氯化1十六烷基3甲基咪唑对泥鳅胚胎的毒性效应资料.docx
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氯化1十六烷基3甲基咪唑对泥鳅胚胎的毒性效应资料
离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的毒性研究
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离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的毒性研究
摘要本研究以泥鳅的胚胎及仔鱼为试验材料,选择胚胎发育的五个不同时期(囊胚期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期和仔鱼孵出期)为开始处理时间,探讨了离子液体[C16mim]Cl的毒性作用。
结果表明:
随着[C16mim]Cl的浓度增加,泥鳅胚胎的孵化率下降,畸形率上升,具有明显的剂量-效应关系;随着[C16mim]Cl的浓度增加,泥鳅仔鱼死亡率上升,处理组的仔鱼体长均短于对照组,具有明显的剂量-效应关系。
结论:
[C16mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的发育,有明显的抑制、致畸、致死作用,表现出明显的毒性作用。
这可为[C16mim]Cl的合理使用提供依据。
关键词[C16mim]Cl,泥鳅,胚胎发育,毒性
StudyonToxicityof[C16mim]ClontheEmbryosandLarvaeofloach(Misgurnusanguillicaudatus)
AbstractInthispaper,weusedtheembryosandlarvaeofloach(Misgurnusanguillicaudatus)forthetestmaterials,choicedfivedifferentembryonicdevelopmentperiods(Blastulastage,Mid-gastrulation,Neurulastage,tailbudstageandlarvalfishhatchedperiod)asthebeginningoftheprocessingtime,studiedthetoxicityeffectof[C16mim]Clonloach.Theresultsshowed:
Withtheincreaseintheconcentrationof[C16mim]Cl,thehatchingratesofloachembryosweredeclinedandmeanwhileitsabnomalembryosrateswereincreased,hadobviousdose-effectrelationship.Withtheincreaseintheconcentrationof[C16mim]Cl,themortalityratioofloachlarvaewereincreased.Andthetreatmentgroupswereshorterthanthecontrolgroup,withsignificantdose-effectrelationship.Conclusion:
TheIonicLiquid(IL)of[C16mim]Clhadinhibitedthedevelopment,teratogenic,lethaleffectontheloachembryosandlarvae,showingobvioustoxicity.Therefore,itisnecessarytoprovideascientificbasisforthereasonableapplicationamountof.[C16mim]Cl.
Keywords[C16mim]Cl;Misgurnusanguillicaudatus;Embryonicdevelopment;Toxicity
前言
离子液体(ILs)是一类完全由离子组成的室温下呈液态的新型化学试剂,因其不挥发、不易燃和热稳定等优势,具有广阔的应用前景,曾被认为是环境友好的“绿色产品”[1,2]。
虽然离子液体无挥发性因而不会造成大气污染,但大部分离子液体是水溶性的,在合成和应用过程中,它们很可能通过诸如偶然的泄漏事件、化学工业的污水排放等途径进入地表水和地下水,从而对环境特别是水环境产生潜在的威胁[3,4]。
对一些离子液体对发光细菌、大型蚤、斑马鱼和淡水蜗牛的毒性效应的研究发现,离子液体毒性的决定性因素是阳离子,毒性随阳离子取代基碳链的增长而增加[5-7]。
因此,检测水体中[C16mim]Cl的指标具有重要的现实意义。
泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)为鲤形目、鲤形亚目、鳅科中的鳅属,分布较广,易于在实验室饲养;具有抗污能力强、对外源物质反应灵敏等特点;在毒性试验研究中,是理想的水生生物试验材料[8]。
本研究选用泥鳅的胚胎和仔鱼为试验材料,进一步探究了[C16mim]Cl的毒性影响旨在判断其对水生生物可能造成的危害,为有关生态风险评价提供参考依据。
1材料与试剂
1.1实验材料
泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)购于新乡市鸿达市场,体重22~30g,体长13~17cm,健康,性成熟个体。
1.2实验试剂
氯化1-十六烷基-3-甲基咪唑(1-hexadecyl-3-methylimidazoliumchloride;英文别名:
C16MIMCl;分子式:
C20H39ClN2;分子量:
343.01;纯度:
≥99%),购自上海成捷化学有限公司。
实验用水为曝晒3天以上的自来水,同时用增氧机增氧,pH在7.0左右,DO﹥5mg/l。
使用时,用四层纱布过滤处理。
1.3实验器材
奥林巴斯光学显微镜、解剖镜、柯达数码相机、Ф12cm培养皿若干、小吸管、烧杯、量筒等。
2实验方法
2.1受精卵的制备
在生殖季节,选取性成熟雌雄泥鳅。
雌雄泥鳅的选择参考文献[9-11]。
选择卵巢轮廓明显外观呈纺锤形的雌性泥鳅10尾,背部肌肉注射鱼用绒毛膜促性素(HCG)800IU/尾;雄性泥鳅5尾,注射剂量减半。
10~14h后,轻压雌鳅腹部,立即将卵收集于不同的培养皿中,干法受精[11,12]。
用干净毛巾擦干体表水,将雌鳅卵挤入培养皿中,并立刻进行雄鳅挤精,经羽毛搅拌约1-3分钟,使精液和卵粒混匀。
2.2实验设计
首先参照泥鳅成体的预试验结果,得到其成体的24hLC50为2.53mg/l;在此基础上,设计本实验的处理组浓度。
实验共分六组,包括五个处理组和一个空白对照组,处理组浓度依次为0.81mg/l、0.54mg/l、0.36mg/l、0.24mg/l、0.16mg/l,每组均设三个平行。
实验容器采用直径12×2cm的培养皿,每皿加入相应溶液100ml。
由于泥鳅的卵为粘性卵,所以直接采集在培养皿中;每个培养皿中留100枚发育正常卵,其余剔除。
实验温度约23℃,光暗比为16∶8。
试验采用静水换水法[13],每日更换一次试验溶液,及时剔除死亡个体。
处理分别开始于胚胎的囊胚期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期和仔鱼孵出期(泥鳅的胚胎发育分期的确定参照文献[9,12-14]),利用解剖镜连续观察其发育状况并及时拍照、记录。
处理组的前四组在孵化出仔鱼后终止实验,第五组(仔鱼孵出期)处理48h后终止实验。
在第五组中,挑取体长相近、健康状况良好的仔鱼,每个培养皿内放20尾,试验卵黄囊吸收后每天上、下午各投喂一次蛋黄粉。
孵化出仔鱼后的第三天,选取对照组的体长相近、健康状况良好的仔鱼放入培养皿中,每皿加入相应处理液100ml,各放仔鱼20尾,处理48h后终止实验。
观察记录指标主要包括:
胚胎发育进程中各组孵化率及畸形率(如死亡个体同时存在畸形,则计入死亡)、仔鱼的死亡率、体长、外部形态特征及行为反应等,并计算出相应的EC50或LC50、安全浓度。
2.3数据统计分析
所有数据均采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA),用最小显著差数法(LSD)进行多重比较,同时还利用了Excel2003进行分析作图,数据结果用平均数±标准差表示。
显著性差异以p值表示,p<0.05(*)表示差异显著;p<0.01(**)表示差异极显著。
[C16mim]Cl对泥鳅仔鱼的半致死浓度(LC50)的计算方法:
采用改进寇氏法(Karber)[8,15],该法要求:
①每个试验组动物数要相同;②各组剂量要按等比级数分组;③最小剂量的反应率(死亡率)p≤0.2,最大浓度反应率(死亡率)p≥0.8时,方能得到精确的结果。
计算公式如下:
lgLC50=Xm-i(Σp-0.5)S(lgLC50)=i√Σpq/n
式中:
m--lgLC50q--存活率
i--相邻两浓度组之对数浓度差值Σp--各浓度组死亡率总和
Xm--最大浓度的对数值n--每组动物数
p—死亡率(以小数表示)S(lgLC50)--标准误差
算得lgLC50±1.96S(lgLC50),求反对数可得到LC50值及95%可信限范围。
安全浓度的计算公式:
按Turabell公式Sc=48hLC50×0.3/(24hLC50/48hLC50)2求出安全浓度[16-18]。
3实验结果
3.1[C16mim]Cl对泥鳅胚胎孵化率、畸形率的影响
3.1.1囊胚期开始处理
图1[C16mim]Cl对泥鳅胚胎孵化率、畸形率的影响(囊胚期)
Fig.1Effectof[C16mim]Clonthehatchingrateandabnomalembryosrateofloachembryos
(Blastocyststage)
在囊胚期,用离子液体[C16mim]Cl处理泥鳅胚胎,以观察记录[C16mim]Cl对泥鳅胚胎发育的影响,结果如图1所示。
与对照组比较,随着[C16mim]Cl的浓度增加,胚胎孵化率下降,浓度为0.24mg/l、0.36mg/l、0.54mg/l、0.81mg/l的处理组显著下降(p<0.01),具有明显的剂量-效应关系;同时,[C16mim]Cl对泥鳅胚胎有明显的剂量-致畸效应关系,胚胎畸形率随[C16mim]Cl的浓度增加而上升,浓度为0.24mg/l、0.36mg/l、0.54mg/l、0.81mg/l的处理组变化极显著(p<0.01),其致畸的半数有效浓度(EC50)为0.437mg/l。
其胚胎的主要致畸症状表现有:
体态异常,如弯体、弓背或弯尾等;卵黄吸收异常,如卵黄膨大、崩解等;胚体浑浊或自行解体等(图版Ⅰ)。
3.1.2原肠胚中期开始处理
图2[C16mim]Cl对泥鳅胚胎孵化率、畸形率的影响(原肠胚中期处理)
Fig.2Effectof[C16mim]Clonthehatchingrateandabnomalembryosrateofloachembryos(Mid-gastrulationstage)
在原肠胚中期开始处理,结果如图2所示。
与对照组比较,浓度为0.54mg/l、0.81mg/l的处理组的孵化率变化显著(p<0.05),其他处理组的孵化率变化均不显著,即此时期处理对泥鳅胚胎孵化率影响不明显。
而随着[C16mim]Cl的浓度增加,[C16mim]Cl对泥鳅胚胎有致畸效应,0.36mg/l、0.54mg/l、0.81mg/l的处理组变化极显著(p<0.01),EC50为0.256mg/l。
此时期处理的胚胎主要致
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