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病毒分离鉴定技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。
其特征为发病母猪厌食、发热,怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎,幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。
1987年在美国中西部首先发现该病,并分离到病毒,其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。
目前该病已在全球范围内传播、蔓延。
我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。
国内诸多血清学检测结果表明,该病在我国许多地方已有流行[5]。
河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病,用间接ELISA法检测,呈PRRS抗体阳性。
从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV,并对其进行了一系列的鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。
1.1.2 细胞及血清 细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所;阳性血清购自中国兽药监察所;阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清,经中和试验证明为阴性。
1.1.3 主要试剂及试剂盒 RNasin、dNTP、反转录
Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司;琼脂糖为
Sigma公司产品;其他常规试剂均为分析纯;UNIQ10柱式Trizol总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4 RTPCR引物设计 根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列,参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物,引物扩增片段长度为720bp;上游引物P15′CTGGAGCCGTGCTATCAT3′;下游引物P25′TCCATT
TCATGACACCTG3′。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 生长液为含100mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液;维持液为含20mL/LNCS的RPMIl640培养液。
Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37℃培养至单层后传代培养。
1.2.2 病料的处理 无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎,用Hanks液研磨并制成5倍~10倍的乳悬液,反复冻融3次后,经5000r/min离心30min,上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后,-20℃保存备用。
1.2.3 病毒的分离 将上述处理的病料悬液1mL分别接种于长成单层的
Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞,37℃吸附1h,补加维持液至8mL,继续培养3d~5d,反复冻融3次,收获培养上清液,同时设参考毒株、正常细胞作为对照。
出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代,供进一步检测备用,连传5代未出现CPE者判为阴性。
1.2.4 分离毒的毒价滴定(TCID50) 采用微量法按参照文献[7]进行,测定其在Marc145上的 TCID50,结果按ReedMuench氏法计算。
1.2.5 病毒中和试验 采用固定病毒稀释血清法,按参照文献[7]进行,并按ReedMuench氏法计算中和指数。
1.2.6 分离毒的动物回归试验 将107.5TCID50/mLHN株病毒细胞培养液经口鼻途径接种30日龄健康猪2头,3.0mL/头,并设1头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照,隔离饲养,每日测体温,并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现,1周左右剖检观察其病变。
然后分别采集接种猪和阴性猪的肺脏、淋巴结等组织,用作PCR检测。
1.2.7 RTPCR鉴定
1.2.7.1 病毒基因组总RNA的提取 按总RNA抽提纯化试剂盒说明提取。
1.2.7.2 反转录(RT) 0.8μLMgCl2(25mmol/L)、4.0μL反转录buffer(5×)、2μL:
dNTP(10mmol/L)、1.0μLP1(25pmol/L)、1.0μLP2 (25pmol/L)、1.0μLRNasin(40U/μL)、9.2μL总RNA,然后置于PCR仪上65℃
15min后,加入MMLV(5U/μL) 1.0μL,最后于42℃1h,95℃5min结束反应。
1.2.7.3 PCR反应 1.4μLMgCl2(25mmol/L)、4.0μLbuffer(10×)、0.6μLrTaq酶(5U/μL)、10μL模板cDNA,置于PCR仪中扩增。
反应参数为:
95℃5min;94℃
1min,55℃ 30s,72℃1min,共进行35个循环;最后72℃10min。
结束后将PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 病毒分离
将过滤后的病料悬液接种于Marc145细胞,盲传前3代未出现CPE,至第4代后开始出现规律性CPE,在24h~36h出现约70%的CPE。
病变特征为细胞折光性增强、变圆、膨大,部分细胞紧缩呈索状随后皱缩、脱落、形成大片空洞,与 PRRSV典型CPE相符。
此毒株接种Vero细胞和PK15细胞不出现CPE,判为阴性(图1)。
2.2 PRRSV分离株TCID50测定结果
按ReedMuench法计算距离比得出TCID50结果为106.50/0.1mL,即PRRSV分离株在Marc145细胞上的增殖毒价为107.5TCID50/mL。
2.3 中和试验结果
按ReedMuench法计算可知,PRRSV标准阳性血清对分离病毒株的中和效价为1∶24,即1∶24稀释的阳性血清可保护50%Marc145细胞不产生CPE。
中和试验结果表明,PRRSV标准阳性血清能抑制该分离毒在Marc145细胞上增殖,此分离病毒是PRRSV。
2.4 动物回归试验结果
将病毒细胞培养液经口鼻接种30日龄健康仔猪后2d左右,仔猪开始出现体温升高,并出现轻度的呼吸困难、四肢末梢供氧不足、耳尖发紫等症状。
1周左右将接种猪剖检未见明显的病理变化,仅见肺部边缘有少量的出血点,有时可观察到间质性肺炎。
而对照猪则无异常变化。
2.5 RTPCR扩增和鉴定结果
从分离的PRRSV分离株细胞培养物以及攻毒仔猪后所采取的肺脏、淋巴结等组织进行总RNA的提取,并用设计的针对PRRSV美洲株ORF5所设计的引物进行RTPCR反应,产物经琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,前两种材料均可扩增出720bp大小的条带,与预期结果相符(图2)。
1.DNA标准DL2000;2.病料上清悬液RTPCR产物;3.接种猪组织悬液RTPCR产物;4.对照猪组织悬液RTPCR产物(阴性对照)
3 讨论
PRRS是1987年发现的一种新的猪病猪病毒病。
临床上病猪表现精神沉郁、发热、厌食及呼吸困难。
母猪流产、死胎、不孕、假孕及产出弱仔,公猪性功能下降。
目前PRRS已呈世界性分布,在我国也广泛存在。
从1996年初,我国郭宝清等首次从国内疑似PRRSV感染猪群检出PRRSV抗体并分离出PRRSV起,PRRS在我国的流行范围越来越广,血清阳性率也呈上升趋势,在我国的许多省、市(地区)已经分离到很多地方株。
PRRSV为动脉炎病毒科病毒,其有着严格的宿主范围,在常见的原代和传代细胞中不能生长,在体外培养中,能在猪原代肺泡巨噬细胞、CL2621、MA104系的克隆株
Marc145生长增殖。
本试验将处理后的病料悬液接种在Marc145上连续传代后即出现明显的细胞病变,而将其接种在Vero、PK15细胞则连续传5代都不出现CPE,与有关文献报道相一致。
目前,PCR方法已被广泛应用于PRRS临床样品的检测,检测的目标通常是针对PRRSV基因组ORF7、ORF6或ORF1b。
已报道这种方法可以直接检测PRRSV感染的病猪血清、精子、流产胎儿的病理组织及感染的肺泡巨噬细胞等。
本试验根据PRRSV美洲株ORF5基因设计的一段引物,通过PCR反应能特异性扩增出PRRSVHN株的ORF5基因片段,且证明建立的RTPCR方法完全可以检测病料中的PRRSV。
本试验从河南某猪场疑似PRRS发病仔猪的肺脏及淋巴结组织中分离到1株病毒,并进行了
分离和鉴定。
根据分离病毒株致Marc145的特征性病变、动物回归试验、毒价滴定、中和试验以及RTPCR反应,初步判断所分离的病毒为 PRRSV。
但有关该毒株的其他一些生物学特性尚待进一步鉴定。
2006年夏季,我国南方数省暴发的猪“高热病”,给养猪业带来巨大损失,安徽省也未能幸免。
现有的研究结果表明猪“高热病”为多病原混合感染及继发感染引起的,其中猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevims,PRRSV)是主要病原。
安徽农业大学动物传染病实验室进行的流行病学调查结果也证实PRRSV为安徽猪“高热病”的主要病原之一。
在此基础上,本试验对临床疑似PRRS的病例进行病毒分离鉴定,旨在为了解安徽地区流行的PRRS毒株的生物学特性,并进一步研制相应疫苗奠定基础。
1材料与方法
1.1病料
采自安徽省部分疑似发生PRRS猪场发病仔猪的肺脏、脾、肾、淋巴结等组织。
1.2毒株、细胞及血清
PRRSVVR-2332参考毒株、Marc-145细胞由浙江农科院惠赠;抗PRRSV猪阳性血清、阴性血清由江苏农科院惠赠;FITC羊抗猪IgG,购自北京博奥生生物技术有限公司。
1.3主要试剂及试剂盒
PRRSRT.PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;琼脂糖为Sigma公司产品;PRRS抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司;DMEM培养基购自GIBC0公司;犊牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司;其他常规试剂均为分析纯。
1.4细胞培养
生长液为含有8%胎牛血清(NCS)、青霉素l00U/mL、链霉素l00仙g/mL的DMEM培养液;维持液为含2%NCS,青、链霉素各100U/mL的DMEM培养液。
Marc-145置于5%的C02培养箱中37℃培养至单层后传代培养。
1.5病料的处理
无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎,用不含血清的DMEM液研磨制成5—10倍的乳悬液,反复冻融3次后,经l0000r/min离心20min,上清悬液用0.22斗m微孔滤膜过滤除菌,-20℃保存备用。
1.6病毒的分离
取1mL上述处理的病料上清液接种长成单层的Marc-145细胞,37℃吸附1h后倒弃接种液,补加维持液3.5mL,继续培养3~5d,将培养物反复冻融3次,冻融液5000r/min离心l5min,取上清液1mL盲传。
待出现典型细胞病变(CPE)时收获病毒培养物。
在液氮中保存待用;连传8代未出现CPE且PCR检测为阴性者判为阴性。
1.7病毒形态观察
将分离病毒的第15代细胞培养物冻融3次,经4℃5000r/min离心30min收获上清,再经35000r/min超速离心2h浓缩病毒,用PBS悬浮病毒,吸取少量悬液加2%的磷钨酸负染1min,经透射电镜观察病毒形态。
1.8半数细胞感染量的测定(TCID50)
将分离病毒作l0-1~l0-8系列稀释,分别接种于单层的Marc-145细胞96孔培养板,每个稀释度8孔,同时设不接病毒的正常细胞对照,置于5%的C02培养箱中37℃培养,连续观察记录细胞病变7d,结果按Reed—Muench法计算。
1.9 间接免疫荧光试验
将Marc-145细胞接种25mL细胞培养瓶中,待细胞长成单层后,接种分离病毒,72h后弃掉培养液,用含有0.01%胰酶的EDTA消化后,用PBS离心洗涤,然后在载玻片上涂片。
干燥后用4℃冷丙酮固定20min,滴加美洲型标准株PRRSVVR-2332阳性血清,置湿盒37℃作用1h,经PBS洗涤后再滴加1:
100稀释的FITC.羊抗猪IgG,置湿盒于37℃作用lh,经PBS洗涤3次,晾干后用甘油PBS封片,置荧光显微镜观察结果。
同时设阴性血清、正常细胞作为对照。
1.10动物回归试验
将病毒分离第l5代Marc-145细胞培养物经口鼻途径接种40日龄PRRSV抗体检测阴性健康猪2头,5.0mL/头,并设2头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照,隔离饲养,每日测体温,并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现。
每隔3d,分别采集接种猪和对照猪的血样作RT.PCR检测。
1.11RT-PCR鉴定
按猪繁殖与呼吸综合征试剂盒说明,提取分离病毒细胞培养物的总RNA,反转录反应条件为:
42℃1h,98℃5min,冰浴5min;PCR反应条件为:
94℃预变性5min;55℃30S,55℃30S,72℃30S,共进行35个循环;最后72℃10min。
取7μLPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1病毒分离
将过滤后的病料悬液分别接种于Marc-145细胞,盲传前3代未出现CPE,至第4代开始出现CPE,病变特征为细胞折光性增强、变圆、膨大,部分细胞紧缩呈葡萄串状,随后皱缩,继而灶性脱落,出现大片空洞,与PRRSV典型CPE相符。
2.2电镜观察
将病毒超离产物经负染透视电镜观察,可见典型的以球形或卵圆型为主的具囊膜的病毒粒子,直径大小为50~80nm,核心直径为20~40nm。
2.3分离病毒的TCID50测定
按ReedMuench法计算得出分离病毒在Marc-145细胞上的TCID50为l0-4.7/0.1mL。
2.4 间接免疫荧光试验
用PRRSVVR-2332抗体阳性血清进行间接荧光抗体染色,检测结果发现感染细胞的胞浆内出现黄绿色特异性荧光,而对照组的Marc-145细胞均未见到荧光。
2.5动物回归试验
接毒组的仔猪在接毒2—3d后,仔猪体温升高至41℃以上,持续高热9~15d。
发病初期临床表现为食欲不振、精神沉郁、呼吸困难、皮肤发红,后期表现为消瘦、四肢无力、喜卧、耳尖发紫等症状。
接毒后l5d病情严重的1头猪死亡,剖检可见腹股沟、肠系膜淋巴结肿大,肺肉样病变,脾脏梗死,表面有点状红色丘疹;另外1头逐渐耐过康复。
试验组血清PRRSRT-PCR检测试剂盒检测结果为阳性;对照组2头猪无任何症状,血清试剂盒检测结果为阴性。
2.6RT-PCR鉴定
对发病猪的组织病料、分离株细胞培养物、攻毒发病仔猪组织病料进行PRRSV的RT—PCR检测,产物经琼脂糖凝胶电泳检测,均可扩增出约400bp大小的条带,与阳性对照相符(图3);阴性对照未见条带。
3讨论
本试验从安徽省部分猪场疑似PRRS发病仔猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织中分离到l株病毒,并进行了一系列鉴定。
根据分离毒株致Marc-145的特征性病变、电镜观察、间接免疫荧光试验、动物回归试验、RT.PCR的结果,判定所分离的病毒为PRRSV,命名为PRRSV-SCH07。
PRRSV的生长要求较高,在常用的PK-15、Ve-ro、BHK细胞中不能生长。
最初分离PRRSV常用猪肺巨噬细胞(PAM),PAM细胞对大多数PRRSV毒株都适应,但其制备的技术难度较大。
目前国内分离PRRSV常使用Marc-145细胞和由克隆出的HS.2H细胞。
本试验用Marc-145细胞培养分离到PRRSV,病变出现的时间、代次和特征与相关报道基本一致。
本试验动物回归试验表明:
该毒株能引起猪严重的临床症状和发生典型的病理变化。
说明该毒株毒力较强,且复制出与南方“猪高热病”极为相似的症状,为我省“猪高热病”的病因的确定提供可靠依据,也为我省PRRS病原学的研究、地方型PRRS疫苗的研发奠定基础。
PRRS有2种基因型,即美洲型和欧洲型。
目前,在美洲、欧洲等国家相继出现了2种同时流行的新特点,美洲型不同的分离株病毒出现了明显的基因变异或缺失。
我们对本次分离株Nsp2基因高变区进行扩增测序,结果表明所分离的病毒为美洲型PRRSV变异株,其Nsp2基因存在2个位点不连续的90个氨基酸的缺失,与国内分离毒株JXAl、HEBl、HUBl、HB-1(sh)、HUN4等的序列同源性为79.8%-98.7%,而与美洲型标准株VR-2332的同源性仅为为69.4%-70.4%(另文待发表)。
说明我省PRRSV流行毒株的基因序列已发生明显变异,有关该毒株的其他一些生物学特性和遗传变异情况尚待进一步鉴定。
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