核酸提取纯化常见问题解答.docx
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核酸提取纯化常见问题解答.docx
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核酸提取纯化常见问题解答
核酸提取纯化常见问题解答
1.AccuPrep®凝胶回收试剂盒常见问题
2.AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒常见问题
3.AccuPrep®GMO提取试剂盒常见问题
4.AccuPrep®PCR纯化试剂盒常见问题
5.AccuPrep®质粒提取试剂盒常见问题
6.AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒常见问题
7.AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒常见问题
8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题
9.质粒DNA提取操作常见问题
AccuPrep®凝胶回收试剂盒 ↑TOP
Q1.产量低
A1.1)凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。
离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全,DNA被包裹不
能释放到溶液中,而且还降低柱子对DNA的亲和力,最终导致DNA产量降低。
2)加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗?
过浓的W缓冲液会将DNA洗脱,从而导致产量的降低。
3)错误的洗脱缓冲液会降低产量.洗脱缓冲也不能包含过多的盐.缓冲液的pH应调至7.0-8.5。
4)错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂,当颜色为黄色时表示pH
在正常范围内。
如果颜色为红色或橘黄色,表示pH已经超出了正常的范围。
这时应该加入几滴醋
酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。
5)放入了过多的琼脂糖凝胶块。
如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸
附力,从而导致DNA产量的降低。
Q2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中
A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中,这可能是因为样品中含有WB缓冲液。
WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮,这种情况下离心样品三次。
如果悬浮的状况依然存在,那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇,再离心一次。
Q3.提纯后的后续酶反应效率降低
A3.1)样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。
这种情况下,加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱5分钟,然后再离心。
2)样品中含有残留的WB缓冲液,残留的乙醇会抑制后续的酶反应,结合柱必须要完全晾干。
如果问题仍然存在,第二次离心后让结合柱晾干10分钟。
3)一起被洗脱的玻璃纤维影响了酶的活性,再离心1分钟,转移上清液到一个新的离心管中。
AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒 ↑TOP
Q1.DNA产量或纯度低
A1.1)缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下,导致了效率降低。
确保试剂到货后存放于室温(15-25℃),试剂使用后瓶盖要拧紧,保持其pH值及稳定性,避免污
染。
冻干试剂溶解后应分装并于–20℃保存。
2)在洗涤缓冲液1和2中没有加入无水乙醇。
加入乙醇后,充分混匀洗涤缓冲液W1和W2,并且作标记,表明乙醇己加入。
3)试剂和样本没有充分混匀。
每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。
4)您可能没有选用适合的试剂来洗脱DNA。
洗脱DNA需要碱性条件,使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱。
5)裂解可能不完全。
确保裂解液从混浊变的澄清,表明蛋白质已经降解。
根据组织类型不同需要的裂解时间会有差
异。
裂解通常需要1-3小时,为保证其效率,可以使用振荡水浴的方法(如实验操作中所述)。
样品中加入蛋白酶K后要立即混匀。
裂解液加入结合柱前将样品与异丙醇充分混匀。
6)从组织中提取的产量低。
在进行消化与裂解步骤之前确保组织破碎为小块(或粉末状),以下两步增加了与蛋白酶K一起
孵育的时间:
A将组织与蛋白酶K孵育过夜。
B.将组织与蛋白酶K孵育3~4小时,然后加入新
鲜的蛋白酶K30µl再孵育1~2小时。
7)产物在260nm处的吸光值(A260)太高。
结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。
这些纤维可以将光散射,造成了较高的吸光值
读数。
在最后的洗脱阶段,太多的离心也可能导致将结合柱中的玻璃纤维洗脱下来,除去玻璃纤
维的方法如下面所述。
Q2.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全
A2.结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。
这些纤维会抑制酶切反应。
最终洗脱步骤完成后,以最大速度离心1分钟,可以在管底看到玻璃纤维,把上清液转移到一个新管中,不吸出原来管中的玻璃纤维即可。
Q3.组织样本中的DNA降解
A3.获得的组织样本应立即-20°C冷冻保存,直至开始裂解步骤。
使用研钵和研棒在液氮作用下将组织研磨成粉末,在没有裂解的组织中可能有核酸酶活性。
Q4.血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色
A4.结合柱可能洗涤不充分,应洗涤结合柱直至流出液体成无色,将200µl洗脱液与200µlGC缓冲液混合,再加入100µl异丙醇,重复纯化步骤。
Q5.在某些缓冲液中有白色沉淀(TL或GC缓冲液)
A5.经过在低温下的长期存放,组织裂解缓冲液或结合缓冲液中可能出现白色沉淀。
在60°C孵育可使沉淀溶解。
沉淀对结果无影响,在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。
AccuPrep®GMO提取试剂盒 ↑TOP
Q1.DNA产量或纯度低
A1.1)试剂盒保存条件不适当。
到货后存于15-25℃。
2)缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下,导致了效率降低。
确保试剂到货后存放于室温(15~25°C),试剂使用后瓶盖要拧紧,保持其pH值及稳定性,避免污
染。
冻干试剂溶解后应分装并于2~8℃或-15~-25℃保存。
3)使用前在洗涤缓冲液中没有加入无水乙醇。
加入乙醇后充分混匀并存于15~25℃。
做标记标明是
否已加入。
4)试剂和样本没有充分混匀。
每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。
Q2.DNA洗脱回收率低
A2.可能使用了不适当的洗脱缓冲液。
不要用水洗脱,请用试剂盒中提供的洗脱缓冲液洗脱。
Q3.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全
A3.结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。
这些纤维会抑制酶切反应。
最终洗脱步骤完成后,以最大速度离心1分钟,可以在管低看到玻璃纤维,把上清液转移到一个新管中,不吸出原来管中的玻璃纤维即可。
Q4.产物在260nm处的吸光值(A260)太高
A4.结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。
这些纤维可以将光散射,造成了较高的吸光值读数。
除去玻璃纤维的方法如上所述。
Q5.DNA产量低
A5.1)蛋白酶K溶解不完全。
按照下面步骤完全溶解蛋白酶K:
1.吸取2.5ml双蒸水加入蛋白酶K冻干粉小瓶中。
2.盖上瓶盖,颠倒几次使蛋白酶K完全溶解。
3.分装并做标记,存于–15to-25°C。
注意:
按照此种方法溶解的蛋白酶K至少可稳定存放12个月。
2)裂解不完全。
加入蛋白酶K后立即将样本混匀。
裂解液加入结合柱前要与异丙醇彻底混匀。
Q6.从组织中提取产量低
A6.蛋白酶K消化不完全。
确保消化与裂解步骤之前组织破碎成小块。
有两种方法增加孵育时间:
.组织与蛋白酶K一起孵育过夜,或孵育蛋白酶K3~4小时,再加入30μL蛋白酶K温育1~2小时。
Q7.组织样本中的DNA降解
A7.在没有裂解的组织中存在核酸酶活性。
组织在进行裂解步骤前应该冻存于-20°C,样品进行匀质化时使用小块组织(20-40mg)。
Q8.血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色
A8.结合柱可能洗涤不充分,应洗涤结合柱直至流出液体成无色,将200µl洗脱液与400µl结合缓冲液混合,再加入100µl异丙醇,重复纯化步骤。
Q9.在PL缓冲液和B缓冲液中有白色沉淀
A9.经过在低温下的长期存放,PL缓冲液或B缓冲液中可能出现白色沉淀。
在70°C孵育可使沉淀溶解。
沉淀对结果无影响,在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。
AccuPrep®PCR纯化试剂盒 ↑TOP
Q1.低产量
A1.1.您是否将PCR产物与结合缓冲液充分混匀?
不足浓度的离液盐不会增加DNA与结合柱的吸附。
2.您是否在洗涤缓冲液中加入了足量的无水乙醇?
浓缩的洗涤缓冲液可以洗去结合的DNA。
3.使用不正确的洗脱缓冲液可能会降低产量。
洗脱缓冲液不能含有太多盐离子,最适pH值应为7.0-
8.5。
Q2.样品在琼脂糖凝胶中上样后漂浮
A2.样品可能包含残留的洗涤缓冲液因而导致漂浮。
必须离心确保柱子中没有挂壁的液滴。
如果这种情况持续发生,第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10min,然后再进行洗脱。
Q3.后续酶切反应不正常
A3.1.样品中高浓度的盐离子会抑制酶切反应,这种情况下,应在结合柱中加入洗涤缓冲液后静置5min,
再离心。
2.样品中包含残留的洗涤缓冲液,残留的乙醇影响酶切反应的进行,结合柱必须完全干燥。
如果这种
情况持续发生,第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10min,然后再进行洗脱。
3.玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性,离心1min将上清转移至一个新管即可。
AccuPrep®质粒提取试剂盒 ↑TOP
Q1.质粒产量低
A1.1.您是否收集了足够数量的细胞?
产量依赖于宿主菌型,细胞过量也可能会使产量降低.请参阅附录。
2.您是否使用了重悬缓冲液充分悬浮细胞?
不完全重悬浮细胞会降低裂解效率。
3.中和缓冲液中是否有盐沉淀?
涡旋振荡重新使沉淀溶解。
离液盐浓度不适当会导致产量的降低。
如
果沉淀不易溶解,可于60℃加热。
4.加入RNaseA干粉后试剂是否保存超过了6个月?
低浓度的RNaseA可以导致质粒产量低,6个
月后,再加入一些RNaseA,至多达到100µg/µl。
Q2.染色体DNA污染(电泳分析时出现了杂带)
A2.在第三步,样品不能够涡旋和剧烈振荡,裂解时间不能超过5分钟,这些都可能切断染色体DNA,轻柔处理裂解液。
Q3.进行琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮
A3.样品含有残留乙醇导致了漂浮,离心后必须使柱子完全干燥,确保结合柱内无挂壁液滴。
Q4.序列分析时有许多背景条带
A4.您是否检查了宿主E.coli菌株的内切酶活性?
HB101,JM系列及正常野生型宿主有很高内切酶活性,通过降解质粒干扰测序反应。
对于这些类型,需要第七步变性过程。
Q5.样品中含有RNA
A5.1.收集细胞的量过多。
我们推荐使用适当的量,根据附录中显示的宿主细胞光密度。
2.RNase活性减弱。
RNaseA干粉加入到重悬缓冲液中保存超过6个月以上,RNase活性会减弱,
需再加入一些RNaseA干粉,多至100µg/µl。
Q6.玻璃纤维的洗脱
A6.玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性,以最大速度离心1min,上清转移至一个新管即可。
AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒 ↑TOP
Q1.提取后DNA纯度过低
A1.1.试剂盒的储存条件不正确。
®试剂盒到货后需要15-25℃保存.
2.缓冲液和其他试剂暴露在影响其活性的环境下。
®所有缓冲液均应保存于15-25°C。
试剂瓶使
用后均要盖好盖子以保护其pH值和稳定性,避免污染。
任何冻干的试剂被稀释使用后都要储存在
2-8℃或-15--25℃。
3.洗涤缓冲液(WBuffer)中没加乙醇。
®WBuffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。
加入后混
合好,并储存于15-25℃.做好标记以便区分是否已加入乙醇。
4.样品和试剂没有完全混合。
®每一步加完试剂到样品中后,都要充分混匀。
Q2.洗脱后,DNA的回收率低
A2.可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱DNA.洗脱液需要用碱性的缓冲液。
à下次实验时不要用水洗脱DNA,用试剂盒中的洗脱缓冲液洗脱DNA。
Q3.提取的DNA用限制性酶切不完全或完全不能进行酶切
A3.玻璃纤维可能会同DNA一起被从柱子中洗脱,它会影响内切酶的活性,最后的洗脱步骤完成后,离心机调到最大速度离心一分钟.玻璃纤维可能在管底被观测到。
将上清液转移到一个新的管中,注意不要带走管底的玻璃纤维。
Q4.用分光光度计定量时A260值过高
A4.玻璃纤维可能同DNA一起从柱子中洗脱下来,它也有吸光作用导致A260值过高 ®除去玻璃纤维的方法同上述方法一样。
Q5.DNA产量过低
A5.a.蛋白酶K没有被完全溶解。
按如下的操作步骤完全溶解蛋白酶K:
1).取1.25ml的双蒸水到盛有蛋白酶K的管中。
2).盖上管盖,颠倒几次直到蛋白酶K完全溶解。
3).分装后储存于–15to -25℃.*注意:
用这种方法储存得当,蛋白酶K的活性可以保存1年以上。
b可能裂解不完全。
®加入蛋白酶K后立即将样品混合好。
在样品加入结合柱之前,一直搅拌将异丙
醇和裂解产物混合好。
Q6.SL缓冲液或ST缓冲液中出现白色沉淀
A6.在长时间的低温下保存SL缓冲液或ST缓冲液,其中会出现白色沉淀。
®任何在SL缓冲液或ST缓冲液中出现的白色沉淀,都必须在70°C下加热溶解.沉淀并不影响缓冲液的功能,高温溶解沉淀也不会增加提取核酸的产量。
AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒 ↑TOP
Q1.提取后的RNA纯度低
A1.1.试剂盒的保存温度不正确,试剂盒需要15-25℃保存。
2.加入Poly(A)到VB缓冲液后混合完全。
3.洗涤缓冲液(WBuffer)中没加乙醇,WBuffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。
混合好后储存
于15~25℃。
做好标记以便区分。
4.样品和试剂没有混合完全,每一步试剂加到样品中后,都要充分混合。
Q2.洗脱后,RNA的回收率低
A2.可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱RNA.洗脱液需要用碱性的PH缓冲液.à下次实验时不要用水洗脱,请使用用试剂盒中的洗脱缓冲液进行洗脱。
琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题 ↑TOP
Q1.产量低
A1.1)溶解不完全使产量降低。
不足浓度的离液盐影响DNA与硅基质表面的结合。
2)您是否在W缓冲液中加入了足量的乙醇?
浓缩的W缓冲液可能会洗去结合的DNA。
3)使用不适当的洗脱缓冲液可能降低产量。
洗脱缓冲液不应包含太多的盐。
缓冲液pH值应调至7.0-
8.5。
4)不适当的结合条件如高pH值会降低产量。
SB缓冲液包含pH指示剂,颜色为黄色。
超出pH范围后
颜色变为红色或橙色。
这种情况下可加入醋酸钠调整pH值至适当范围。
5)切割的胶块太大,多于400mg的凝胶即会导致DNA结合效率的降低。
Q2.后续酶切反应受到影响
A2.1)样品的高盐浓度抑制酶切。
这种情况下可使用W缓冲液洗脱两次。
2)样品包含残留的W缓冲液。
残留的乙醇抑制酶切反应。
3)不完全去除硅基质会降低后续酶切反应的活性。
因为基质有可能结合蛋白质。
质粒DNA提取操作常见问题 ↑TOP
Q1.质粒产量低
A1.1)您是否收集了足量细胞?
产量依赖于宿主类型。
过量的细胞也会导致产量降低。
2)您是否使用溶液I完全重悬了细胞?
不完全重悬会降低裂解的效率。
3)在溶液II,III或SB缓冲液中是否有盐沉淀?
涡旋或震荡使沉淀溶解。
离液盐浓度不适当会降低产量,
如果沉淀不易溶解,可加热到50℃。
Q2.染色体DNA污染(琼脂糖凝胶电泳时出现了非预期条带)
A2.在第4步,样品不应涡旋或剧烈震荡,裂解时间不应超过5分钟,否则均可能导致染色体DNA断裂污染样品。
处理裂解液时操作要轻缓。
Q3.琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮
A3.样品可能包含残留的W缓冲液。
样品中残留乙醇会导致漂浮。
必须使样品完全干燥但不能过干。
Q4.序列分析时出现太多背景条带
A4.您是否检查了宿主E.coli的内切酶活性?
HB101,JM系列及正常野生型宿主都有很高的核酸内切酶活性,通过降解质粒DNA干扰了测序反应。
这时应该增加第11步的孵育时间。
Q5.样品包含RNA
A5.收集的细胞太多。
我们推荐使用的细菌培养物体积要适当。
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