DNA甲基化与肿瘤.docx

DNA甲基化与肿瘤.docx

《DNA甲基化与肿瘤.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA甲基化与肿瘤.docx（26页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

DNA甲基化与肿瘤

DNA甲基化与肿瘤

张丕显

（05级博士研究生）

摘要：

本文综述了DNA甲基化的研究进展。

哺乳动物DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。

DNA的甲基化可致基因突变（CT）与基因沉默。

基因的甲基化沉默机制有两种：

由于启动子区的甲基化导致启动子区结构改变，启动困难；甲基化引起组蛋白脱乙酰化而致染色质结构改变，关闭基因。

目前，甲基化检测常用甲基化特异的PCR（MSP），检出限可达0.1%。

肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变。

表现为总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。

表现为抑癌基因与修复基因的高甲基化与反转录转座子、癌基因的去甲基化。

造成肿瘤甲基化改变的原因可能与甲基转移酶、p21WAF1及染色质结构改变有关,而甲基转移酶的调控机制尚不清楚.

关键词:

DNA,甲基化,肿瘤

引子

人类对基因本质的认识逐步深入,目前正经历着更全面的认知过程。

早期遗传学家认为,基因是一个遗传的功能单位,决定某种遗传性状,它们在染色体上占有一定的位置,并可发生突变和交换;随着DNA作为蛋白质遗传密码载体的发现,分子遗传学和遗传工程技术的迅速发展,遗传学界基本上接受了下述定义:

基因是编码一条多肽链的特定DNA片段。

近几年来随着学科的进展,一些研究者对上述看法提出了质疑[1～3]。

人类基因组计划中DNA测序工作的基本完成,只确定了3万多个基因,仅是果蝇的2倍多,很难想象DNA含有充分的遗传信息以调控人类如此复杂有机体发育和生存的全过程[4]。

实际上在人类细胞中只有数千个基因有活性,因此维持细胞的正常功能,决定什么样的一组基因有功能,而另一组基因无功能,都是十分重要的。

如果出错就会引起严重的后果,据估计至少3个基因错误表达就能诱发正常细胞癌变[2]。

这样在人类基因组含有两类遗传学信息,传统意义上的遗传学信息提供了生命所必需的蛋白质的模板;而表遗传学的信息提供了何时、何地和何种方式应用这些遗传学信息的指令[4]。

表遗传学1942年由Waddington首先提出,研究基因型产生表型的过程,此后Holliday进行了一系列的探讨[5]。

目前认为,表遗传学是研究没有DNA序列变化、可遗传的基因表达（活性）的改变。

还有研究者从不同角度进行描述,例如相对于DNA序列质的改变的遗传学研究,表遗传学被定义为研究基因表达水平（量变）信息的遗传。

也有研究者从遗传学角度,把表遗传学定义为非孟德尔遗传,或没有DNA序列改变的核遗传。

2003年10月，人类表观基因组协会（HumanEpigenomeCon-sortium,HEC）宣布开始投资实施人类表观基因组计划（HumanEpigenomeProject,HEP）,标志着生命科学的研究已悄然进入后基因（表基因）时代.而甲基化是表遗传学作用的主要形式.

DNA甲基化

　DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase,DMT）的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。

DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等[8]。

但在哺乳动物,DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上.生成5-甲基胞嘧啶（5mC）[9].反应如下:

图1DNA甲基化

人类的CpG以两种形式存在,一种是分散于DNA中,另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛。

在正常组织里,70%～90%的散在的CpG是被甲基修饰的,而CpG岛则是非甲基化的[10]。

DNA甲基化分析的方法

分析DNA甲基化的位点与程度的实验方法有两类：

一类（MSREs）利用对甲基化碱基敏感的限制性内切酶。

该酶不能切割甲基化的碱基位点，从而产生片段差异，电泳后，根据片段与量的差异找到甲基化位点与甲基化程度[6]；另一类是利用将没有甲基化的C变为其它碱基或其它物质，而甲基化的C不会发生相应变化来识别甲基化位点。

甲基化特异的PCR（Methylation-specificPCR,MSP）[7]是较好的常用的方法。

该法用HSO3-处理单链DNA，使所有未甲基化的C脱氨转变为U,而甲基化的C则保持不变。

然后经特异性扩增放大，测序。

C位点就是甲基化位点，C的量即甲基化量。

该法灵敏度高,可检出比例为千分之一的甲基化等位片段,且对DNA的质和量要求也低,能用于微量的DNA或石腊包埋组织DNA的甲基化分析。

甲基化酶

目前,在真核生物中发现了3类DNA甲基转移酶（Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b）:

Dnmt1主要是维持DNA的甲基化;Dnmt2可与DNA上特异位点结合,但具体作用尚不清楚;Dnmt3主要是参与DNA的从头甲基化。

Dnmt3b基因的RNA和蛋白在肿瘤组织中明显的高表达,而Dnmt1和Dnmt3a在肿瘤组织中仅适度过表达。

对10例肿瘤组织中上述基因的表达分析发现,5个样本中Dnmt3a高表达;6个样本中Dnmt1高表达;8个样本中Dnmt3b高表达[11]。

甲基化的作用

1．基因C→T突变

DNA甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。

DMT可以加快C（胞嘧啶）和5mC脱氨,封闭U（尿嘧啶）的修复,并且使U→T改变,故DMT促使CpG序列的C→T突变[12]。

图2CT突变

抑癌基因p53就是一个典型的例证。

50%实体瘤病人出现p53基因突变。

突变中24%是CpG甲基化后脱氨引起的C→T突变。

2　影响基因错配修复　

DNA错配修复系统（DNAmismatchrepairsystem,MMR）是指存在人类细胞中的一种修复DNA碱基错配的安全保障体系,它是由一系列特异修复DNA碱基错配的酶分子组成。

Ahujia等[13]研究发现MMR缺陷时,CpG岛的甲基化增强,并认为MMR与DNA甲基化有关。

在基因错配修复过程中甲基化具有导向识别作用,而在错配修复基因表达缺陷的原因中基因突变和基因启动子区的高甲基化是其主要原因[14]。

3．基因沉默

目前认为,甲基化影响基因表达的机制有下列几种:

①直接作用。

基因的甲基化改变了基因的构型,影响DNA特异顺序与转录因子的结合,使基因不能转录;②间接作用。

基因5′端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白（methylCG-bindingprotein）结合,阻止了转录因子与基因形成转录复合物;③DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质环境。

DNA去甲基化常与DNaseI高敏感区同时出现,后者为基因活化的标志[15]。

如图所示:

具有转录活性的DNA,在甲基化后与MBD（methyl-bindingdomain）蛋白如MBD2、MeCP2结合,而该蛋白上连着的组蛋白脱乙酰基酶（HDAC1和2）使组蛋白脱乙酰化,导致染色质结构变化,转录抑制.（MTA2,metastasis-associatedprotein2;RbAp46/48,retinoblastoma-associatedprotein46/48;RNApolII,RNApolymeraseII;SAP18/30,Sin3-associatedpolypeptides18/30）[16]

甲基化与肿瘤

现在的研究认为DNA甲基化与肿瘤密切相关。

肿瘤的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与启动子区CpG岛的甲基化水平升高。

抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活,造成肿瘤抑制丧失与基因损伤增加;而总体地低甲基化使反转录转座子、癌基因活化，使染色体不稳定。

高甲基化

在肿瘤中，常见的被甲基化的抑癌基因与修复基因列于表1。

它们与细胞周期调控（如p16INK4a,p15INK4a,Rb,p14ARF）、DNA修复（BRCA1,MGMT）、细胞凋亡（DAPK,TMS1）、抗药性、分化、血管生成与转移等相关联。

表1常见的被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用

基因

基因沉默对肿瘤的意义

肿瘤类型

APC

对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性失去调节作用

乳腺癌[17]、肺癌[18]、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、肝癌

BRCA1

与DNA修复与转录激活有关

乳腺癌[19]、卵巢癌[20]

CDKN2A/p16

周期素依赖性蛋白激酶抑制剂

GIT[21]、头与颈部瘤[22]、NHL[23]、肺癌[21]

DAPK1

钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶;凋亡抑制

肺癌[24]

E-cadherin

增强增殖、侵袭与转移

乳腺癌[25]、甲状腺癌[26]、胃癌[27]

ER

激素抵抗

乳腺癌[28]、前列腺癌[29]

GSTP1

失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用

前列腺癌[30]、乳腺癌[31]、肾癌[31]

hMLH1

缺损DNA错配修复,基因点突变

结肠癌[32]、胃癌[27]、子宫内膜瘤[33]、卵巢癌[34]

MGMT

p53-相关基因，与DNA修复及耐药性有关

肺癌[24]、脑瘤[35]

P15

细胞的过度激活与增殖

非白血性白血病[36]、淋巴瘤[37,38]、鳞状细胞癌、肺癌

RASSF1A

失去了对G1/S负调控抑制作用

肺癌[39]、乳腺癌[39]、卵巢癌[39]、肾癌[40]、鼻咽癌[41]

Rb

不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录

成视网膜细胞瘤[42]、少突神经胶质（细胞）瘤[43]

VHL

错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性

肾细胞癌[40]

缩写:

APC,adenomatouspolyposiscoli;BRCA1,breastcancer1;CDKN2A/p16,cyclin-dependentkinase2A;DAPK1,death-associatedproteinkinase1;ER,estrogenreceptor;GSTP1,glutathioneS-transferasePi1;hMLH1,MutLhomologue1;MGMT,O-6methylguanine-DNAmethyltransferase;RASSF1A,Rasassociationdomainfamilymember1;Rb,retinoblastoma;VHL,vonHippel-Lindau;GIT,gastrointestinaltract;NHL,non-Hodgkin’slymphoma.

P16基因:

p16基因5’-CpG岛甲基化已被证实并且与多种肿瘤中p16的转录抑制有密切的关系。

而且,用5-aza-dC干预甲基化的细胞系可导致启动子区域甲基化水平的严重下降而使p16基因重新表达和随后的G1/S细胞周期循环阻滞[44]。

Boltze等[45]发现甲状腺肿瘤中p16基因的突变或等位基因缺失并不多见,并认为p16基因启动子甲基化是p16在甲状腺肿瘤发生过程中失活的机制。

采用MSP（methylation-specificPCR）检测77例甲状腺肿瘤和15例正常甲状腺组织中p16启动子区的甲基化状态,结果显示高甲基化发生在13%的正常组织、33%的滤泡状腺瘤、44%的乳头状癌（papillarythyroidcancer,PTC）、50%的滤泡状癌（follicularthyroidcancer,FTC）、75%的差分化癌、85%的未分化癌中。

同时伴随着启动子的高甲基化p16蛋白表达缺失。

上述结果提示p16启动子区的高甲基化是甲状腺肿瘤发生中的早期事件并与肿瘤的进展和分化有关。

RASSF1A基因:

RASSF1A基因定位于3p21.3,是一种新的肿瘤抑制基因,与多种人类肿瘤有关。

RASSF1A基因是继p16基因以来所发现的在肿瘤中甲基化程度最高、最广泛的基因之一,大量研究表明RASSF1A表达缺失和启动子区高甲基化有着广泛的肿瘤谱,故该基因有望在多种肿瘤的早期诊断、预后判断中发挥重大作用。

研究表明甲状腺癌中RASSF1A启动子CpG岛区在9个甲状腺癌细胞系中完全甲基化,其基因表达缺失,经去甲基化处理后其基因表达恢复[46]。

在38例原发性甲状腺癌中,71%的样本存在RASSF1ACpG岛的高甲基化。

Xing等[47]用适时定量MSP研究了包括良性腺瘤在内的各种甲状腺肿瘤中RASSF1A的甲基化状况。

结果发现,RASSF1A的异常甲基化在早期的良性腺瘤即是一个多发事件,而在癌中甲基化水平更显著。

RASSF1A启动子区CpG岛的高甲基化能致RASSF1A基因的转录失活,这种表遗传的失活是甲状腺肿瘤发生中的一个早期步骤,在甲状腺肿瘤的恶性发展中可能发挥着重大的作用。

有些基因，在肿瘤中，普遍被甲基化，如p16、RASSF1A。

而有的基因只在特定的肿瘤中被甲基化，如GSTP1，在90%前列腺癌中高甲基化，相反，在急性髓细胞样白血病中大多没有甲基化[30，36]。

目前，研究得最详细的肿瘤是肺癌，发现其40多种基因存在一定程度的DNA甲基化改变，而其中高甲基化的是RAR、RASSF1A、CDNK2A、CHD13和APC.[48]

低甲基化

低甲基化的缺陷在恶性肿瘤（malignancies）中广泛存在[49,50]。

在实体瘤如转移的肝细胞癌[51]、在颈癌[50],前列腺癌[52]以及在恶性血液病如B-细胞慢性淋巴细胞性白血病[34]中都很普遍。

总体的低甲基化在许多癌症中观察到，如乳腺癌、颈癌、脑瘤等。

并且，其程度与恶性程度有正比关系[53]。

癌细胞基因组低甲基化主要发生在卫星系列、重复系列、中心粒区域以及原癌基因系列[54,55].

03年，美国《science》杂志同期刊登的三篇文章[56,57,58]已经肯定了DNA的总体低甲基化导致的基因不稳定性对肿瘤的发生起着构成原因的作用。

在老鼠模型中，目前已经证明从胚胎到成体发育过程中，利用DNA甲基化转移酶（DNMT）的突变导致染色体去甲基化，可以引起老鼠基因组不稳定和导致淋巴瘤[56,57]。

低甲基化致癌的机制有三种：

低甲基化促进了有丝分裂的重组，导致杂合性丢失（LOH）和核型重排。

中心粒系列去甲基化使染色体非整倍体化[59]。

转座元件的再活化，如本来出于沉默状态的LINES核Alu等重复序列由于去甲基化而活跃起来，可能移动到基因组其它位置，破坏基因的功能[60]。

基因组印记的丢失[61]。

印记丢失可能导致某些与细胞增殖和转化相关基因过表达，而与细胞分化和凋亡相关基因的表达受阻。

值得提出是：

人们绝对相信低甲基化可直接激活癌基因。

实验中也的确观察到癌基因的低甲基化，如H-ras[62]和c-myc[63]。

但并没有找到它们的低甲基化与转录增加的相关性。

是技术性问题，还是在本质上它们的低甲基化就与转录没有关系？

肿瘤甲基化改变的原因

是增加了甲基化酶的表达吗？

一谈到甲基化的调控因素，人们首先想到的是甲基化酶。

Vertino[64]发现在immortalizedhumanfibroblasts中DNMT1高表达，并使CpG岛甲基化增加。

在其它不同的肿瘤中也同样观察DNMT1的高表达[65，66，67，68]。

但随后的研究表明，DNMT1增加的水平与肿瘤标志物相比却是下降了[69，70，71]。

这提示DNMT1水平的升高是肿瘤细胞增殖的结果。

DNMT1是甲基化维持酶。

肿瘤细胞有较高的甲基化水平。

随着肿瘤细胞数量的增加，DNMT1应该具有较高的水平才能维持肿瘤细胞的甲基化水平。

更令人不解的是，当Rhee,I等[72]灭活了DNMT1gene后，发现对HCT116结肠癌细胞的甲基化水平一点影响也没有，也不能使高甲基化的p16等抑癌基因去甲基化。

这些研究结果，使人们难以相信DNMT1在肿瘤的甲基化改变中发挥着重要作用。

至于DNMT3a与DNMT3b，报道是相矛盾的，有的说观察到了他们的升高[73，74]，有的说没有[70，71]。

目前看来，甲基化酶对肿瘤甲基化异常的直接作用只能打上“？

”了。

是p21waf1的作用吗？

在这个故事里，人们提出了p21waf1占位的假说：

肿瘤中出现的总体低甲基化与CpG岛高甲基化是由于DNMT1锚定目标进行甲基化的位置被其它物件所占据，使之不能进行甲基化，导致整个基因的甲基化水平降低。

而自由的、没事干的DNMT1错误地将CpG岛上的C甲基化了,导致了CpG岛高甲基化.该假设的根据是:

DNMT1与p21waf1（周期素依赖性蛋白激酶抑制剂）在PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）上有相同的结合域[75],而DNMT1与PCNA的结合对于DNMT1锚定复制复合体非常重要;来自p21waf1的小肽的确对DNMT1-PCNA复合体有很强的抑制作用[75];在正常细胞中,DNMT1与p21waf1的表达是互相排斥的,而在肿瘤细胞中两者能同时表达[76];p21waf1在乳腺癌、肺癌、卵巢癌及肝细胞癌的早期高表达[77,78,79,80].

其它因素

对肿瘤甲基化异常的解释假说还很多，如大复合体学说、组蛋白的乙酰化与染色质结构异常等。

其中染色质结构异常比较有力。

在正常细胞中，散在的C是被甲基化的，而CpG岛没有被甲基化.这本身说明了是CpG岛的整体结构抑制了对它的甲基化,是它的结构特点或是与它结合的蛋白抑制了甲基化酶对它的甲基化.当某种因素导致它的结构特点以及与它连接的那个蛋白结构改变时,它便被甲基化.可能是CpG岛被甲基化后的结构更易被甲基化导致CpG岛高甲基化.事实上,CpG岛上C含量高,自然是高甲基化.

问题与展望

DNA的甲基化涉及基因的“开”与“关”，因此意义重大。

但对DNA甲基化我们还知之太少，可以说DNA甲基化研究才刚刚开始，许多急待解决：

怎样提高甲基化检测的灵敏与准确度？

正常组织与肿瘤组织的甲基化精细“图谱”是怎样的？

甲基化的选择性

甲基化的调控

高效的甲基化治疗

解决这些问题的难度不小，但相信通过广大科研工作者的共同努力一定会迎来甲基化的完全理解与控制。

为人民卫生服务。

参考文献

1　WuCetal.Genes,Genetics,andEpigenetics:

ACorrespondence.Science,2001,293（5532）:

1103-1105.

2　WolffAP.Chromatinremodeling:

whyitisimportantincancer.Oncogene,2001,20（24）:

2988-2990.

3　PennisiE.BehindtheScenesofGeneExpression.Science,2001,293（24）:

1064-1067.

4　RobertsonKD.DNAmethylation,methyltransferases,andcancer.Oncogene,2001,20（24）:

3135-3155.

Abstract:

Thefieldofepigeneticshasrecentlymovedtotheforefrontofstudiesrelatingtodiverseprocessessuchastranscriptionalregulation,chromatinstructure,genomeintegrity,andtumorigenesis.RecentworkhasrevealedhowDNAmethylationandchromatinstructurearelinkedatthemolecularlevelandhowmethylationanomaliesplayadirectcausalroleintumorigenesisandgeneticdisease.Muchnewinformationhasalsocometolightregardingthecellularmethylationmachinery,knownastheDNAmethyltransferases,intermsoftheirrolesinmammaliandevelopmentandthetypesofproteinstheyareknowntointeractwith.ThisinformationhasforcedanewviewfortheroleofDNAmethyltransferases.Ratherthanenzymesthatactinisolationtocopymethylationpatternsafterreplication,thetypesofinteractionsdiscoveredthusfarindicatethatDNAmethyltransferasesmaybecomponentsoflargercomplexesactivelyinvolvedintranscriptionalcontrolandchromatinstructuremodulation.ThesenewfindingswilllikelyenhanceourunderstandingofthemyriadrolesofDNAmethylationindiseaseaswellaspointthewaytonoveltherapiestopreventorrepairthesedefects.

5　HollidayR.MutationRes,2001,483（Suppll）:

s3

6周玉球.DNA甲基化分析技术的研究进展.国外医学遗传学分册　2001,24（6）:

303-308

7HermanJGetal.Methylation-specificPCR:

AnovelPCRassayformethylationstatusofCpG islands。

ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:

9821-9826.

Abstract:

PrecisemappingofDNAmethylationpatternsinCpGislandshasbecomeessentialforunderstandingdiversebiologicalprocessessuchastheregulationofimprintedgenes,Xchromosomeinactivation,andtumorsuppressorgenesilencinginhumancancer.Wedescribeanewmethod,MSP（methylation-specificPCR）,whichcanrapidly