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活化蛋白
活化蛋白
【摘要】探讨膳食牛磺酸防护视网膜光化学损伤的分子机制。
方法30只Sprague-Dawley大鼠饲以AIN-93标准饲料或补充4%牛磺酸膳食干预15d,给予lux的持续光照24h,形态测量法观察视网膜外核层厚度,电生理法检测视网膜功能,Westernblot或免疫组织化学法检测活化蛋白-1亚单位c-fos/c-jun蛋白表达,荧光定量PCR法检测其mRNA表达。
结果光照能降低视网膜外核层厚度,降低视网膜电图a波和b波的幅度,升高AP-1蛋白和mRNA的表达,4%膳食牛磺酸在转录和翻译水平下调AP-1的表达,有效防护视网膜光化学损伤。
结论转录因子AP-1在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中发挥着重要作用。
【关键词】活化蛋白-1牛磺酸视网膜光损伤
Abstract:
ObjectiveToinvestigatetheunderlyingmolecularmechanisminvolvingindietarytaurineprotectingretinafromphotochemical ThirtySprague-Dawleyratsfedwithorwithout4%taurineunderAIN-93dietfor15dwerepersistentlyexposedtofluorescentlight(3000±200lux)for thicknessofouternuclearlayer(ONL)ofretinaswasmeasuredwith retinalfunctionwasdetectedwithelectrophysiological expressionofactorprotein-1(AP-1)subunitsc-fos/c-junproteinwasanalyzedwithWesternblotorimmunohistochemicalmethod,andtheirmRNAexpressiondeterminedwithquantitativereal-timePCR(qRT-PCR).ResultsTherewasadecreaseinthicknessofONL,andinamplitudeofa-andb-wavesofelectroretinogram,anincreaseinproteinandmRNAexpressionofc-fos/c-junsubunitsinretinasofratsexposedto%dietarytaurineeffectivelypreventedretinalphotochemicaldamageaschangesofmorphologyandelectroretinogram(ERG).Also,thesupplementationcausedadown-regulationinexpressionofc-fos/c-jun TranscriptionfactorAP-1playsapivotalroleindietarytaurineprotectingretinafromphotochemicaldamage.
Keywords:
actorprotein-1;taurine;retina;lightdamage
视网膜光化学损伤是视网膜光损伤最主要的一种形式,其早期病理表现为视网膜功能减退,视网膜内外节段排列紊乱甚至断裂消失,感光细胞变性丢失,外核层厚度变薄,后期病理表现为视网膜感光细胞凋亡性坏死,视觉功能严重受损甚至失明[1]。
针对视网膜光化学损伤的各致伤环节,现已发现钙通道阻滞剂、地塞米松、天然抗氧化剂、自由基清除剂,以及神经营养因子等对光化学损伤有一定的保护作用,然而这种防护作用的效果并不理想[2]。
牛磺酸是体内一种游离的条件必需氨基酸,在视网膜尤其是感光细胞和Muller细胞内含量极为丰富,在视网膜生长发育、维持正常视功能等方面发挥着重要的作用。
作者以往研究发现牛磺酸作为强抗氧化剂,能降低视网膜光损伤中的丙二醛含量,同时升高超氧化物歧化酶、谷胱苷肽还原酶的活性,阻止视网膜感光细胞的凋亡,但这种抗凋亡效应的分子机制还不清楚[3,4],有研究显示视网膜光损伤中转录因子AP-1的表达上调[5]。
本研究以Sprague-Dawley大鼠光化学损伤为实验模型,观察AP-1亚单位c-fos/c-jun在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中的表达变化,以探讨牛磺酸防护视网膜光化学损伤的具体分子机制。
1材料和方法
主要试剂和仪器
牛磺酸购于北京世纪维他生物技术有限公司;GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司;兔抗大鼠c-fos、c-jun单克隆抗体、SP试剂盒羊抗兔IgG(SP9001)、DAB试剂盒购于中杉生物制品有限公司;SYD-I型多功能光照控制箱和SYD-Ⅱ型暗适应箱:
本研究组与西南师范大学物理学院联合研制;光学显微镜:
OlympusBX51型,日本;视觉电生理刺激仪:
AVES-8000型,国产;电转移装置:
Bio-rad公司,美国;核酸蛋白检测仪:
Eppendorf公司,美国凝胶成像系统:
DC290,美国。
动物及分组
30只清洁级Spregue-Dawley大鼠由第三军医大学第三附属医院动物中心提供,体重g,雌雄不拘。
随机分为以下三组,每组10只:
①正常对照组饲以AIN-93标准饲料;②光照组饲以AIN-93标准饲料,lux持续光照24h;③牛磺酸组AIN-93标准饲料中添加4%牛磺酸15d后,lux持续光照24h。
实验动物经处理后,检测视网膜电图,乙醚麻醉断头处死,一只眼用于测量外核层厚度,另一只眼用于检测AP-1亚单位c-fos/c-jun蛋白或mRNA表达。
视网膜形态学观察
参照文献[6]。
去除眼球外周结缔组织,在眼球三点钟位置留下少量结缔组织并保留视神经以标记眼球方位。
10%的中性甲醛固定,常规石蜡包埋,经视神经矢状纵切眼球,作5μm厚切片,选取视神经乳头旁颞侧组织行苏木精-伊红染色后,光镜下观察视网膜各层结构变化,并采用Bio-Rad图像分析系统测定各组视网膜外核层厚度。
视网膜电图检测
大鼠经暗适应24h后,AVES-8000型视觉电生理刺激仪记录暗适应视网膜电图。
甲基纤维素角膜表面麻醉,速眠新注射液腹腔内注射麻醉,托吡胩胺散瞳20min.记录电极为环形金电极,置于大鼠眼角膜缘;参考电极和接地电极为不锈钢针,分别置于记录眼同侧内眦部以及额正中皮下。
采用单次闪光刺激,刺激光强为cd·s·m-2,叠加5次,每次间隔2min,通频带为1~300Hz,记录ERG的a波、b波振幅以及潜伏时间。
免疫组织化学法检测c-fos蛋白表达
按照免疫组化染色试剂盒说明书进行。
石蜡切片梯度酒精脱蜡水化,3%H2O2孵育5~10min,蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min,mol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原20min,正常血清封闭液10min,兔抗大鼠c-fos单克隆抗体以1∶100稀释,37℃2h,PBS漂洗3min×3,生物素标记二抗工作液,37℃10min,PBS漂洗3min×3,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃10min,PBS漂洗3min×3,最后3,3’二氨基联苯胺显色5~10min,封片并照相。
Westernblot检测c-jun蛋白表达
按照蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。
常规方法提取视网膜总蛋白,经Lowry法定量后,取40μg总蛋白进行凝胶电泳并转移至聚偏
(二)氟乙烯膜上,1%牛血清白蛋白封闭,1∶400c-jun单抗4℃过夜,1∶40生物素化二抗工作液室温振摇1h,1∶40稀释辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素三抗工作液室温振摇1h,DAB显色,Bio-Rad图像分析系统扫描各条带的灰度值。
荧光定量PCR法检测c-fos/c-junmRNA表达采用TRIZol试剂盒提取各组视网膜总RNA,取4μlRNA模板做逆转录成cDNA。
PrimerExpresssoftware (PEBiosystems)软件设计c-fos/c-jun寡核苷酸引物和TaqMan探针。
内参β-actin:
正义链5‘-GCGCGGCTACAGCTTCA-3‘,反义链5‘-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3‘,探针序列5‘-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3‘;c-fos:
正义链5‘-GGAGGTCTGCCTGAGGCTTC-3‘,反义链5‘-CACGTTGCTGATGCTCTTGAC-3‘,探针序列5‘-FAM-CAACGACCCTGAGCCCAAGCCAT-TAMRA-3‘;c-jun:
正义链5‘-GACGGACCGTTCTATGACTGC-3‘,反义链5‘-GGAGGAACGAGGCGTTGA-3‘,探针序列5‘-FAM-TGGAAACGACCTTCTACGACGATGCC-TAMRA-3‘。
所有引物由上海生工公司合成。
利用ABIPrism7000TaqMan实时荧光热循环仪(PerkinElmerLifeSciences)检测c-fos/c-jun的mRNA表达量。
热循环参数:
93℃2min,93℃1min,55℃1min,70℃30s,40个循环。
c-fos/c-junmRNA的相对表达量为与β-actin的拷贝数之比。
统计分析
所有数据用Stat-Light软件进行统计学处理,结果用±s表示。
三组间视网膜电图和ONL厚度先用单因素方差分析检验其差异性,然后采用Ryan‘s法进行多组间比较。
光照组和牛磺酸处理组间c-fos/c-junmRNA和蛋白的表达量用Student‘st检验。
所有显着性水平设定为P<
2结果
外核层厚度
对照组、光照组和牛磺酸组视网膜外核层的平均厚度分别为,和μm.光照导致视网膜厚度在对照组减少了%,在牛磺酸组减少了%,且视网膜厚度在牛磺酸组与光照组间有显着性差异,而牛磺酸组与对照组相比无显着差异。
视网膜功能
视网膜经光照后,a波和b波的波型不典型,波幅降低,甚至熄灭,潜伏期延长。
而牛磺酸干预组具有典型的a波和b波,与光照组相比,a波、b波幅值增加,潜伏期减少;与对照组相比,除a波幅值降低外,其它指标无显着性差异。
表1膳食牛磺酸改善光照视网膜功能
c-fos表达
免疫组化结果显示,对照组视网膜c-fos抗体染色在内核层有散在阳性细胞分布,ONL偶见阳性细胞;光照组INL中阳性细胞染色加深,而ONL中阳性细胞在光照早期随光照时间增多,后期未观察到阳性细胞;牛磺酸组光照后INL阳性细胞也增多,而ONL阳性细胞较少。
qRT-PCR结果显示,c-fosmRNA的表达在对照组较低,在光照1h呈应激性增高,牛磺酸组在光照1hc-fosmRNA表达也显着低于光照组,该结果与免疫组化结果相符,提示牛磺酸能在转录和翻译水平下调c-fos表达。
c-jun表达
Westernblot结果显示,光照组视网膜c-Jun蛋白表达,与对照组相比,6h开始增高,9h达到高峰,其后表达量仍然维持较高水平,牛磺酸组c-Jun蛋白表达在9、12、24h蛋白表达相对量低于对照组;且在整个光照期间都低于光照组(P<)。
视网膜c-junmRNA表达在光照3h开始增高,6h达到高峰,12h仍然有较高表达,而在牛磺酸组光照6h后显着低于光照组的相应时相点。
3讨论
作者前阶段研究证实,膳食补充牛磺酸能通过其抗氧化作用而有效防护视网膜的光化学损伤[3,4]。
本研究发现,牛磺酸能阻止光照过程中视网膜外核层厚度的降低,改善视网膜电图,提示通过膳食干预的途径,添加牛磺酸能保护光感受细胞的丢失或溃变,从而维护视网膜功能的完整性。
这些结果进一步证实牛磺酸在视网膜发育、以及维持视网膜功能和结构的完整性方面发挥着重要作用[7]。
视网膜光照后,感光细胞丢失原因存在一定的争议。
作者以前研究以及其他诸多研究者均证实,凋亡是光化学损伤以及其他视网膜变性疾病光感受图3牛磺酸降低光照诱导c-jun表达器细胞丢失的主要机制[4,8]。
近年研究发现,转录因子AP-1亚单位c-fos/c-jun是参与光化学应激诱导感光细胞凋亡的重要调控因子。
AP-1通过调节靶基因转录参与机体内病生过程,脂多糖、氧化应激、紫外线等均能诱导其活性增加[9]。
c-fos基因敲出大鼠经光照后,视网膜光感受器细胞几乎未丢失,而野生型大鼠、小鼠和661W光感受器细胞在光照后其c-fos表达也呈现应急性增高,这些研究结果显示c-fos在光诱导光感受器细胞凋亡中有促凋亡作用[10]。
但AP-1的表达在牛磺酸防护视网膜光损伤中是否发生改变,尚未得到实验证实。
本研究发现光照可引起视网膜c-fos/c-junmRNA和蛋白的表达上调,膳食牛磺酸可在转录和翻译水平下调c-fos/c-jun表达。
基于上述结果,我们进一步推论出牛磺酸可减少AP-1复合物的形成,阻断了光照诱导的光感受细胞的凋亡信号途径,但其中涉及的分子机制仍需进一步阐明。
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