生物荧光成像突破光学衍射极限汇总.docx
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生物荧光成像突破光学衍射极限汇总
第35卷第9期
2008年9月中国激光V01.35,No.9September,2008CHINESEJOURNAL0FLASERS
文章编号:
0258—7025(2008)09—1283—25
超分辨远场生物荧光成像
突破光学衍射极限
毛峥乐王琛程亚
(中国科学院卜海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室,上海201800)
摘要长期以来。
远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤,可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测j=具。
但由于衍射极限的存在,使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230am和i000nm。
为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征,提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求,在远场荧光显微镜的基础上,科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨牢极限的成像技术。
例如,采用横向结构光照明提高横向分辨率到约100nm.利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高5~10倍。
然而,直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后。
衍射极限才被真正突破。
如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了30~50nm的三维分辨率。
另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限,甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级。
关键词光学;超分辨;远场光学荧光显微镜;生命科学;非线性效应;单分子
中图分类号TH742.65文献标识码Adoi:
10.3788/CJL20083509.1283
SuperresolutionFar-FieldFluorescence
Bio-lmaging:
BreakingtheDiffractionBarrier
Mao
FineZhengleWangChenChengYa(StateKeyLaboratoryofHighFieldLaserPhysics,ShanghaiInstituteofOpticsandMechanics,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201800,China)
Abstract
owingtOFar-fieldopticalfluorescencemicrocopyhasbecomeitsuniquecapabilitytOanessentialtoolinlifescienceforalongtimelargelynoninvasive,three-dimensional(3D)imaginginsidecells.However,resolutionofatraditionalwide-fieldopticalmicroscopyiSlimitedtOabout230nmlaterallyand1000amaxially。
dueprovidetOthediffraction—limitoflight.Resolutionimprovementisurgentlydemandedbecausemolecule-scaledynamicsand
arestructurestOberevealedinsidelivingcellsin
tOtoday’Slifescience.Sofar。
manyscientistshaveproposedasignificantamountofnovelmethodsinorderenhanceresolutionoffar-fieldopticalimaging.Forexample,lateral
resolutionofapproximately100nmhasbeenachievedbyuseofstructuredillumination.whereastheaxialresolutionhasbeenenhanced5~10一foldusingastandingwaveproducedbytwobeamspropagatinginoppositedirections.Nevertheless.diffractionbarrierwas
opticalfluorescencemicroscopy.As
depletionmicroscopyhasresultedinnotbrokenintheseusecasesuntilnonlinearopticaleffectswereintroducedintoanexample。
theofanonlinearopticaleffect,namely。
simulatedemissioncana3Dresolutionof
on30~50nm.Furthermore.thebarrierofdiffraction-limitresonancealsobebrokenbynoveltechnologiesbased
offluorophores,bvwhichmolecules
Keywordscanfluorescenceenergytransferandhigh-accuracylocalizationbepositionedwithflresolutionofseveralnanometers.microscopy;nonlinearopticaleffects;singleoptics;superres01ution;far-filedopticalfluorescence
molecule
收稿日期:
2008—03—07;收到修改稿日期:
2008—06—04
作者简介:
毛峥乐(1982一),男,上海人,硕士研究生,主要从事生物荧光成像方面的研究。
导师简介:
程亚(1971一),男,上海人,研究员,博士生导师,长期从事飞秒激光与物质相互作用、飞秒三维生物成像及飞秒三维微加工研究。
E—mail:
ycheng一45277@hotmail.com(通信作者)
万方数据
国激光
3j卷
1
1.1
引言
如}冬l1所示T,许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内,研究这些微,卜物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。
反过来,超分辨显微术的发展也推动r整个生命科学的进步。
生命科学与光学显微镜
毫无疑问。
纳米技术与牛物技术是21世纪发展
最迅速和热门的科学领域。
纳米技术应用广泛,包括1~100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。
图1自然界微生物尺度
Fig.1
Sizeofmicroorganismsin
nature
光学最微镜的发展伴随着人类对微观世界探索的历程。
早在公元前一世纪,人们就发现透过水滴可以观察到物体放大的像。
1590年前后,荷兰透镜工匠Z.Janssen和他的儿子把透镜组安装在管中,发明了原始的光学显微镜。
在此之后,Anton
van
达到0.1nm的超高分辨率o],被广泛应用于细胞
生物学,但由于生物样品无法存活于高真空环境,电子显微镜同样无法应用于活细胞。
原子力显微镜使用一个传感器尖端作为探针,利用尖端的原子与物质表面原子之间的范德华力
(VanDerWaals
Leeuwenhoek和R.Hooke对成像原理进行深入的研究,改进和发明了显微镜各部分结构,包括调焦结构、照明系统和载物台。
得到了现代光学显微镜的雏形口]。
他们利用光学显微镜做了一系列生物学观察实验,Anton
van
Force)来呈现样品的表面形貌。
分
辨率可达原子尺度o ̄10|。
相似地,扫描隧道显微镜利用量子力学中的隧道效应,通过测量探针与样品表面之间的隧穿电流来判断样品表面形貌¨¨,对粘附于表面的结构可以获得0.1nm横向和0.01
nm
Leeuwenhoek第一次观测到细菌
以及一滴水中的微生物,1665年R.Hooke发现细胞,这一里程碑式的发现展示了光学显微镜在生物学领域的巨大潜力。
1873年,德国人E.Abbeo。
揭示了远场光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限的原理,此后,提高光学显微镜分辨率工作一度停滞不前。
Abbe分辨率极限的数值约为a/2n,其中A是光波波长。
托是样品介质的折射率。
若以波长为500nm的光成像,水折射率为1.33,分辨率极限约为200
nm。
纵向分辨率。
不幸的是它们仅限于样品表面成像,并且图像获取速度缓慢,实验装置复杂昂贵,可能对生物组织造成损坏,同样无法用于活细胞。
为了避免远场衍射带来的Abbe分辨率极限,1928年E.H.Synge等[12”3提出近场扫描光学显
微镜(Near—field
0ptical
Scanning
Microscopy,
NOSM),NOSM使用一个尺度远小于波长量级的探针(如光纤)照明样品,使照明光场限定在50~100nm范围内,收集距离样品表面几个波长量级附近的透射倏逝波来获取样品信息,因此不受远场衍射限制。
可获纳米量级的分辨率H4 ̄1引,同时可以结合全内反射(Total
Internal
1.2几种非远场荧光光学超分辨技术
为了提高分辨率,科学家们发明了许多新颖的超分辨技术。
由Abbe分辨牢极限2/2n可以知道降低光波波长是提高分辨率最直接有效的方式,采
用波长2rim的X射线作为激发光源。
实现了30
Reflection,TIRF)技术
使用倏逝波照明样品[17|。
然而它也只能观测样品近表面区域的信息,对样品的制备有极高的要求。
1.3远场荧光光学显微镜在生物成像中的优势
与上述介绍的显微技术相比,町见光波段的远场光学显微镜具有非接触、无损伤、可探测样品内部
的特点,这些特点是生物组织活细胞深层三维成像
nm的分辩率m5|。
但低于400nm的光通常会损伤活细胞邸],因此通常情况下X射线显微镜无法应用于活细胞观测。
电子显微镜则利用波粒二相性,以德布罗伊波长为10qnm的电子束照射样品,可以
万方数据
9期
毛峥乐等:
超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限
的先决条件。
事实上,远场光学显微镜一直是生命科学研究中最主要的工具。
荧光光学显微镜是生物学研究中最常用的一种光学显微镜,利用荧光分子作为探针标记生物组织,通过探测受激荧光分子发射的荧光信号分布获取样品的空间信息。
荧光光学显微镜相比普通光学显微镜具有灵敏度高、可选择激发、高荧光对比度、信号光相对于激发光红移(有利于信号光与激发光的分离)等特点,这些独有的性质改善了光学显微镜的成像质量。
更重要的是荧光显微镜的成像不仅包含透射、折射、散射等几何光学过程,它还是一个光与物质、物质与物质相互作用的过程,这些丰富的物理过程为提高分辨率提供了一些新的途径。
本文将围绕着适用于生物样品观测的远场荧光光学显微镜,就现今常用的一些提高分辨率尤其是具有突破Abbe分辨率极限能力的显微技术展开详细讨论。
2远场荧光光学超分辨技术
点扩散函数(Point
Spread
Function,PSF)是
系统的成像过程就是物函数与PSF的卷积[18|。
如图2所示¨引,当两个物点的PSF接近到重叠部分的横向分辨率d。
=等,
j、^
(1a)
01
纵向分辨率d。
一寿鲁,l、^
(1b)
在PSF中仅有一个主峰。
或旁瓣(PSF光强次2’2
3|,图像质量严重下降。
此时PSF的傅里叶变
万
方数据●2●OO8O6二掣岳一
O4O2OO
・looo-800-6UU-4U【)一2【)U
o
200400600
8()olooo
1200
x/nm
图2瑞利判据规定光强叠加处最小值低于最大值处的
20%~30oA时刚好被分辨
Fig.2
Rayleigh
criterion
definesthattwo
objects
are
distinguishableonlywhen
the
minimumofsum
intensityis
at
least20
0A~30%lowerthanthe
maximum(NA=1,A=500nm)
TransferFunction,
当荧光分子被激发后,荧光各向同性发射,换言之以原则上说,所有的光学超分辨技术都是围绕着1)采用调制光照明样品;2)利用干涉照明和(或)成像;
3)引入非线性效应;
4)利用荧光分子激发过程中的物理机制。
第一个概念利用空间调制光照明样品,将物场nm的横向分辨率[2¨。
受换对光学传递函数(Optical
OTF)更加适合用来评价光学系统的分辨能力[2引。
2.1光学显微镜分辨率
各种空间频率传播,光学显微镜中有限光瞳相当于一个低通滤波器,阻挡了高空间频率荧光信号的通
一个无限小物点通过光学系统在像平面处的光强分布函数。
在一个线性不变的光学系统中,PSF不随物点位置的变化而改变,且像的光强与物的光强呈线性关系。
一般的光学成像系统都可近似为线性不变系统,如果认为物是无限小的点的集合,那么光学最小值比最大值低20%~30%时,L.RayleighE20]认为此时两个物点刚好可分辨,他以PSF的半峰全宽(FWHM)作为成像系统可分辨的最小尺度,据此给出瑞利判据,为
过,而高空间频季对应物体的精细结构,由此造成分
辨率的限制。
考察光学成像系统的0TF即可获得该成像系统高频信号获取能力,对应实际空间中的分辨率。
在PSF旁瓣较大的情形下,OTF比PSF更加准确地反映光学系统的实际分辨本领。
2.2荧光光学超分辨技术简介
如何得到一个尺度更小的PSF或者尺度更宽的OTF,科学家们提出大量的方法来实现这一目标,可以归纳为4点思路:
高空间频率信息编码,再通过计算提取高频率信息,横向分辨率提高1倍比5|。
4Pi共焦扫描显微镜利用第二个概念,在样品两侧各放置一个物镜,使激发光干涉照明,信号光干涉成像,将轴向分辨率提高5~7倍[26]。
在调制光照明中结合非线性饱和激发,即利用第三个概念,相对线性激发的情形可以获得更高空间频率信息,实现50激发射损耗显微镜则利用饱和受激发射的非线性特性突破了Abbe分辨率极限,三维分辨率达30~
别为物镜的折射率和最大接收半角。
式中NA为物镜的数值孔径,定义为nsin0,it/和0分
极大)非常小时,使用瑞利判据描述光学系统的分辨率非常准确。
随着旁瓣强度的增加,照明PSF的旁瓣在像平面产生赝像,不太严重的情况下,可以通过去卷积技术有效去除心1|,但是当旁瓣的强度达到主瓣强度的一半时,去卷积技术等图像处理方式失效。
2
1286
中国50
n“28|,理论上不受Abbe分辨率极限限制。
第
四个概念利用荧光光学显微镜巾荧光分子激发过程的物理机制,例如:
利用荧光分子对在相距1~
10
nm内会发牛荧光共振能鼍转移,荧光共振能量
转移屁微镜2虬具有纳米级的分辨本领。
在实际应用中。
各种超分辨思想和技术不足孤立存在的,为了最大程度地提高分辨率或同时获得横向和纵向的高分辨率,需要多种超分辨技术的优化组合。
例如4Pi共焦扫描显微镜具有提高纵向分辨本领的能力,结合受激发射损耗技术。
横向和纵向分辨率都达到50nm以下。
”,4Pi共焦扣描显微镜采用双光子激发方式,则兼具良好的组织穿透能力和轴向超分辨本领_h。
还有许多其他组合方案,本文只选择介绍一些成熟的组合方案,重点在于说明各种超分辨技术的基本原理。
2.3共焦扫描荧光显微镜
传统宽场光学显微镜一般使用面探测器如电荷耦合器(CCD)接收信号,主要的不足足纵向分辨率低,另外由于背景噪声得不到有效抑制,图像的信噪比和对比度不高。
1960年前后,M.Minsky[321提出共焦扫描光学显微镜(Confocal
Scanning
Fluorescence
Microscopy,CSFM)的概念,大大增强
了光学显微镜的轴向分辨能力,但苴到1970年后随着激光和数字化数据采集技术的应用,CSFM才得以实现,并很快成为生物医学研究领域的蓖要工具‘33~3
5|。
2.3.1单物镜的CSFM
共焦点探测是CSFM最显著的特点。
如图3所示=36:
。
点探测装置由一个中心与焦点位置共轭的dqL滤波器和光电倍增管(Photomultiplier
Tube,
PMT)组成,4qL的尺度一般小于像平面的爱里斑
图3共焦显微镜结构示意图
Fig.3
Principleofeonfocaldetection
万
方数据激光3j卷
尺度。
仪使来自物场焦点中心区域发射的荧光光子通过d,4L被探测器收集,mi焦点周围以及轴向前后的光(背景噪声)被遮挡一37’38『,数学上可以通过光强概率函数束描述这一过程
h。
,。
f—h。
・h扪,
(2)
式中h。
。
haet和h。
f分别表示照明光、小孑L滤波器以及总的光强概率分布。
式(2)显示了小孔滤波器对离焦背景光的抑制作用。
由此横向分辨率提高l。
4倍”,经过数据优化处理甚至可以达到2倍““。
更蘑要的是由于小孔抑制焦点轴向离焦的光信号,使CSFM的轴向分辨能力大人增强。
点探测器每次采集簟点的信号,扫描整个样品获取单个焦平面图像。
再改变样品轴向佗置逐层扫描成像,最终将各层图像组合(重构)得剑样品二维图像41J。
然而生物组织存在散射。
焦点中心处发射的信号光子到达像平面时可能会偏离小孔滤波器的中心被阻挡,加之荧光信号本身就比较微弱,探测器采用量子效率较低的PMT(低于CCD),滤波器的孔径过小会使信号强度和信噪比迅速下降。
4…。
可见CSFM的分辨率与信噪比是一对矛盾,由于信噪比决定了光学系统获取图像的能力。
3。
,实际应用中,往往不得不增大孔径使信噪比高于可观测的水平,这种情况下CSFM相对于宽场显微镜分辨率在横向没有太大的提高。
尤其对于较厚的样品,深层激发的荧光信号光子受到的散射更加严重,小孑L滤波器的孔径超过爱罩斑,甚至是爱里斑大小的数倍,此时CSFM对横向分辨率几乎没有任何提高,主要用来抑制噪声。
42i。
CSFM横向和纵向分辨率的典型值约为200nm和500
nm’3…。
由此町见,CSFM相对于宽场光学显微镜的改进主要在于轴向分辨能力的增强,并能有效抑制背景噪声,发挥了光学显微镜无损伤、非侵入的优势,适用于生物活细胞内部的三维成像。
凭借简单的物理原理和良好的可操作性,迄今为止,CSFM仍然是生物活细胞组织研究中最常用的工具之一L44““。
2.3.2
Theta共焦显微镜
如图4所示[24|,CSFM由于采用单物镜照明样品和收集信号,只能产生和收集球面波的一部分,造成PSF在纵向和横向不对称,纵向分辨率劣于横向分辨率3~4倍。
针对这个问题,Theta显微镜:
埔“7:
采用光轴正交的(更一般地,成0角)两个透镜分别照明样品和采集荧光,此时探测PSF的纵向
对应照明PSF的横向,由式(2)町知。
照明样品的PSF纵向将被压缩,提高轴向分辨宰,改善总的
9期
毛峥乐等:
超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限
1287
PSF的不对称性[4引。
实际应用中,大数值孑L径的物镜工作距离很短,光轴正交的两个物镜将会在空间上重合。
因此Theta显微镜只能选用数值孑L径较小的物镜,典型值为0.75[46|,仅为共焦显微镜的一半,可见Theta显微镜轴向分辨率的提高是以牺牲横向分辨率为代价的_川。
另外,由于照明光和接收信号的方向正交,样品需要在两个方向上具有一定的对称性,样品一般制成棒状,增加了样品制备和实验装置的复杂性。
图4单物镜聚焦形成的椭球形焦点
Fig.4
Ellipsoidfocal
spot
producedbysinglelens
文献E48]报道了利用B.Richard和E.wolf的矢量场理论修正激发光和探测光的PSF,计算证明利用偏振光激发和偏振光探测可获得各向同性更好的PSF,且主瓣与旁瓣彻底分离有利于去卷积处理。
在照明光路和探测光路中加入遮挡比例大于0.5的环形滤波器可以有效减小Theta显微镜的PSF体积Ⅲ],但这会产生较大的旁瓣,在探测光路改用4qL滤波器可以抑制旁瓣,提高信号光采集效率。
为了从根本上克服两个物镜对数值孔径大小的限制,S.Lindek等[50,513在物镜下放置反射镜使激发光反射,与探测光路形成0角,实现了单物镜的Theta显微镜(Single-lens
Theta
Microscopy,
SLTM)。
这种方法允许使用稍大数值孑L径的物镜(NA=1.0),相对于共焦显微镜(NA=1.23),轴向分辨率提高1.5倍。
但是物镜1mm的工作距离以及物镜下的反射镜装置都限制了样品的尺寸,只适合观测较小的样品。
2.4双光子荧光显微镜2.4.1单色双光子荧光显微镜
M.Goppert—Mayer[5幻最早为双光子激发显微镜奠定了理论基础,1931年她在博士论文中通过量
万
方数据子力学建立了双光子吸收和发射理论,指出只要激发光光子密度足够高,材料可以同时吸收两个频率相同的光子,相当于吸收一个倍频的单光子。
早期采用被动锁模的染料激光器产生的皮秒脉冲光激发有机分子实现了双光子吸收[5引。
接着人们尝试利用染料激光器获取飞秒光[5引,并利用锁模染料激光器产生的100fs激光实现了多光子吸收过程¨5|。
然而染料激光器的不稳定性与较窄的调谐范围阻碍了双光子显微镜的发展,直到1990年后自锁模的Ti—sapphire飞秒固体激光器的出现,40fs脉宽和
700~1100am宽波长调谐范围使其成为双光子激
发的理想光源[561。
W.Denk等[57’58]将激光扫描技术与Ti—sapphire飞秒固体激光器结合,首次提出并证明了双光子荧光显微镜(Two-photon
Fluorecence
Microscopy,TPFM)在生物样品观测
中的实用性,指出一个荧光分子的吸收概率除了与激光光强的平方成正比以外,还与脉冲宽度、重复频率、聚焦物镜数值孔径、光子的吸收截面等有关,他们在((Science>)上发表的文章至今已被引用1000多次,这一开创性的工作使TPFM进入一个快速发展
的阶段。
图5单光子激发与双光子激发对比
Fig.5
Comparisonofone—andtwo-photon
fluorescenceexcitations
相对于单光子激发的光学显微镜,TPFM通常具有两个非常显著的特点,1)非线性激发,即荧光激发概率正比于光强的二次方;2)采用长波长近红外光激发。
这为TPFM带来四方面的优点:
1)荧光激发概率正比于光强二次方。
因而样品中除了焦点附近高光强区域内的荧光分子可以被激发外,其他区域内激发概率非常小。
如图5所
示[3引,TPFM有效降低了背景噪声,改善信噪比。
中国用于高散射的生物组织时,双光子显微镜更少受到散射背景光的影响¨9’60J。
2)由于双光子激发仅在焦点附近的高光强区域发生,TPFM由这种内禀物理特性增强轴向分辨能力。
不仅如此,由物理效应形成的“虚小孔”不会像CSFM中实际小孔那样阻挡信号光[57’58|,从而提高了信号接收效率和信噪比¨1—2。
。
3)以近红外光(700~1100nm)作为激发光源,相对于可见光在生物组织里散射和吸收更小,穿透能力更强。
以人类皮肤作为观测对象。
TPFM能够比CSFM探测更深的区域[6轧6引。
TPFM十分适于生物组织的深层透视[I9’6“65—6|,利用再生放大器产生的高强度激光可以使探测深度达到近
1000“m[67’69c。
4)由于双光子荧光激发仅发生在焦点附近,从而减轻了焦点外区域的荧光分子的光漂白、光裂解。
双光子激发所用的近红外激发光相对于单光子时波长较长,对非焦点区域外的生物细胞的光损伤更小。
TPFM的四方面优点极大地改善了光学显微镜在生物组织活细胞,尤其是生物组织深层成像的适用性[70|,已被广泛地应用于肾脏[71|、脑细胞‘7273]、皮肤组织‘747
5|、淋巴器官‘761以及肿瘤‘771等的研究。
由于双光子吸收系数极小,TPFM需要吉瓦每平方厘米级的光强,对激光器提出较高的要求。
虽然非线性激发使非焦点区域的荧光分子光漂白和光
图6荧光小球
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