在直流恒定电压100V下电泳5min。
将总RNA样品点样在凝胶孔中,100V电压下电泳至溴酚蓝至胶的1/3处。
RNA完整性检测:
立即在凝胶电泳成像分析系统下进行凝胶扫
描,观察电泳结果并拍照。
观察条带,若在琼脂糖凝胶上28S、18S、5S三条带清晰,28S带的亮度约是18S条带亮度的两倍,说明总RNA完整。
若某条带无显示或模糊,说明总RNA有降解。
3.2.3cDNA合成
(1)试剂准备
将试剂盒All-in-OneTMmiR29cQ-PCRdetectionKit中反转录所需
的试剂(2.5U/μlPolyAPolymerase,RTaseMix,5×ReactionBuffer)放在冰上融解,上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。
同时在冰上预
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