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RNA的变电泳原理
RNA的琼脂糖凝胶电泳
实验原理
RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。
非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。
只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。
因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶。
在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
基本过程同DNA电泳一样,但应明确一点的是,因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感,因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液,所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解;另外,因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的变性剂为甲醛和戊二醛。
RNA非变性琼脂糖凝胶检测
实验材料、器具及药品
蘑菇的总RNA溶液。
电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。
琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,0.5μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。
实验步骤
(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
(2)在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4ul于封口膜上。
在实验台上再加入5ul1×TAE电泳缓冲液及1ul的10X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
(3)打开电源开关,调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。
在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
非变性电泳:
上样量超过3ug,电压超过6V/cm,电泳缓冲液时间太长,均可能导致28S和18S条带分不开。
使用2ug上样量,电压小于6V/cm,使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液,是获得好的电泳结果的前提。
(以DNA标准为参照,28S和18S分别位于2.0kb和0.9kb左右。
)
变性电泳条带变淡:
EB与单链的结合能力要差一些,故同样的上样量,变性电泳比非变性电泳要淡一些。
另外的可能是甲醛的质量不高。
RNA的变性琼脂糖凝胶检测
试剂:
(1)MOPS缓冲液(10*):
0.4mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS)(PH7.0),0.1mol/LNaAc,10mol/LEDTA。
(2)上样染料:
50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝。
(3)甲醛。
(4)去离子甲酰胺。
电泳槽清洗:
去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。
操作:
(1)将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。
(2)配制琼脂糖凝胶。
①称取0.5g琼脂糖,置干净的100ml锥形瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
②待胶凉至60--70℃,依次向其中加入9ml甲醛、5ml10XMOPS缓冲液和0.5ul溴化乙锭,混合均匀。
③灌制琼脂糖凝胶。
(3)样品准备:
①取DEPC处理过的500ul小离心管,依次加入如下试剂:
10xMOPS缓冲液2ul,甲醛3.5ul,甲酰胺(去离子)10ul,RNA样品4.5ul,混匀。
②将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。
③向管中加入3ul上样染料,混匀。
(4)上样。
(5)电泳:
电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,于7.5V/ml的电压下电泳。
(6)电泳结束后,在紫外灯下检查结果。
RNA提取、电泳注意事项,有几点说得很好啊
快速的操作,低温环境,少量取上清
主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。
分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧
提取RNA所用的枪头,EP管。
直接高压烘干即可。
如果用0.1%DEPC处理,要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头,EP管方有效。
我做的都是将枪头泡在配制好的depc中,摇振过夜,然后倒掉depc注意要到干净,再高压,为了防止仍残留液体可120度干烤一会
A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤
B.您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC处理
C.在提取RNA之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip头,镊子,匀浆器)都准备好
D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候TRIzol液体成浑浊状,而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将TRIzol转出,继续后续的步骤.
1RNase是一种蛋白酶,能够降解RNA。
2我们的手上皮肤上有很多,应该是对我们的身体起保护作用。
保护不被RNA病毒感染?
或者什么的。
3这个酶高效稳定。
要么在DEPC水中处理n小时,要么在160度高温烘烤6小时。
此酶才会失效。
4所谓DEPC,是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。
有毒啊。
所谓DEPC水,一般指两种状态,a,配制好未消毒;b,配制好已消毒。
通过高压消毒,该物质会降解,从而无毒。
1无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室温搅拌4小时以上至完全溶解,高压灭菌20分钟,冷却备用。
这个是DEPC水的b状态。
2如果你要用DEPC水处理Tips等等东东,那么就要用高压前的水,即DEPC水的a状态。
把枪头管子等完全浸泡至少8小时,我一般都是过夜的,或者平时就泡在里面备用。
RNA提取必须创造无RNase的环境,所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理:
研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上;电泳槽、胶板、梳子、用0.1%~0.2%DEPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS(Sodiumdodecylsulfate,抑制RNase的活性)浸泡过夜,然后用ddH2O冲洗干净,晾干备用;离心管,枪头等塑料器皿要用0.1%~0.2%DEPC水处理之后(DEPC有致癌之嫌,须小心操作)。
37℃保温12h以上,然后高压灭菌,灭活DEPC(Diethypyrocarbonate);溶液都需用经DEPC处理过的水配置,RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。
我们研究所里提RNA用的枪头和EP管都是高压两遍的,没有用DEPC水处理。
1、有灭菌过的DEPC水,这一般是用来配75%乙醇用,因为乙醇若高压灭菌会挥发,所以乙醇是新开封专用的。
2、没有经高压灭菌的DEPC水,这主要是用于配你提RNA所用的其他试剂(所说的试剂是可以经高压灭菌的),总的来说,都得经过高压灭菌,目的就是要去除DEPC,以防止它以随后实验的干扰。
3、DEPC处理水:
无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室温搅拌4小时以上,121度高压灭菌20分钟,冷却备用。
凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。
DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。
试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。
但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。
配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂.
为啥在28s之后还是有影影约约的片断?
和模糊的smear?
这都与非变性电泳方式有关。
RNA的电泳,严格讲是要使用变性电泳的,我们平时所知道的RNA电泳的知识,实际上都是由变性电泳获得的。
但因为非变性电泳实在是太方便了,同时,就一般检测而言,完全可以替代变性电泳,所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。
电泳时间太长了容易产生降解。
最好是在120V左右。
操作的时候有没有注意戴口罩和手套,注意,手套要经常换,不要太节约了。
那样也会影响RNA的质量。
无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的,都得用75%的酒精洗涤一次。
1样品不要太多,抽提务必充分,室温放置5min;
2200ul氯仿剧烈振荡20s,室温放置2-15min;
313000g离心15min;
4取上层水相,一般400-450ul就足够了,千万不要贪多!
***
5加入500ul异丙醇摇匀,室温放置10min;
612000g离心10min;
775%乙醇1000ul洗涤沉淀;
87500g离心5min;(12000转速太高了吧,沉淀不容易溶解的)
9弃乙醇,吸干净残余的微量乙醇,室温干燥3-5min;(时间太久沉淀不易溶解)
10适量DEPC水溶解沉淀。
电泳的上样量1ug,电泳buffer用DEPC处理的水配制,电泳时间不要太久,95V,10-15min足够了。
建议跑RNA电泳。
先用2%琼脂糖胶,若分离效果不好,可用甲醛变性胶。
在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。
注意观察带形,质量较好的RNA亮度。
28S:
18S应为2:
1。
还要注意观察,在加样孔或刚出加样孔附近,有没有带,若有,可能为基因组DNA污染。
OD值只有1.5,可能为基因组DNA污染。
参考一下分子克隆3。
上面有OD值与污染DNA的关系。
建议,酚氯仿抽提后,上清可少吸一些。
提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。
注意该酶的buffer中有一种物质在OD260有吸光度,应严格按照其protocol操作,减少误差。
只要用DEPC处理过的水,打开一瓶新的无水乙醇(或者专用于RNA的,即只用处理过的枪头取过乙醇的)配就可以了。
DEPC高温高压时变成CO2和水,再加上乙醇也很容易气化,可能是因为有气体产生吧,如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。
(我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过)而且,湿热灭菌本身不足以去除RNA酶,所以我觉得有时候,灭菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦
75%的乙醇用于提取RNA时最好还是现用现配,乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面,也就是留一瓶专门用于提取RNA。
DEPC一般高压灭菌30分钟就可以了!
75%乙醇:
灭菌后的千分之一DEPC水25ml75ml无水乙醇.配好后装入高温烘烤的玻璃瓶中(160干烘四小时),或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小时以上再灭30分钟,存放于低温冰箱4度保存!
!
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实验十一动物组织细胞总RNA的提取
一、实验原理
RNA是基因表达的中间产物,存在于细胞质与核中。
对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。
获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的,如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于RNA的质量。
由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在,所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂,迅速破坏细胞结构,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA。
再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离,得到纯化的总RNA。
在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性,保护RNA分子不被降解。
因此提取必须在无RNase的环境中进行。
可使用RNase抑制剂,如DEPC是RNase的强抑制剂,常用来抑制外源RNase活性。
提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂,也能抑制RNase活性。
并有助于除去非核酸成分。
本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行鉴定。
二、仪器和试剂
1.仪器:
超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、
玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h;不耐高温的器皿(如塑料制品)应用0.1%DEPC浸泡2h,70~80℃烘烤干燥,120℃高压20min,再70~80℃烘烤干燥方可使用。
2.试剂:
(1)细胞裂解液:
异硫氰酸胍4mol/L柠檬酸钠(pH7.0)25mmol/L十二烷基肌氨酸钠0.5%β-巯基乙醇0.1mol/L称取柠檬酸钠0.64g,十二烷基肌氨酸钠0.415g,吸取β-巯基乙醇0.7ml,用无Rnase的蒸馏水溶解,定容至50ml。
然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml,异硫氰酸胍25g,混合,完全溶解后4℃保存备用。
(2)10×凝胶缓冲液:
吗啉代丙璜酸(MOPS)(pH7.0)200mmol/L,NaAc100mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L
过滤除菌后避光保存。
(3)5×变性上样缓冲液:
(水饱和的溴酚蓝16μl500mmol/LEDTA(pH8.0)80μl甲醛(37%)720μl甘油2ml甲酰胺3084μl10×凝胶缓冲液4ml加无RNase水至10ml,4℃可保存3个月。
)
(4)TRIzolRNA抽提试剂
(5)2mol醋酸钠
(6)0.1%DEPC
(7)平衡酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)
(8)平衡酚、氯仿
(9)无水乙醇、70%乙醇、异丙醇
(10)无RNase水
琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测
(1)制备凝胶(1.2%)。
称1.2g琼脂糖,加72mlDEPC处理水,加热熔化。
冷却至60℃,在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml,甲醛(37%)18ml,混匀后,倒胶。
(2)制备样品。
在离心管中,将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4:
1混匀。
65℃温育5~10min,迅速在冰上冷却5min,离心数秒。
(3)上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品卷入上样孔。
以5V/cm的电压电泳1.5~2h.。
(4)待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处结束电泳。
将凝胶置于溴化乙啶溶液(0.5μg/ml,用0.1mol/L乙酸胺配制)中染色约30min。
(5)在凝胶成像系统观察并分析。
四、注意事项
1.RNA是极易降解的核酸分子。
因此提取总RNA必须在无RNase环境中,戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。
2.所有溶液应加DEPC至0.05%~0.1%,室温处理过夜,然后高压处理或加热至70℃1小时或60℃过夜,以除去石油残留的DEPC。
3.所用的化学试剂应为新包装,称量时使用干烤处理的称量勺,所有操作均应在冰浴中进行,低温条件可减低RNA酶活性。
4.根据RNA样品的紫外吸收OD值,可计算出RNAd浓度。
单链RNA[ssRNA]=40×(OD260-OD310)×稀释倍数
纯RNAOD260/OD280比值通常在1.7~2.0。
若比值低于1.7,说明有蛋白质等污染,应用酚/氯仿在抽提。
若比值低于2.0,表明有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。
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- RNA 电泳 原理