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几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究解读
第38卷第3期2802009年5月
卫生研究
JOURNALOFHYGIENERESEARCH
V01.38No.3
May2009
文章编号:
1000-8020(200903.02∞.04
几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究
刘小兵朴建华1田园
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100050
论著
摘要:
目的研究生物活性物质体外抗氧化能力评价方法,应用体外理化环境下建立起来的评价方法对受试物进行初步抗氧化能力评估。
方法联合应用2,2’.连氮.双.(3.乙基苯并噻唑.6.磺酸二铵盐(ABTS
法与铁离子还原/抗氧化能力测定法(raAP法用于生物活性物质体外抗氧化能力研究。
在ABTS法中。
使用
紫外可见分光光度计734nm波长下测定以槲皮素、姜黄素、DL-a.生育酚和原花青素等为代表的生物活性物
质;在FRAP法中,运用酶标仪,595nm波长处测定同样受试物的抗氧化能力。
结果ABTS法:
槲皮素和姜黄
素的抗氧化活性TEAC值分别约为2.02和0.50;而lgDL-a.生育酚、原花青素清除自由基的能力相当于
2.06mmol、2.897mmol的Trolox清除自由基的能力;FRAP法:
抗氧化活性以1.Ommol/LFeS04为参考标准,槲皮
素、姜黄素和Trolox摩尔当量约为5.73、1.18和2.09;而DL-a.生育酚和原花青素抗氧化活性分别是207.7mg、
156.36rag。
结论ABTS法与FRAP法联合应用,操作简便、结果可靠,尤其适宜作为生物活性物质体外抗氧
化能力的评价方法。
关键词:
生物活性物质氧化应激中图分类号:
R151.2Q591ABTS法FRAP法抗氧化能力
文献标识码:
A
Researchontheevaluationmethodsforantioxidantcapacity
ofseveralbioactivesubstances/nvitro
LIUXiaobing,PIAOJianhua,TIANYuan
InstituteofNutritionandFoodSafety,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100050,China
Abstract:
ObjecttveTostudytheevaluationmethodsforantioxidantcapacityofbioactivesubst
Bncein础阳,andtOapplythemethodswhichisestablishedinphysieochemiealenvironmentinordertogivethepreliminaryasse韶,mentoftestsubjects.Methods7rhecombinedapplicationofABTSandFRAPmethodsintheassessments.usingtheUV—VIS
spectrophotometerandtheautoaualyzerrespectivelyteattheantioxidantcapacityofquercetin,curcumin,DL-a-tocopherolandprocyanidineat734砌inABTSandat595nminFRAP.ResultsAB'IS:
n地TEACvalue8ofquercetinandeurcuminwereabout2.02and0.50.19DL-a-toeopherolandanthocyanimwereequivalentto2.06mm01.2.897mmolofTroloxinscavenging
freeradicalscapacity.nu憎:
Used1.Ommol/LFeS04粕thereferencestandard,quercetin,eurcuminandTroloxequivalentmolarabout5.73,1.18and2.09.DL-a-tocopherol,antioxidantactivityofpmanthocyanidinswem207.7mgand156.36rag.ConclusionItWaSsupportedsupportthatcombinedABTSandFRAPmethods.becauseoftheirconveniently,andtheirreliableresults,especiallyinappropriatelybeusedastheevaluationmethodsforantioxidantcapacityofbioactivesubstance讯v/lro.
Keywords:
liioactivefactors,oxidativestress,ABTS,FRAP,antioxidanteapacity
人类和动物持续暴露在活性氧与促氧化剂中,很容易引起机体组织发生氧化应激,导致机体的代谢性功能紊乱以及一系列的慢性疾病,如:
癌症、血脂异常等…。
大量的流行病学与临床研究显示。
人群在消费富含天然生物活性物质的蔬菜和水果后,其所患有心血管疾病、糖尿病、癌症等非传染性疾病的风险将明显降低乜J】。
因此,食用一些富含具有抗氧化生物活性物质的功能性食品,以延缓或预防机体组织氧化应
基金项目:
国家科技支撑计划项目(No.2006BAD27801
作者简介:
刘小兵,男,硕士研究生
1通讯作者:
朴建华,男。
研究员激损伤的这种做法,已经得到了消费者和科学家们的广泛认同HJ】。
然而,面对如此众多的生物活性物质,如何才能准确、快速地做出辨别,这个问题已经摆在了科学家面前。
最近20年,筛选评价生物活性物质抗氧化活性的方法层出不穷,尤其是体外筛选评价方法,尽管其问还存在着由体外到体内研究的可行性争议,但是围绕着如何更好的筛选评价生物活性物质体外抗氧化能力的诸多方法均已得到了很好的建立与长足的发展。
在目前,体外抗氧化能力评价实验中,生物源性的红细胞氧化溶血实验与低密度脂蛋白(LDL氧化实验等均被认为是研究自由基诱使细胞膜损伤与评价植物多酚类物质抗氧化能
第3期刘小兵,等.几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究28l
力的良好模型№]。
同时,许多理化环境下建立起来的评价方法也越来越受到重视,已经建立起的方法。
如:
2,2’.连氮.双.
(3.乙基苯并噻唑.6.磺酸二铵盐法[2,2-azinobis-(3.ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid一diammoniumsalt,ABTS]、l,1.二苯代苦基苯肼法[2,2-diphenyl.1.picrylhydrazyl,DPPH]、铁离子还原/抗氧化能力测定法[Ferricreducingantioxidantpower,FBAP]、氧自由基吸收能力测定法[Oxygenradicalabsorptioncapacity,ORAC]、化学发光法[Photoehemihminescenceassay,PLC]等;这些方法特别适合进行大量生物活性物质体外抗氧化能力的快速筛选。
但是,由于每种评价方法本身存在的缺陷,仅仅单独使用~种方法难以得出令人信服的结论。
因此,本实验在总结众多文献结论的基础上,决定采用两种基于不同原理的体外抗氧化能力评价方法对槲皮素、姜黄素、DL廿生育酚和原花青索等几种生物活性物质进行体外抗氧化能力评价,应用的评价方法为ABTS法和FRAP法。
l材料与方法
1.1材料
AB幅[2,2.azinobis-(3-ethylbenzothiazoline.6.sulfonicacid-diammoniumsalt](Sigma-Aldrich公司;Trolox[6-hydroxy一2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid](Sigma.Aldrich公司;唧[2,4,6-tripyridyl.s-triazine](Sigma-Aldrich公司;DL广口.生
育酚(AlfaAesar公司;过硫酸钾、硫酸亚铁、冰醋酸、盐酸、无水乙醇(北京化工厂;槲皮素、姜黄素(国药集团化学试剂有限公司;原花青索(西安小草植物科技有限公司;六水合三氯化铁、醋酸钠(广东汕头西陇化工厂。
以上所有试剂均为分析纯,超纯水用来配制试剂。
UV-9100型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司;MulitiskanMK3酶标仪;96孔微量滴定板等。
1.2方法
1.2.1ABTS法ABTS+自由基的制备"小1按照原始方法并略有改动,将5ml的7mmol/LABTS和88m的140mmol/L过硫酸钾混合,于室温、避光的条件下反应,静置过夜,最终形成ABTS+自由基储备液。
ABTS与过硫酸钾的化学反应剂量是2:
1,在反应体系中,ABTS氧化不完全使得体系更加趋于稳定。
储备液在使用前,为了取得最佳反应条件,要求至少停留12—16h;在使用时需用无水乙醇将其稀释成ABTS+自由基工作液,两工作液的要求是30℃,734nm波长下,吸光度为(0。
70±0.02。
Trolox系列浓度溶液配制准确称取Trolox0.01259,然后使用无水乙醇依次将其配制成80、120、200、300、400、500、600、700和800pmol/L的系列浓度溶液备用。
受试物系列浓度溶液配制槲皮素、姜黄素、DL廿生育酚和原花青素按照预实验结果,将其配成浓度在10—1000Ⅲnol/L和0.25~ling范围内的适宜系列浓度溶液,并要求在各浓度下具有20%一80%清除自由基的效能。
抗氧化活性的测定取ABTS+自由基工作液4ml置于10ml具塞比色管中,分别加入80出的Trolox或其它受试物溶液。
均匀振荡10s,300C水浴反应6rain,测定其各自吸光度值,平行样3支,取平均值计算。
测定结果以受试物清除自由基的能力与Trolox清除自由基的能力相对比得到,单位为Tmlox抗氧化活性当量(Troloxequivalentantioxidantcapacity,TEAC,即Imraol/L或1mS/nd受试物清除自由基的能力相当于Trolox自由基清除能力的微摩尔数。
受试物清除自由基能力=100×(1-A。
/A。
;
TEAC=受试物清除自由基能力/Trolox清除自由基能力;
A。
是水浴反应6min后,测定反应混合液的吸光度;Ao是
ABTS+自由基工作液的吸光度值。
1.2.2FRAP法FRAP工作液的配制睁’1…:
按照原始文献并略有改动,300mmol/L醋酸盐缓冲液(0.319三水合醋酸钠+1.6ml冰醋酸+超纯水至100ml,pH3.6,lOmmol/L1’PTZ的40mmol/L盐酸溶液。
20mmol/LFeCl3溶液。
以10:
l:
1的体积比(300mmol/L醋酸盐溶液25ml+lOmmoi/L珊溶液40mmol/L
盐酸溶液2.5ml+20mmoVLFeCh溶液2.5m1混合,加热至37℃备用。
FeSO..系列浓度溶液的配制:
准确称取FeSO,0,01399,然后使用超纯水将其依次配制成50、100、150、200、300、400、800、1600肛mol/L的系列浓度溶液备用。
受试物系列浓度溶液配制:
槲皮素、姜黄索、DL廿生育酚和原花青素按照预实验结果。
配成50.1200/umol/L和0.2.1lng范围内的适宜系列浓度溶液,并要求在各浓度下具有20%一80%清除自由基的效能。
抗氧化活性的测定:
在96孔的酶标板每孔中,依次加入300va的FRAP工作液,20一配制的FeS04或受试物溶液,20m的超纯水用以调匀孔中溶液,然后放置于37℃水浴锅中加热反应8min后,酶标仪595nm下测定吸光度,平行样3支,取平均值计算。
测定结果以1.0mmol/LFeS04为参考标准,受试物抗氧化活性则以达到同样吸光度所对应的FeS04的毫摩尔数表示。
1.3统计分析
采用统计学软件SPSS13.0对数据进行处理,计算平行样吸光度,并得到回归方程。
2结果
2.1ABTS法测定受试物抗氧化活性
本实验应用ABTS法分别测定槲皮素、姜黄素、DL俨生育酚和原花青素,实验进行了三次,实验结果稳定,变化不具有统计学意义(P<0.05。
从实验得出Trolox抗氧化能力测定标准曲线,曲线方程是:
y=92.661||f+2.29,R2=0.999。
(见表1
裹1受试物体外总抗氧化能力ABTS法测定情况
Table1Thetotalanttoxidltcapadttesofprepared
bioactivesllbstallO日measuredinABTSmethod
结果显示:
槲皮素、姜黄素的抗氧化活性TEAC值分别约为2.02、0.50;而lgDL广*生育酚清除自由基的能力相当于2.06retool的Trolox清除自由基的能力、lg原花青素清除自由基的能力相当于2.897mmol的Trolox清除清除自由基的能力。
282卫生研究第38卷
2.2FRAP法测定受试物抗氯化活性
在本实验中,FBAP法依次测定槲皮素、姜黄素、D【,a-生育酚、原花青索和Trolox的总抗氧化能力,实验进行了3次,实验结果稳定,变化无统计学意义(P>0.05。
实验首先得出FeS04抗氧化能力标准曲线,曲线方程是:
Y=I.095X+0.002。
R2=0.999。
结果由表2显示:
槲皮素、姜黄素和Trolox的抗氧化活性以1.Ommo//LFeS04为参考标准,槲皮素摩尔当量约为5.73、姜黄素1.18、Trolox2.09;而DI广a-生育酚以及原花青素的抗氧化活性分别是207.7mg、156.36mg相当于1.Ommol/LFeS04。
裹2受试物体外总抗氯化能力FRAP法测定情况
Tabk2Thetotaltmflo'ddtmtcapacitiesofprepared
bioacflvesub$lBnc皓messii/-edInFRAPmethod
3讨论
ABTS法由于操作简便、快捷、结果重复性较好,比较适合大批量样本的体外抗氧化能力测定,所以已经成为一种广为应用于体外抗氧化能力评价的方法。
但是,该法也有其不足,TEAC值有时略有变异,而个中原因又是多样的H“”J。
MARIKEN等的研究认为TEAC值很大程度上依赖其反应条件,即:
待测物质浓度既不可以过高,也不可以过低,过高可以造成反应吸光度值增加,过低又可使得反应吸光度降减低,并且指出反应时间对于测定结果的重要性,这些都会影响实验结果的稳定性n引。
在本实验中,由于待测的生物活性物质个别浓度相对较高、使得反应时间不足,结果造成了反应进行不完全,进而引起吸光度值不稳定,抑制率计算过低。
这似乎与原始文献"1记载略有出入,其推荐的反应时问4min过短。
由于经典的ABTS法主要关注标准曲线的底部变化趋势,而该部分一般不是很稳定。
因此,SANCHEZ.MORENO等在同时考虑抗氧;l:
能力和反应时间后提出运用反应的动力学参数表示物质抗氧化能力【I“。
即:
ED。
(清除50%自由基需要的Troiox浓度、tEC。
(清除50%自由基需要的时问和AE[自由基清除率=1/(EDsoxtEC∞]。
对于ABTS结果的测定,据RebertaRE最初的文献记载,还有一种通过抑制率,浓度与反应时间所形成面积大小来计算抗氧化能力的方法n】。
该法考虑了时间、浓度的因素,比较全面,但由于计算方法稍显复杂,所以至今应用甚少。
FRAP法,也是一种操作简便、分析快捷,而且经济的体外物质抗氧化能力评价方法。
它的特点是,待测样本不需要前处理,化学反应剂量恒定,而且实验的重复性和灵敏度很高。
应用的范围也很广,既可以测定单纯生物活性物质的抗氧化活性,又可以测定复杂物质,如血浆制品、植物提取物¨副以及饮料¨酬的抗氧化活性。
生物活性物质的抗氧化活性在适宜浓度范围内,呈现特定的剂量一反应线性关系,而且不同的生物活性物质体现不同的抗氧化活性。
从Benzie和Strain的研究发现归J,FBAP法具有很好的化学剂量反应关系和实验结果良好的稳定性;其中在100、200和900pmol/L浓度下,得出的FRAP值组内变异系数(Cy<0.01,而在960扯mol/L浓度下其组间V<0.03。
但是,有关文献显示,该法美中不足之处在于其不能测定一些带有巯基(,OH的具有抗氧化活性物质,如:
谷胱甘肽等¨”。
而且在本实验中发现:
待测生物活性物质浓度较大的时候,反应曲线呈现对数变化趋势,甚至出现在某一点后曲线开始呈现递减趋势。
ABTS法与FRAP法都是评价生物活性物质总抗氧化能力的方法,虽然二者基于原理不同。
但是,有研究发现二者在结果上具有很好的相关性与一致性¨8“引;尤其是在成本和耗时上更是相比于其他方法优势明显,ABTS法与FRAP法仅需要分光光度计或者酶标仪,ABTS法全程仅需2h,而FRAP法需要时间更少,30rain即可完成分析。
目前,国内已有相近方法的探讨与研究,但是多是应用一种方法进行评价性研究,因此本研究在权衡了各种实验方案与方法后,认为ABTS法与FRAP法是结合的比较完备而又可靠的组合。
联合使用ABTS法与FRAP法用于筛选与评价生物活性物质的抗氧化能力,完全可以得出令人信服的结论;为进一步开展体内实验,即动物实验与人体试食实验提供有效充实的依据。
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