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文稿
边栏附注
前言
MichaelWoodman:
嗨,大家好!
我是MikeWoodman,是安捷伦公司的一名应用专家。
今天和我在一起的是安捷伦在线技术支持部的RitaSteed,你们中的一些人可能在过去曾经和他通过电话。
Rita:
嗨,大家好!
这真是可能的!
我们接到过来自不同地区的许多求助电话。
Michael:
在本次讨论中,我们将关注梯度洗脱以及如何建立梯度分析方法的问题,并且讨论梯度分析中易犯的常见错误以及如何处理它们。
首先,我们来重温一下梯度方程,这样就能理解当进行梯度分析时,我们如何去调整方法的变量。
然后,我们来讨论流动相改性剂,以及它们是如何引起基线问题的。
最后,我们将讨论延迟体积的重要性,以及如何解决它们,以避免梯度分析方法在不同系统之间应用时组分的保留时间发生变化。
MikeWoodman是一名应用化学家,致力于安捷伦仪器应用的研究。
RitaSteed就职于安捷伦HPLC色谱柱技术支持部。
为什么使用梯度洗脱?
Rita:
那么人们为什么使用梯度洗脱呢?
随着色谱分析变得愈加复杂,人们越来越多地使用梯度洗脱。
当在组合化学或杂质分析中需要分离一些未知化合物时,梯度洗脱就非常有用。
梯度洗脱也有助于分离极性差异大的化合物,或者高分子量化合物,如肽类和蛋白质类。
在梯度洗脱中,流出各峰的宽度基本上是相同的,不像等度洗脱时,某组分在色谱柱中停留的时间越长,色谱峰就越宽。
梯度洗脱还有其它的优点,包括由于梯度压缩效应使峰形更尖锐,并且由于梯度洗脱中色谱柱不断被逐渐提高强度的溶剂冲洗,从而最大程度地减少了污染积聚。
梯度洗脱分析可用于:
∙分离一些未知化合物
∙组合化学研究
∙杂质分析
∙分离极性差异大的化合物,或者高分子量化合物,如肽类和蛋白质类。
梯度方程
Rita:
我们一起来看一下梯度方程,并去理解梯度方程是如何使用的。
[showgradient_equation.gif]
这个梯度方程乍看起来有些令人生畏,但如果您进一步再对它稍作了解,您就会看到事情并非想象的那样。
它涉及了影响您分析的关键变量,如果您不理解这些变量,也许会给您的色谱分析带来问题。
请看这是[pointasdiscussed]流速、梯度程序时间、梯度范围和柱体积。
谨记分母如果发生变化,分子就一定要做出相应改变来补偿,反之亦然,这一点非常重要。
增大保留因子k(或k*,梯度洗脱中)是一个简单的提高分离度的方法。
不过,这会以更长的运行时间为代价。
此外,还会导致峰宽增加,峰高降低,从而使使定量分析变得更加困难。
Mike:
目前,改变色谱柱的尺寸非常普遍,更短或者内径更窄。
因此,柱体积的任何减小,都需要通过成比例减小梯度程序时间或增大流速来补偿。
Rita:
当我们应用方法到不同尺寸的色谱柱上时,一个可以帮助我们的极好途径就是使用安捷伦方法转换器软件。
它能帮您确定您是否已经调整好了所有相关的方法参数。
您可以登陆,通过搜索找到方法转换器。
它有几个版本,包括在Agilent1290InfinityLC上适用的一款。
[showsearchandbringupMethodTranslatoronscreen]
[Demonstrateonscreen]比方说,您正在使用经典的4.6x250mm,5µm色谱柱。
您可以看到您在转换器中有两种选择:
基本模式和高级模式。
在本例中我们选择基本模式。
基本模式设定为您正在使用的是一台常规HPLC仪。
在色谱柱部分,我们输入色谱柱的规格为内径4.6mm、长度250mm、粒径5µm。
在方法部分,我们需要输入温度信息,这里设为30℃,流动相设为水/甲醇。
注意当我们如上操作时,最大黏度值发生了变化。
为了了解那个数值是从哪里来的,让我们去看一下黏度表。
您可以看到我们有一张关于水/乙腈和水/甲醇的表,以及一张其它相关HPLC溶剂黏度的信息表。
由于我们的梯度分析系在30℃时使用甲醇/水作流动相,因此我们需要查看30℃时流动相的黏度。
我们看到这个条件下该流动相的最大黏度是1.47,这也是我们使用的转换器的默认值。
接下来我们输入流速、进样体积及梯度程序条件。
为简单起见,我们将保持所有这里默认的条件不变。
现在让我们设定一个新的方法。
在基本模式下,默认的仪器是1200RRLC系统。
如果您使用的是高级模式,您可以设定系统信息以适应您使用的仪器。
输入我们使用的新色谱柱的规格2.1x50mm,1.8µm。
由于改变了色谱柱内径,我们可以看到转换器已经成比例地调整了流速。
虽然进样体积不是梯度方程中的变量,但考虑到原色谱柱与新色谱柱柱体积的差异,软件也会成比例调整进样体积。
注意由于我们改变了柱长,因此梯度程序时间也发生了变化。
在本例中,我们做了简单的转换,但是您同时还可以优化出峰速度或分离度。
高级模式中的其它功能还有待您去探索。
Mike:
使用同一根色谱柱时,如果梯度程序流动相配比范围有任何变化,若要保持相同的梯度斜率和k*值,就需要相应调整梯度时间或流速。
对于梯度洗脱分析,影响方法耐用性的两个重要变量是延迟体积和梯度陡度。
我们将首先讨论梯度陡度。
[showgradient_steepness.gif]
理解梯度方程是非常重要的。
分母要相应改变(梯度范围、柱体积等)去抵消分子的变化(梯度时间、流速),反之亦然。
请登陆A搜索LC方法转换器。
它是一个很好的帮助您妥善进行方法调整的工具。
梯度陡度
Rita:
我们再看一下梯度洗脱的保留值方程,以及它与梯度陡度的关系。
您可以认为梯度陡度b就是等度分离中有机溶剂的百分含量。
当梯度陡度减小时,保留时间增大;当梯度陡度增大时,保留时间减小。
并且梯度陡度减小时,峰宽增加,峰高降低。
关于梯度陡度请谨记以下事项:
∙只要b保持不变,您就可以看到色谱峰会以相同的相对格局被洗脱出来。
∙减小梯度陡度,并不意味着一定会得到更理想的保留时间和分离度。
换句话说,对于不同的分析物而言,改变有机溶剂的百分比,并不会产生相同的保留时间变化。
不同的分析物有特定的S值,该值反映了该分子对流动相中有机溶剂百分含量的敏感度。
[insertmolecular_vs.jpg]
∙对于大多数小分子(<几百Da),S值约为4-5,这对它们的敏感度不会有太大影响。
但肽类和蛋白质类的S值相对大的多,且彼此之间的差异可能会超过2-3个数量级。
∙这就是为什么分离肽类和蛋白质类时必须选用梯度分离,并且较小的梯度陡度变化就会引起其保留时间较大变化。
为了说明方程中的这些概念是如何在您的色谱分析中得以体现的,让我们一起来看几个例子。
[insertgradient_time_example.gif]
这里,我们将梯度程序时间从10分钟增加到60分钟,但保持其它梯度参数不变。
如从方程上得到的一样,我们得到了增大的梯度保留时间,并且显著地全面改善了梯度分辨率。
较长的梯度程序时间会导致较缓的梯度陡度,并且通过减小梯度陡度,我们可将色谱峰1和2、6和7分开[indicate]。
在下一个实例中,让我们一起来看一下梯度陡度与柱长的关系。
[insertgradient_steepness_example.gif]
每张色谱图的梯度陡度是相同的,即组分均保持了相同的洗脱模式,然而分析时间却从24分钟减少到12分钟。
在左边的色谱图中,在梯度程序时间30min、流速1.0mL/min的条件下,我们的样品在4.6x150mm,5µm色谱柱上得到了良好的分离。
当我们将柱长减小到75mm时,分析时间会显著缩短,此时柱体积减小了一半,分析时间也相应缩短了一半。
梯度陡度没有改变,但分析时间却缩短了50%。
同时减少了溶剂消耗,也获得了较短的色谱柱再平衡时间。
Mike:
好!
我想我们对如何在实际分析中应用梯度方程已有了一个很好的理解。
你还听说过什么其它的常见问题吗?
梯度陡度类似于等度分离中有机溶剂的百分比。
当梯度陡度减小时,保留时间增大;当梯度陡度增大时,保留时间减小。
请谨记以下要点:
-只要b保持不变,色谱峰就会以相同的相对格局被洗脱出来。
-减小梯度陡度,并不意味着就一定会得到更理想的保留时间和分离度。
分析结果取决于您的分析物。
流动相改性剂与基线漂移
Rita:
我们经常会接到一些运行梯度分析的分析员打来的有关基线漂移问题的求助电话。
运行梯度程序时,基线漂移是很常见的现象。
这是由于在梯度条件下,开始和结束时流动相的紫外吸收不一致造成的。
我们可能第一个要问求助者的问题是所用流动相里含有什么?
Mike:
这个表格中展示了许多常见流动相成分的紫外吸收截止波长。
我们相关的视频记录中有这张表,您登陆安捷伦的官方网页搜索“GradientVideoNotes(梯度洗脱视频记录)”即可查到。
[inserttable.jpg]
人们之所以喜欢使用乙腈的原因之一是乙腈的紫外吸收截止波长低(190nm),而甲醇的为205nm,THF的为212nm。
THF在215nm处有那么高的紫外吸收,因此它很难用于梯度分析。
并且依据您的梯度范围,THF的吸收度可能会高达2Aus。
而在较长的吸收波长如254nm处,可能就不会存在这样的问题。
因此在梯度洗脱分析中我们首先要考虑溶剂选择,接着还要进一步考虑所使用的改性剂。
1%醋酸溶液的紫外吸收截止波长为230nm,0.1%TFA溶液的紫外吸收截止波长为205nm。
曾经,我个人喜欢使用磷酸盐缓冲液和稀磷酸。
无论酸性还是中性pH值下,它们都具有绝对完美的紫外透光度。
Rita:
但是Mike,你不能每次都享用到磷酸盐的好处,有时也会遇到它不利的一面。
磷酸盐存在溶解度问题且不易挥发,在进行质谱分析时,许多人就不再选用磷酸盐。
Mike:
是的,因此如果您使用有机溶剂的浓度大于80%,应避免使用浓度大于10mM的磷酸盐缓冲液。
并且就导致磷酸盐沉淀来说,乙腈比甲醇更严重。
Rita:
当你试图简化操作而仅在流动相的水溶液部分加入改性剂时,你常会看到基线漂移。
在醋酸铵和甲醇作流动相的情况下,在215nm波长处,醋酸铵的背景吸收远大于甲醇,在梯度分析运行中这将会引起基线显著的负漂移。
负漂移对于大多数数据处理系统而言尤其是一个严重的问题。
为了抵消这种负漂移,您可以在流动相B中加入适量有紫外吸收的化合物。
理想情况下,流动相A和流动相B中的缓冲盐或改性剂的浓度应该相同。
换句话说,在梯度洗脱中,当仅有有机溶剂浓度改变时才能获得最理想的色谱分析结果。
当然也会有例外。
对于一些流动相改性剂,它们在水中和乙腈中的吸收度不同,这可能会在梯度形成后导致基线漂移。
TFA就是那样一个例子,导致一些常见的问题。
当我们使用TFA时,尝试使它在溶剂A中的浓度为0.1%,在溶剂B中的浓度约为0.09%。
现在我们一起来看一张色谱图,说明一下这个问题。
[inserteffect_of_tfa.gif]
在这个梯度洗脱分析中,流动相A和B中含TFA均为0.1%,在215nm波长下检测时,基线向上发生漂移。
如果我们将流动相B中TFA的浓度调整为0.09%这一较低的值时,就可以拉平基线,从而解决这个问题。
使用更长的波长检测,如254nm,也可以解决这个问题,但并非任何情况下都适用。
这是我们所希望看到的梯度分析的结果[insertgradient_sep_of_pep--tides.gif]
这显示了典型的梯度洗脱不同分子量大小的多肽类/蛋白质类组分的状况。
流动相A中含0.1%的TFA,流动相B中含0.085%的TFA。
其结果是基线水平,不仅看起来更好,且更有助于数据积分。
当然,您将常会碰到基线漂移很小而影响不大的情况,尤其是当您的色谱峰大小不变并且可以准确积分的话,那就没有什么关系。
Mike:
好。
现在让我们一起来谈谈延迟体积的问题。
Rita:
听起来很不错。
基线漂移是梯度洗脱中常见的问题。
它通常与流动相及其紫外吸收有关。
在许多应用中,理想的情况是流动相A和B中缓冲盐或改性剂的浓度相同。
当使用TFA时,尝试溶剂A中用0.1%的TFA,溶剂B中用约0.09%的TFA。
延迟体积
Mike:
那么,什么是延迟体积呢?
对于高压混合系统,延迟体积等于从溶剂在两个计量泵后混合点到柱头流经的所有体积之和。
对于低压混合系统,[showdwellvolum-e.gif]
延迟体积等于从比例阀经过泵到柱头流经的所有体积之和。
对于梯度分离,延迟体积实际上使梯度开始时进行了一段时间的等度洗脱,这个时间等于延迟体积除以流速。
过大的延迟体积会使一些仪器不能使用窄径色谱柱进行梯度分离。
较大的延迟体积不会影响等度分离,除了改变流动相时,平衡色谱柱需花费更长的时间。
当使用窄径色谱柱时,仪器配置是至关重要的。
使用窄径(2.1mmID)和微径(1mm,和<1mmID)色谱柱时,为了得到最佳的结果,必须将延迟体积和柱外体积最小化。
Rita:
因此即使是很小延迟体积的差异都可以改变分离度。
Mike:
是的,它们当然会。
在这张幻灯片[showgradient_example1]中,我们可以看到分离一个复杂混合物的模拟梯度分析色谱图。
上图是LC分离中实际数据的模拟。
将色谱峰的保留时间输入DryLab软件,仪器实际的延迟体积为0.43mL。
分析使用配有二元泵的Agilent1100LC系统,未启用混合器。
下图系使用延迟体积为2.0mL的仪器代替延迟体积为0.43mL的仪器进行相同分离后的模拟色谱图。
您可以看到在某仪器上两个本可以完全分离的色谱峰,在有较大延迟体积的仪器上却会一起流出。
[pointtosecond–lower–hyphenatedpeak]
在梯度分离中,不同的延迟体积会改变峰宽和相对保留时间。
建立梯度洗脱方法时,测试不同延迟体积对分析结果的影响是非常明智的!
一些仪器调整延迟体积时具有很大的灵活性。
我们有时使用这样的系统去模拟各种不同的HPLC配置,因为LC主要的区别之一就是延迟体积的不同。
[insertdwellvolume_compareison.gif]现在您可以看到在同一个系统上,同一个样品的四张不同的梯度分析谱图。
它们的梯度时间程序是相同的,但仪器经过重新配置实现了设定更宽范围的延迟体积。
我们可以看到,在这些特殊设置的色谱条件下,在最大的和最小的延迟体积时均出现了分辨率问题。
这表明最初的方法开发应在中等延迟体积条件的仪器上进行。
为使此方法可在四种配置的仪器上均正常运行,我们需要调整梯度程序并再次运行测试。
延迟体积等于从溶剂在两个计量泵后混合点到柱头流经的所有体积之和。
对于低压混合系统,延迟体积等于从比例阀经过泵到柱头流经的所有体积之和。
延迟体积实际上使梯度开始时运行了一段时间的等度洗脱,这个时间等于延迟体积除以流速。
在梯度分离中,延迟体积的差异会改变峰宽和相对保留时间。
延迟体积对方法耐用性的影响—梯度分离
让我们一起来看一个关于延迟体积的LC故障排除的实例。
请看这张色谱对比图。
[insertdwell_volume_comparison2.jpg]
注意早期流出的峰较宽。
这是由于延迟体积造成早期的峰实际流出较晚—实质上它们是以等度洗脱的方式流出的。
如果这干扰了分离或检测的结果,我们需要减小延迟体积或将此应用移至另一个系统。
当建立梯度分离方法时,重要的是您首先要测量并记录您所使用仪器的延迟体积。
当将梯度方法转移到其它仪器和实验室时,明确延迟体积的差异是很重要的。
我们在视频记录中提供了仪器延迟体积的直接测量方法,您可以登陆安捷伦网站搜索“GradientVideoNotes(梯度洗脱视频记录)”或在视频播放器中点击“getnotes(获得记录)”按钮找到它。
这里还有几种测量延迟体积的方法供您选用。
现在我将为您演示其中的一种。
[demo]
首先,准备一张整版横向打印有梯度变化曲线的纸,或者像我们这里所做的,将图像复制粘贴到Powerpoint(幻灯片)中。
[insertcalculate1.gif]
[backtoMike,withrulerandprintout]使用尺子在纸上或在Powerpoint(幻灯片)中插入线段,在如下位置处绘制与x或y轴平行的线:
1.0%B区域信号为零处
2.100%B区域最大稳定信号处
3.在2.0min处绘制一条垂直线
您得到的图像看起来像这张图片[insertcalculate2.gif]
三条线绘制完毕后,再绘制另外两条线:
4.计算这一步50%处的响应值,在本例中应为24.5mAU,在该位置绘制一条穿过图形的水平线
5.在50%响应值与实际的检测信号的交点处绘制一条垂直线
您得到的新图应该像下面的这张幻灯片中所示。
[insertcalulate3.gif]
[showonprintout,pointing,asdescribing]测定沿x轴方向,至50%B垂直线交点的时间,应尽可能的精确,在该时间点处得到50%响应值。
在延迟体积的估算中,0.1min的误差将会导致50µL的误差。
在本例中,我们估算50%的时间为4.04min。
关于延迟体积的计算,一个简单的公式是[时间(50%响应值处)–时间(步长)]x流速=延迟体积
那么在本例中的延迟体积就应为(4.04-2.00)minx500µL/min=1020µL。
该测定在Agilent1200RRLC系统(1200SL)上运行,表观背压340bar,通过一个额定的100cm,0.062mm(0.0025英寸)i.d.PEEK限流器。
用水做特定的溶剂在液流输运过程中进行可压缩性补偿。
这个系统包括了标准混合器、脉冲阻尼器和一个正常流路中运行的自动进样器(与旁路模式对照),以及上面提到的限流器,并配备有3mm2µL的流通池。
Rita:
为了考察延迟体积对梯度分离的影响,您必须在梯度运行开始时,增加或减少等度洗脱的时间。
如要在较小延迟体积的系统上模拟较大的延迟体积,您可在梯度程序开始时设置一个保持时间,这个时间等于这两个延迟体积的差值(mL)除以流速(mL/min)。
模拟比您当前的仪器小的延迟体积时,您必须调整进样器程序,延迟进样时间,延迟的时间等于滞后时间。
有些仪器有这个功能,有些仪器没有。
最后,在您编写的方法中,记录下方法建立时仪器的延迟体积及其对分离的影响是非常重要的。
当将梯度方法转移到其它仪器和实验室时,明确延迟体积的差异是很重要的。
自动进样器程序辅助梯度洗脱优化
Mike:
延迟体积同样也包括进样器体积,所以减小进样器内体积及其周围连接管路的体积是很重要的。
大多数Agilent自动进样器提供旁路运行模式的选项,样品从样品环中被冲出后,进样器再转回到载样位置[demo]。
依据您现在使用的自动进样器类型,系统体积最多可减少300µL。
一个标准的Agilent仪器原始的延迟体积约为1100µL,通过改用内径较小的管线,启用自动进样器的旁路功能,并拆除混合器和阻尼器,这样可使延迟体积减小到约为280µL。
[Demo]
在快速梯度分离中,您可以通过重叠进样缩短分析时间。
重叠进样即自动进样器在前一针的运行过程中吸取样品,并在系统准备好时进样。
这样每次运行的时间可减少约30s或更多。
如果您正在以快速梯度分析法运行组合化学产物分析时,分析时间可缩短1/3。
[demo]
如果您使用非常小规格的色谱柱,如毛细管柱和微径柱进行大量的梯度分析工作,280µL的延迟体积还是显得太高了。
对于使用这些色谱柱进行的分析,选用AgilentCapillaryLC系统是非常重要的。
如果在您的梯度运行中有早期的洗脱峰,不要忘记减小柱外体积和注入适量的样品稀释液,这也是极为重要的。
这可以帮助我们使系统峰展宽最小化,否则会降低分辨率。
此外,为了采集到快速流出色谱峰足够多的数据点,我们要确保检测器的响应时间参数设置正确[demo]。
否则扭曲的宽峰就可能会出现。
延迟体积同样也包括进样器体积,所以减小进样器内体积及其周围连接管线的体积是很重要的。
小结
Rita:
因此,总的来说,在进行梯度分析时需谨记一些关键的事情。
首先,使用梯度方程。
利用在线方法转换器帮助您正确地调整流速、梯度程序时间等,使您的调整匹配色谱柱规格的变化。
Mike:
其次,关注您的改性剂及它们的紫外背景吸收。
这是基线漂移和一些混合问题如基线波动的常见根源。
如果您正在从事梯度洗脱分析的工作,您需要了解您系统的延迟体积,并在方法建立时调整适应它。
如果您使用较小规格的色谱柱,这一点尤其重要。
减小延迟体积的方法之一是改用更小的混合器。
Rita:
一如既往地,如果您遇到了问题,您随时可以联系安捷伦技术支持寻求帮助。
您可以登陆A[showonscreentheurl:
使用梯度洗脱时的要点:
熟悉梯度方程,切记改变方法变量时,应按需调整梯度程序。
适当调整改性剂,确保紫外吸收背景一致,避免基线漂移。
了解您系统的延迟体积,并在方法建立时调整适应它。
考虑使用较小的混合器,减小延迟体积。
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