本科微免实验1.docx
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本科微免实验1.docx
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本科微免实验1
微生物实验一
内容一:
微生物(细菌)的分布
内容二:
理化因素对细菌生长的影响
微生物种类繁多,广泛存在于土壤、空气、水及人与动物的体表和与外界相同的腔道中。
目的:
鉴别细菌、诊断、防治。
生物学特性的了解分为:
形态、结构;生长、繁殖;遗传、变异;衰老、死亡(消毒、灭菌)。
理:
物理——紫外线;化:
化学——抗生素纸片法。
一、实验前准备
(一)实验室规则
1.平衡各实验桌的人数,男女比例,强调下次实验仍然这样坐。
分四大组,定组长。
2.两人小组,配合操作,不能重复,以免浪费。
3.实验结束,组长最后一个离开,显微镜、实验物品、登子复原位;离开。
4.事故处理,赔偿制度。
环境卫生:
废纸,餐巾纸,火柴棍放入废物缸内,不要放入抽屉内或桌上!
5.班长指定四位值日生(桌面地面卫生,玻璃器皿放边台,倒废物缸垃圾,还原实验用品和凳子,检查水电门窗)
6.记笔记。
7.下次须备文具
1一把小尺,测量抑菌圈的直径2钢笔,计数菌落数3每个人备用红蓝铅笔,革兰染色作图
(二)树立无菌观念
1.“有菌观念,无菌操作”。
“细菌无处不在”,所以在医疗实践中要牢固树立有菌观念,降低医源性污染源,学好无菌操作,是每个医务工作者最基本的要求。
医院化验室——致病微生物最多的地方。
2.病原微生物实验室,穿好白大衣√,扣好扣子,因为到处都是细菌(这次实验只有金葡和大肠,而下一次就有伤寒杆菌,要注意)。
进食×,喧哗×。
先脱衣,后洗手。
3.学习无菌操作,做好微生物实验。
实验器材不能随便打开,因为实验物品灭过菌,打开会被空气中杂菌的污染,并影响实验结果。
拿菌种时,不要拿盖子,以免盖子脱落,摔破试管,污染环境。
如果发生菌种打破,菌液撒出,细菌污染情况,须及时报告,以便及时消毒处理。
(三)重要概念讲解
1.培养基:
是由适合细菌生长繁殖的各种营养物质按一定比例配制而成的营养基质,可供细菌生长繁殖(蛋白胨、酵母粉、NaCl、PH7.2~7.6)。
不同用途,基础培养基、营养培养基(最常用的是血琼脂平板)、选择培养基、鉴定培养基、厌氧培养基。
按物理性状分液体,固体,半固体。
2.菌落:
生长在固体培养基上,由单个细菌繁殖形成、肉眼可见的细菌群体。
用于细菌的鉴别、分离、计数。
菌苔
3.菌种:
界门纲目科属种(亚种、型)。
种是细菌分类的基本单位。
性状相近的若干菌种群体构成一个菌属,生物学形状基本相同的细菌群体构成一个菌种。
不同来源的同一菌种称为菌株。
具有某种细菌典型特征的菌株为该菌的代表菌株。
4.接种:
微生物的分离纯化。
指无菌条件下,用接种环或接种针等专用工具,从一个培养皿挑取所需的微生物,转接到另一个培养基中进行培养,从而实现所需微生物的纯化鉴定,获得没有杂菌污染的单纯菌落。
(1)倾注
常见菌液样本+50度高层培养基+摇匀——凝固—培养
(2)划线
常见固体样本+固体培养基+划线接种——培养
1连续划线:
一横,一竖,连续——菌苔2分区划线:
1/10,烧灼,倍比稀释——菌落
(四)实验器材介绍
1.实验平板:
每组共为十一块平板。
(1)六块肉汤琼脂平板。
(LB培养基是一种近年来用于培养基因工程受体菌(大肠杆菌)的常用培养基。
LB一般被解释为Luria-Bertani培养基,然而根据其发明人贝尔塔尼(GiuseppeBertani)的说法,这个名字来源於英语的lysogenybroth,即溶菌肉汤)
紫外线杀菌试验2块
药物敏感试验2块
空气中微生物检查1块
皮肤上微生物检查1块
(2)一块血平板
口腔中微生物的分离
(3)余四块空平板(用报纸包着)
河水中的微生物检查2块
泥土中的微生物检查2块
2.菌种管
3.接种环的使用
(1)接种环由镍丝,铜棒,塑柄三部分组成
(2)以拿毛笔(环亦水平)方法拿取接种环进行实验操作
(3)接种环用之前与用之后都要烧灼
用之前烧灼,防止杂菌进入菌种管
用之后烧灼,防止菌种管中的细菌污染环境
4.其它:
吸管、药片、水样等
二、讲解实验内容(按操作表讲)
(一)紫外线杀菌试验
1.取琼脂平板
2.贴上标签(实验编号、班级、操作者)贴在有琼脂的那块玻璃上,纸片要小。
3.涂布菌种
4.置于接种箱,半开盖子,照射UV约3min(紫外线照射时间视空间大小而定,一般需30min~1h,照射距离30cm~1m)
杀菌机制:
作用于DNA,干扰DNA的复制与转录,导致细菌的变异或死亡。
注意防护。
5.放入培养箱中培养,同前
平板放入培养箱要反过来放置,以免冷凝水滴下影响实验结和减少受空气污染的可能性。
(二)细菌的药物敏感试验
1.取琼脂平板
2.贴上标签
3.涂布菌种
4.粘贴四种抗生素纸片,记录抗生素名称
小镊子,烧灼灭菌,无菌操作。
不要取了干燥用的硅胶。
有字的朝上。
放置四个象限的中间。
5.放入37℃培养箱培养18~24h(翻过来使底朝上)
(三)空气中的微生物检查
1.取琼脂平板
2.贴上标签
3.由组长在实验一开始,就打开盖子,实验结束时收。
4.放入培养箱中培养,同前
(四)皮肤上的微生物检查
1.取琼脂平板
2.贴上八张标签,写上每个人的姓名
3.打开盖子,受试者在自己标签处按食指印
注意要尽可能与培养基接触,但不要弄破培养基。
(可以洗手或不洗、认真或不认真洗手,手指干燥或湿润)
4.放入培养箱中培养,同前
(五)河水、泥土中的微生物检查
1.取灭菌空平板(平板=培养皿=平板)
2.贴上标签
3.用吸管加入1ml河水(或泥水)样品
在吸取河水或泥水之前须轻轻摇均,河水1:
100稀释;泥水取土壤1g经1:
1000稀释。
皆由无菌蒸馏水稀释。
两人配合操作。
同学甲:
吸管和吸球;同学乙:
样品瓶空平板。
4.倒入50℃的的营养琼酯培养基
从沸水浴中取营养琼酯培养基大试管一支,手掌可握时立刻将营养琼酯培养基全部倒入已加过样品的空平板中,轻轻摇匀(示范摇匀速度和幅度)。
放置9~10分钟冷凝。
5.放入培养箱中培养,同前
三、涂布细菌示范
(一)报纸包吸管
(二)实验菌种管的制备
(三)涂布细菌(试管—平板,常用于分离)左手:
试管+平板;右:
接种环+试验盖;酒精灯火焰封口。
(四)玻璃吸管吸河水。
实验二革兰氏染色及生化反应
一生长现象的观察(固体、液体、半固体)
二生化反应的观察一起填表、记录
三实验结果的观察及记录
四革兰染色及作图
五细菌特殊结构观察与作图
一、生长现象的观察P3
固体:
(概念)
菌落:
生长在固体培养基上,由单个细菌繁殖形成、肉眼可见的细菌群体。
用于细菌的鉴别、分离、计数。
菌苔:
细菌在斜面培养基接种线上有母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的细菌群落
空气平板上菌落的观察
液体:
A.混浊生长:
液体均匀混浊,或有少量沉淀。
如大肠杆菌;
B.沉淀生长:
液体清晰,细菌生长在试管底部,形成沉淀。
如链球菌;
C.表面生长:
液体清晰,细菌生长在液面形成菌膜。
如枯草芽胞杆菌(好氧菌)。
半固体:
A.细菌沿着穿刺线生长,与周围界限清楚。
如痢疾杆菌,无鞭毛,动力实验阴性;
B.细菌呈云雾状扩散生长,穿刺线模糊不清。
如伤寒杆菌,具有鞭毛,动力实验阳性。
知识点:
肠杆菌科中,大多为肠道正常菌群。
G-,各菌种无法从形态学上区别。
无芽孢,多数有鞭毛和菌毛,少数有荚膜。
痢疾杆菌和伤寒杆菌正好从形态上可以区分。
而其他则要通过生化反应等鉴定。
肠道杆菌生化反应活泼,其生成的各种酶类对糖和氨基酸等分解能力不同。
(非致病:
大肠杆菌,变形杆菌,//致病:
痢疾杆菌,伤寒杆菌。
。
。
)
二、生化反应的观察
A.糖发酵实验:
蛋白胨水培养基+葡萄糖/乳糖+指示剂溴甲酚紫+倒置的杜氏小管(小倒管)。
(若产酸,即细菌能分解糖类,则培养基由紫变黄;不产酸,则培养基颜色不变。
试管底部倒置的杜氏小管收集气体,用于检测是否产气。
)
例:
大肠杆菌:
对葡萄糖/乳糖都能进行利用,产酸产气。
伤寒杆菌:
能利用葡萄糖,发酵时产酸不产气。
伤寒杆菌:
不能发酵乳糖,不产酸不产气。
知识点:
不同细菌的酶系不同,其分解糖类的能力不同;
一般而言,非致病性肠道杆菌能分解乳糖,产酸产气;而致病性肠道杆菌不能发酵乳糖。
B.吲哚实验:
(组长做)
分解色氨酸产生吲哚(无色),加入吲哚试剂后,产生红色的玫瑰吲哚。
沿管壁缓慢加入吲哚试剂1ml,不要晃动,静置30min。
知识点:
用吲哚试验可区分伤寒杆菌与大肠杆菌。
大肠杆菌加入吲哚试剂后,两液面间出现红色菌的为阳性;而伤寒杆菌则无在两液面之间不出现红色圈,吲哚实验阴性。
C.H2S试验:
分解胱氨酸等含硫氨基酸,产生硫化氢,加入铁盐后,产生黑褐色硫酸亚铁沉淀物。
H2S试验阳性菌的培养呈黑色。
例:
变形杆菌:
H2S试验阳性,可分解胱氨酸,培养18h后有黑色沉淀产生,即硫化亚铁。
时间越长产生的黑色沉淀越多。
大肠杆菌:
H2S试验阴性,培养基不变色,无黑色沉淀产生。
伤寒杆菌:
由于其不同株的特性不同,H2S试验结果有阳性,阴性或弱阳性等不同表现。
三、实验结果的观察及记录
A.空气实验(P5)
记录细菌菌落的数目及菌落种类。
菌落种类不精确地估算一下。
平均菌落数在30~300之间为合适的稀释度。
B.皮肤实验
C.河水/泥水实验结果观察
D.口腔细菌检查(分区划线)
较好:
区域明显,数量逐级减少(葡萄球菌菌落较大,链球菌多为针尖状,能够产生溶血素,形成草绿色不完全溶血环。
腔道内的菌对营养要求较高,所以用血平板,长出来也比较小。
长太大的可能是空气中飘进来的)
E.紫外线照射实验
接种针划破培养基:
菌可以进行生长。
表明紫外线的穿透能力极弱,一层培养基即可以阻挡。
紫外线灯管的玻璃为石英玻璃,紫外线可以穿透。
意义:
紫外线杀菌适用范围:
只适用于空气消毒灭菌或物品表面消毒。
F.药敏实验(单位:
mm)青霉素,红霉素,氯霉素,卡那霉素(在涂有细菌的琼脂平板上,抗菌药物在琼脂内向四周扩散,其浓度呈梯度递减,因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。
抑菌圈越大,说明该菌对此药敏感性越大,反之越小,若无抑菌圈,则说明该菌对此药具有耐药性。
)
知识点:
抑菌圈的大小与划线细菌浓度(厚薄、密度)及划痕、药物敏感性及浓度等有关。
测量时的直径计算平均值。
四、革兰染色及作图(作图:
有代表性的个体与整体的结合,不要把整个视野画满)
样本:
大肠杆菌G-――宜多不宜少;金黄色葡萄球菌G+――宜少不宜多。
革兰氏染色的步骤介绍
载玻片上滴一滴无菌水(用接种环取一滴,火柴头大小即可)
无菌操作挑取菌种。
大肠杆菌宜多不宜少,金葡菌宜少不宜多
1.涂片(半透明,成一薄层)
2.干燥(慢速低温50℃,酒精灯上晃5-10min,彻底干燥)
3.固定(快速高温>100℃,压在酒精灯外焰过3遍,勿焦)
4.染色:
a.结晶紫:
初染1min→水洗(小水流)
b.碘液:
媒染1min→水洗
c.酒精:
脱色
d.石炭酸:
复染1min→水洗
5.再次干燥
6.镜检,作图
原理:
G+菌:
由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高且分子交联度紧密,在乙醇洗脱时,肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩,在加上它基本不含类脂,故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙,因此结晶紫与碘的复合物仍牢牢阻留在其细胞壁内使其呈现紫色。
G-菌:
因其壁薄、肽聚糖含量低和交联度松散,故遇乙醇后肽聚糖网孔不易收缩,加上它的类脂含量高,所以当乙醇把只类溶解后,在细胞壁上就会出现较大的缝隙,这样,结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁,因此,通过乙醇脱色后,细胞又呈无色,这时再经石炭酸等红色染料复染时即呈现红色。
)
五、细菌的特殊结构观察与作图(看示范显微镜)
注意:
班长排值日
物品处理、归位,革兰氏染色片子扔进垃圾桶
实验三:
免疫学与微生物各论
1ELISA实验
2肠道杆菌的检验流程
3玻片凝集实验
4细菌的形态观察
一ELISA实验(4个同学一小组,讲一步做一步)
原理:
酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物的高效催化作用结合起来,根据底物被酶催化后显色的深浅及其吸光度值的大小进行定性或定量分析的一种固相免疫测定技术。
特点是灵敏度高,特异性强,操作简便迅速,酶标抗体制备容易,保存期长,对仪器要求简单,成本低,适用于大规模普查。
——双抗夹心法
操作:
甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体酶联免疫试剂盒。
半定量检测
怎么用移液器,1看刻度2装枪头,要节省3两档移液用法
1发6孔的包被管,放入小试管架内
2包被管分别加试剂(抗原)各100ul:
100ulNS,20AFP,400AFP,病人血清1号,2号,3号(加样关键:
1吸液:
讲台上坐着加,混匀,吸液时用眼观察,近液面下,并去掉多余的,要节约标准品,2加样:
与包被管侧面接触,勿产生气泡)——震荡混匀(两手指间)——标签纸,37°培养30min(可更长)(讲肠道杆菌检验流程,做玻片凝集试验)
4弃液体。
每孔加绿色洗涤液2滴,轻摇15s下弃之。
各孔中温和地加满洗涤液(非加压直冲),轻摇后,5s弃之。
方向来回重复5遍。
拍干。
5加红色酶结合物各2滴,轻轻摇晃后,放置15min。
6重复步骤4——弃液,洗涤,拍干。
7包被管每孔各加白色管底物1滴,黑色显色剂1滴,两指尖震荡,充分摇匀。
关键:
(1)何时加终止液:
视第3孔颜色深,而第2孔颜色有点变化之时,约1分半~3min,加黄色管(终止液)50ul终止反应,充分摇匀。
如何开黄色小盖。
(2)终止反应后,去除气泡及底板水汽再测。
8酶标板450nm测定OD值。
(开机——调0——放板对准——按钮测量,记录)
加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。
结果:
1
2
3
4
5
6
AFP
0
20
400
自己粗略换算
OD
0.04
0.21
1.52
0.18
0.9
1.82
结论:
11号样品为阴性,2号弱阳性,3号强阳性
2AFP是原发性肝细胞肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志;
AFP是人体在胚胎时期血液中含有的一种特殊蛋白,系肝细胞合成,胎儿出生后,血清AFP浓度下降,几个月至1年内降至正常,正常成人肝细胞失去合成AFP的能力,因此血清中含量极微(一般<20μg/L),
肿瘤:
肝细胞癌可显著升高外(90%),胚胎癌如睾丸癌、卵巢癌和极少数胃、胰、胆管、结肠直肠癌也可升高,但其绝对值不如肝细胞癌高。
良性:
妊娠、慢性肝炎、肝硬化(20%~40%)可有AFP的分子变异体,亦可有一过性升高。
因此血清AFP检测结果必须结合临床症状与超声检查才有诊断意义。
二肠道杆菌的检验流程
1粪便中的肠道杆菌的分离鉴定程序
分离粪便甲肠道杆菌常采用选择鉴别培养基(如SS琼脂平板,SS琼脂平板是一种选择性培养基,对大肠杆菌有较强的抑制作用,对肠道病原性杆菌无抑制作用或抑制作用很弱):
粪便——SS琼脂平板——挑取可疑菌落——双糖铁培养基——系列生化反应——分析结果——用相应诊断学做玻片凝集反应
SS培养基分区划线——纯种
形态与染色——类
生化反应——种(生物学形状基本相同的细菌群体构成一个菌种)
血清学实验——型别
2SS琼脂平板:
营养物质,柠檬酸钠和煌绿(对大肠杆菌的生长有抑制作用,加上胆盐合用时加强抑制作用),胆盐(对伤寒杆菌,痢疾杆菌的生长有促进作用),乳糖,指示剂中性红(酸红碱淡黄;红,多为非致病性肠道杆菌,非红菌落如白或淡黄,多为致病性)。
还加有铁盐,相当于H2S实验。
大肠杆菌
伤寒杆菌
变形杆菌
SS琼脂平板
中等大小的红色菌落
白色或微黄色透明菌落(可产生FeS也可不产生,白色中有小黑点或无)
肯定产生FeS,白色中有黑点
3双糖含铁培养基,是一个高层斜面培养基。
基础营养成分是蛋白胨水,加入1%的乳糖、0.1%的葡萄糖及硫酸亚铁制备的固体斜面培养基,以酚红做指示剂,碱时呈红色,酸时黄色。
(乳糖:
葡萄糖=10:
1)上层代表乳糖发酵情况,而下层则代表葡萄糖发酵情况,厌氧,生长缓慢,观察细菌的动力。
接种时用接种针挑取细菌,先由培养基的中央向下垂直穿刺到接近管底,然后沿原线退出,再划线于斜面上,37度18~24h后观察结果。
大肠杆菌
伤寒杆菌
变形杆菌
双糖
培养基
斜面(乳糖)
培养基黄色,上面有气泡(产酸产气)
红色(不产酸不产气)
红色(不产酸不产气)
底层(葡萄糖)
黄色,产生气泡(产酸产气)
黄色,略带黑色(产酸不产气)
黑色,气泡较多(产酸产气)
H2S
—
+
+
三玻片直接凝集实验
1要小心感染伤寒杆菌(消化道传播);死亡率高(WHO:
在亚洲和非洲的一些发达国家,年发病率高达1%,死亡率为2%。
);氯霉素有效,但易产生耐药性
2原理:
细菌、细胞等颗粒性抗原,在适量电解质存在的条件下,可直接与相应抗体结合,出现肉眼可见的凝集现象称为直接凝集反应。
玻片直接凝集试验是一种定性试验。
也常用于红细胞ABO血型的鉴定。
2操作:
两个人一张玻片。
在讲台上面加。
先加NS15ul,后加两个Ab各15ul,共用一个枪头。
然后如G染色步骤一样,无菌操作取菌,涂菌(半透明薄层,可透过看到报纸上的字为好)。
慢慢摇晃2~3min,中间的伤寒+Ab的出现明显可见的凝集块,液体变为透明,即为凝集反应阳性,而其余对照滴仍均匀混浊。
注意如环境温度过低,则可将玻片背面与手背轻轻摩擦,以提高反应温度,促进结果出现。
(不要让液体干掉)
抗血清
生理盐水15ul
伤寒杆菌抗血清
伤寒杆菌抗血清
细菌
伤寒杆菌
伤寒杆菌(凝集)
大肠杆菌
四细菌的形态观察(自己观察)
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