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发酵工艺控制
2.1概述
一.发酵体系的主要特征
1.细胞内部结构和代谢反应的复杂性2.细胞所处环境的复杂性3.过程系统状态的时变性及参数的多样性和复杂性
影响因素多,有的因素未知,主要影响因素变化。
发酵水平主要取决于:
生产菌种的特性;对工艺条件的控制(适合程度)
必须了解:
菌体的生理代谢规律工艺条件对发酵过程的影响及其控制发酵过程的有关变化规律
常规发酵的工艺控制参数:
温度、pH、搅拌转速与功率、空气流量、罐压、液位、补料速率及补料量等。
二.发酵过程的参数检测
1.直接状态参数
指能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数
包括:
pH、DO、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2、黏度、基质和产物浓度、菌体浓度(OD、DCW、湿重)等
参数的检测
在线检测各种传感器:
pH电极、DO电极、温度电极、液位电极、泡沫电极
尾气分析仪:
测尾气O2和CO2含量
离线检测分光光度计、pH计、温度计、气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)、色质连用(GC-MS)等
2.间接状态参数
指利用直接状态参数计算求得的参数
包括:
比生长速率μ、摄氧率OUR、CO2释放率CER、呼吸商RQ、氧的得率系数YX/O、氧体积传质系数KLa、基质比消耗速率QS、产物比生成速率Qp等
综合各种状态参数,获得代谢过程的各种信息,从而对发酵过程做出相应的调整和控制,以获得最经济的发酵生产。
三.发酵过程的代谢调控和优化
1.代谢调控
以代谢(流)的调节最重要
调节酶的合成量,称为“粗调”调节酶的催化活性,称为“细调”
工艺控制和过程优化的实质,就是利用各种方法和手段,使细胞的外部和内部环境最适合基质和能量流向产物合成的生物途径,以获得最大的产量。
2.发酵过程优化的一般步骤
确定反映发酵过程的各种理化参数及其检测方法
研究这些参数的变化对发酵过程的影响及其机制,获得最佳的范围和最适的水平
建立数学模型定量描述个参数间随时间的变化关系,为过程优化控制提供依据
通过计算机实施在线自动检测和控制,验证各种控制模型的可行性及其适用范围,实现发酵过程的最优控制
2.2基质浓度对发酵的影响及其控制
先进的培养基组成是充分支持高产、稳产和经济的发酵过程的关键因素之一。
一.基质种类
一般包括:
碳源、氮源和无机盐
前体
二.基质(原料)的质量
随产地和生产工艺而异须保证稳定的原料质量尤其对有机碳源和氮源,经多次实验而定
三.基质浓度对发酵的影响
每一种基质都有一个适宜的浓度范围
基质浓度太低影响细胞的生长,不能保证足够量的菌体进行生产;延长发酵时间,降低生产效率
基质浓度太高菌体生长太旺盛,发酵液黏度很大,KLa很小,DO很低,影响发酵正常进行;影响产物形成:
如酵母利用葡萄糖进行培养,葡萄糖浓度太高,
将进行无氧发酵,产生乙醇,即为crabtree效应
又如葡萄糖氧化酶(GOD)发酵中:
低浓度下:
诱导作用高浓度下:
分解代谢物阻遏作用
浓度由8%→6%,酶活提高26%
以铵盐为氮源发酵:
NH4+浓度过高,产生铵离子效应,影响生长和合成
基质浓度的控制初始培养基中:
基质浓度适宜(由实验而定)
发酵过程:
通过补料操作来控制基质浓度
应根据菌体特性、工艺条件要求和发酵过程中代谢的具体情况,确定补料方式、速率和补料量。
2.3灭菌情况
灭菌温度高,时间长,对培养基破坏作用越大,影响菌体生长和产物合成。
如葡萄糖氧化酶(GOD)发酵中,灭菌温度比灭菌时间对产酶的影响更大。
一些易被高温破坏的成分如葡萄糖、前体等应该分消。
2.4种子质量的影响
种子的质和量对菌种生长的快慢和产物的合成存在重要的影响。
1.接种菌龄
菌龄指在种子罐中培养的菌体从开始培养至接种到下一级种子罐或发酵罐的这段培养时间
适宜菌龄以对数生长期的后期,即培养液中菌浓接近高峰时的种子较适宜
菌龄过小发酵前期生长缓慢,整个发酵周期延长,产物开始形成的时间推迟
菌龄过大菌量较多,生产能力下降,菌体过早自溶
最适的菌龄须多次实验,由发酵的结果而定
2.接种量
接种量指接(移)种的种子液体积与培养液体积之比
适宜的接种量与菌体的特性(生长繁殖速度)及发酵工艺有关
常用接种量:
5%~10%
抗生素生产:
20%~25%,甚至更大
较大的接种量:
可缩短生长达到高峰的时间,使产物合成提前,减少杂菌生长的机会
接种量太小生长延迟期延长,发酵周期长,产物形成较迟,生产效率降低
接种量过大生长过快,发酵液黏度增加,溶氧不足,影响产物合成
2.5温度对发酵的影响及其控制
菌体生长和产物合成都是在各种酶的催化下完成的,温度是保证酶活性的重要条件,因此在发酵过程中维持稳定而合适的温度就显得十分重要。
一影响发酵温度的因素
1发酵热
发酵热是指发酵过程中释放的净热量,Q发酵[J/(m3·h)]
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射
生物热Q生物:
菌体在生长繁殖过程中产生大量的热称为生物热;由生物大分子(碳水化合物、脂肪、蛋白质)分解为小分子(CO2、NH3、H2O等)而产生的;一部分用于合成高能化合物、菌体合成、维持代谢、产物合成,其余以热的形式释放出来;
搅拌热Q搅拌:
好气培养中由于搅拌作用而产生的热量
蒸发热Q蒸发和显热Q显:
由于发酵液中水分的蒸发带走的热量为Q蒸发
由尾气的排出带走的热量为显热
辐射热Q辐射:
由于罐内外温差,发酵液中通过罐体向外辐射的热量
抗生素生产的最大发酵热:
3000~7000×4.19kJ/(m3·h)
为了维持一定的温度,须采取相应的措施:
在蛇管或夹套内,通入冷却水(或热水)进行冷却(或加热)。
影响生物热的因素
1培养基成分越丰富2菌体对基质的利用速率越大3发酵过程中代谢越旺盛》生物热越大
抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号,说明抗生素合成时菌体的代谢十分旺盛
生物热与呼吸强度存在对应关系
二温度对菌体生长的影响
最适生长温度和耐受范围各异,跨度一般为30℃
1温度对菌体生长的影响
温度对菌体生长和死亡的影响
菌体的生长速率:
dX/dt=μX-αX(2-1)
式中μ为比生长速率,α为比死亡速率
温度对μ和α的影响可以用Arrennius方程表示:
lnμ=lnA-Ea/RT(2-2)
lnα=lnA'-E'a/RT(2-3)
式中A和Ea分别为Arrennius常数和活化能,R和T分别为通用气体常数和绝对温度
典型活化能Ea:
50~70kJ/mol
死亡活化能E'a:
300~380kJ/mol
若发酵温度从T1提高至T2(温差△T=T2-T1),菌体的μ的变化可由式(2-2)得:
ln(μ1/μ2)=-Ea/R(1/T1-1/T2)
=-(Ea/R)×△T/(T1T2)(2-4)
同样可得:
ln(α1/α2)=-(E'a/R)×△T/(T1T2)(2-5)
由于E'a>Ea,因此比死亡速率α的变化大于比生长速率μ的变化,即温度对具有高活化能的死亡速率的影响远大于具有较低活化能的生长速率;
菌体的生长必须保持在一定的温度范围,若超过这个范围,菌体就生长不好,甚至无法生长
又如青霉素发酵中:
生长的Ea=34kJ/mol
合成的Ea=112kJ/mol
说明青霉素合成速率对温度更敏感,可以采用变温发酵来提高青霉素的合成;
温度对得率系数YX/S的影响
在酵母的培养中:
温度上升,得率系数YX/S随之下降;维持所需的能量增加;维持活化能:
50~70kJ/mol;T最大转化率略低于T最适生长
温度对细胞代谢的影响
温度升高,μ增大,生物大分子的比例也增大
重组蛋白生产:
T由30℃升高到42℃,以诱导产物的形成。
温度对细胞脂质成分的影响
温度降低,脂质成分不饱和程度增加,不饱和脂肪酸的含量增大
三温度对发酵的影响
温度对生长和生产的影响是不同
T↑,酶反应速率↑生长代谢加快,生产期提前
T↑,酶易因过热而失活,菌体容易衰老,发酵周期缩短,影响最终产量
T变化,改变发酵液的物理性质,氧的溶解度基质的传质速率菌体对养分的分解和吸收速率影响产物的合成
温度还会影响生物合成的方向
金色链霉菌培养中:
T≤30℃,合成金霉素
T≥35℃,合成四环素
利用温度对代谢的调节作用
氨基酸合成途径的终产物对第一个酶具有抑制作用,且:
低温(20℃)下>生长温度(37℃)下
抗生素发酵中:
后期降低温度,使蛋白质和核酸合成途径关闭早些代谢转向产物合成途径
四最适温度的选择
●根据菌种及生长阶段选择
最适生长温度与最适生产温度往往不同
■微生物种类不同,所具有的酶系及其性质不同,所要求的温度范围也不同
■在发酵前期由于菌量少,发酵目的是要尽快达到大量的菌体,取稍高的温度,促使菌的呼吸与代谢,使菌生长迅速
黄原胶发酵:
前期生长温度:
24~27℃;
中后期黄原胶形成温度:
30~33℃
20~25h进行变温,产胶量提高20%
●根据培养条件选择
最适温度的选择应参考其他发酵条件,灵活掌握
◆供氧条件供氧较差
温度降低→生长速率小→发酵液较稀→提高DO
◆培养基的成分和浓度较稀或较易利用
温度提高→养分耗竭早→菌丝自溶早→产量降低
红霉素发酵:
提高温度
黄豆饼粉培养基效果>玉米浆培养基效果
红霉素发酵:
0~30h:
温度较高,促进生长
30~150h:
稍低温度,维持较长产素期
150h后:
升温,促进抗生素分泌
青霉素发酵:
0~5h:
30℃→5~40h:
25℃→40~125h:
20℃
→125~165h:
25℃
比25℃恒温培养,产量提高15%
最适发酵温度应根据具体的菌种特性和发酵条件来确定,以利于产物的最大生产
2.6pH对发酵的影响及其控制
pH是微生物代谢活动的综合指标,是发酵过程非常重要的状态参数
一发酵过程pH变化规律
●不同微生物的最适pH范围不一样
最适pHpH上下限
细菌和放线菌:
6.5~7.55.0~8.5
酵母菌:
4.0~5.03.5~7.5
霉菌:
5.0~7.03.0~8.5
生长pH跨度:
3~4个pH单位最佳生长pH跨度:
0.5~1
生长最适温度高的菌种,其最适pH也相应高
●微生物生长和产物合成的最适pH通常不一样
菌种特性产物化学性质
抗生素合成的最适pH:
链霉素和红霉素:
6.8~7.3,中性偏碱
金霉素和四环素:
5.9~6.3
青霉素:
6.5~6.8
柠檬酸:
3.5~4.0
●发酵过程pH是变化的
■糖代谢特别是快速利用的糖,分解成小分子酸、醇,使pH下降。
糖缺乏,pH上升,是补料的标志之一
■氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降;尿素被分解成NH3,pH上升,NH3利用后pH下降,当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。
■生理酸性、生理碱性物质利用后pH会下降或上升;
■产物形成某些产物本身呈酸性或碱性,使发酵液pH变化
■菌体自溶,pH上升,发酵后期,pH上升
●pH的变化对发酵过程
各种酶的活性菌体对基质的利用速率细胞的结构影响生长和产物合成
二发酵过程最适pH的选择
选择的准则:
获得最大的比生长速率,适当的菌量,最高产物产量
利福霉素B生产:
生长期pH:
6.5
生产期pH:
7.0,平均产物得率系数最高
比全程pH维持在7.0产率提高14%
三发酵过程最适pH的控制
■调节好基础料的pH基础料中若含有玉米浆,pH呈酸性,必须调节pH。
若要控制消后pH在6.0,消前pH往往要调到6.5~6.8
■在基础料中加入维持pH的物质如CaCO3,或具有缓冲能力的试剂,如磷酸缓冲液等
■通过补料调节pH在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。
在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH:
(1)调节补糖速率,调节空气流量来调节pH
(2)当NH2-N低,pH低时补氨水;当NH2-N高,pH高时补(NH4)2SO4
■当补料与调pH发生矛盾时,加酸碱调pH
2.7溶氧对发酵的影响及其控制
1.氧的溶解度及溶氧检测方法
●氧的溶解度氧的溶解度很低28℃,发酵液中100%DO:
7mg/LDO易成为限制因素与供氧(搅拌)、需氧状况有关
●溶氧的检测测氧覆膜电极
■极谱型电极外加0.7V稳压电源白金和银-氯化银电极
■原电池型电极自身产生一定电流银-铅电极
经得起高压蒸汽灭菌(130℃,1h)漂移不大于1%/d精度和准确度在±3%
2.临界氧及发酵过程溶氧变化规律
●溶氧浓度单位
■氧分压或氧张力(DOT)大气压或毫米汞柱100%DO,DOT=159mmHg汞柱医疗单位
■绝对浓度mgO2/L或ppm,Winkler氏化学法测定环保单位
■相对浓度空气饱和度百分数,发酵行业反映菌体生理代谢变化和对产物合成的影响
●溶氧电极的标定
接种前进行标定
方法:
在一定的温度、罐压和通气搅拌下以消后培养基
被空气饱和为100%作为基准
●临界氧
呼吸临界氧指不影响细胞呼吸所允许的最低溶氧浓度
对产物:
指不影响产物合成所允许的最低溶氧浓度两者一般不同
测定
■呼吸临界氧可用尾气O2含量变化和通气量测定或用电极测定
■产物合成的临界氧维持氧在一定的范围,考察不同DO浓度对合成的影响
临界氧呼吸合成
卷须霉素13%~23%8%
头孢霉素5%~7%10%~20%
●溶氧变化可反映菌体的生长生理状况
初期DO开始下降:
1~5h对数生长期DO明显下降,并出现一低谷
如抗生素:
10~70h出现DO低谷土霉素:
10~30h卷须霉素:
25~30h赤霉素:
20~60h红霉素:
25~50h
二次生长DO先上升,后下降生长衰退或自溶DO上升
■DO并非越高越好
过高的DO对生长不利,
甚至产生有害作用:
形成新生O、O2-、O22-或OH-
破坏细胞的组成
生产次级代谢产物,须控制生长不过量
3.溶氧可作为发酵过程异常的指示
●有些操作故障或事故引起的溶氧变化
1搅拌问题2空气与液体未能充分混合3一次加油过量》》》DO下降
●补料是否得当引起的溶氧变化
补料过密或补料量过多DO不足,出现“发酸”现象
■“发酸”指DO不足,产生乙醇,与代谢中的有机酸反应,形成一种带香味的酯类物质的现象
●污染杂菌DO异常在短时间内跌至零(2~5h);长时间内不回升;也有染菌后,DO升高
●作为质量控制指标
■天冬酰氨酶发酵前期好气培养,后期厌气培养;DO降为45%,培养方式转变;酶活力提高6倍
■酵母或其他菌体生产溶氧分压高于0.03×105Pa,进行同化作用;溶氧低,出现糖的异化作用生成乙醇;酵母产量减产
4.溶氧参数在发酵过程控制方面的应用
●控制原理补糖后,代谢增加,DO下降;碳源不足,呼吸减小,DO上升;利用DO并结合其他参数进行补料控制
●青霉素发酵的过程控制利用DO、pH、尾气O2和CO2进行补料控制
原则:
加糖速率正好使菌体处于半饥饿状态,仅能维持菌的正常生理代谢,把更多的糖用于产物合成,且其摄氧率不超过设备的供氧能力KLa
控制系统:
带氧电极的直接类比的加糖系统
方法:
按DO、KLa、菌的需氧之间的变化决定补糖速率的增减;DO高于控制点,糖阀开大,使DO下降;DO低于控制点,加糖速率减小,使DO上升
优点:
DO控制更符合要求;达到控制参数所需时间缩短;克服由于种子质量的不稳定导致的产量波动;及时调节搅拌与通气已克服出现的干扰
缺点:
前期只能人工控制
5.溶氧的控制溶氧的变化是氧的供需不平衡的结果
●供氧方面
dC/dt=KLa(C*-CL)(2-6)
式中,dC/dt为溶氧浓度变化,KLa为氧体积传质系数,KL为氧传质系数,a为气液比表面积,C*为罐内氧分压下在水中的饱和浓度,CL为发酵液中的溶氧浓度
能提高KL、a和C*的措施,就能提高DO
■提高C*的措施提高氧分压,通入纯氧或富氧;提高罐压:
但CCO2浓度也增加,影响代谢;增加通气速率:
增加液体中的气体含量;但易使泡沫大量增加,引起逃液
■提高KLa的措施
提高搅拌转速:
较低转速下,效果明显
如赤霉素发酵15~50h,DO降为10%155r/min→180r/min,DO提前24h回升158h发酵单位达到对照180h水平,产量提高15%
搅拌器的结构:
搅拌器类型:
封闭式、开放式;叶片形状:
弯叶、平叶、箭叶;挡板数和挡板宽度;搅拌器直径/罐直径;搅拌挡数和位置
发酵液黏度:
加无菌水控制补料速率及补料量
●需氧方面
摄氧率r=QO2X(2-7)
式中r为摄氧率,QO2为呼吸强度,X为菌体浓度
需氧与菌种、培养基、温度、补料等条件有关
■培养基养分的丰富程度限制养分的供给,减少菌的生长速率;限制对氧的消耗,提高DO;从总的经济情况,有利于提高生产能力
■温度的影响降低温度,可以增加氧的溶解度;由于C*增加,提高DO;
溶氧只是发酵过程的参数之一,必须配合其他参数,才能对发酵过程进行调控,达到增产节能的目标
2.8二氧化碳和呼吸商
CO2是呼吸和分解代谢的终产物发酵过程产生大量的二氧化碳
1.二氧化碳对发酵的影响
●CO2可作为某些产物合成的基质
精氨酸合成:
其前体氨甲酰磷酸合成需要CO2作为基质
化能营养菌:
能以CO2作为唯一碳源利用
异养菌:
在需要时可利用补给反应固定CO2
●溶解的CO2对菌体生长的影响
CO2对生长有直接的影响
如尾气中CO2浓度高于4%:
碳水化合物的代谢和菌体的呼吸速率下降
溶解的CO2浓度达到1.6×10-2mol:
严重抑制酵母的生长
进口CO2含量达到80%:
酵母的活力只为对照值的80%
生长受到CO2的抑制
阻遏基质的异化及ATP的生成影响产物的合成
●溶解的CO2对氨基酸、抗生素合成有抑制或刺激作用
■组氨酸发酵CO2浓度大于0.05×105Pa;产量随CO2分压的增大而下降
■精氨酸发酵最适CO2分压:
0.125×105Pa;高于此值,对合成存在较大影响
■青霉素发酵CO2分压:
0.08×105Pa;比合成速率降低40%
■紫苏霉素合成进口CO2含量为1%和2%时;产量为对照的2/3和1/7
●CO2对细胞的影响
■CO2对细胞形态的影响
产黄青霉:
不同CO2浓度,菌丝形态也发生变化
CO2分压菌丝形态
0~8%丝状
15%~22%膨胀、粗短
0.08×105Pa球状、酵母状合成受阻
■CO2对细胞的作用机制
CO2和HCO3-都会影响细胞膜的结构
▲溶解的CO2:
细胞膜的脂肪酸核心部位
▲HCO3-:
磷脂、亲水头部带电荷表面、膜表面上的蛋白质
CO2浓度达一临界值
膜的流动性;膜表面电荷密度;基质的膜运输受阻;细胞处于“麻醉”状态;形态发生变化;抑制细胞生长
●工业发酵中CO2的影响
罐高10m,气压1.01×105Pa;罐底CO2分压是罐顶的2倍;排除CO2的影响;综合考虑CO2的溶解度、温度及通气状况
2.呼吸商与发酵的关系
●呼吸商RQ
OUR=QO2X(2-7)
CER=QCO2X(2-8)
RQ=CER/OUR(2-9)
OUR和CER可用进出口气体中O2和CO2浓度计算
尾气中O2浓度和CO2浓度变化呈反向同步关系
●呼吸商RQ与发酵过程的代谢途径的关系
■RQ反映菌体的代谢情况
RQ=1.0:
糖代谢遵循有氧代谢途径,仅供生产,无产物生成
RQ﹥1.1:
遵循EMP途径,生成乙醇RQ=0.93:
生成柠檬酸
RQ﹤0.7:
生成的乙醇被当作基质利用
■利用不同基质及发酵不同阶段,RQ值不同
大肠杆菌/丙酮酸葡萄糖甘油
RQ1.261.000.80
青霉素生产/生长维持生产
RQ(理论值)0.9091.004.0
产物还原性比基质大,RQ值增加;产物氧化性比基质大,RQ值减小
RQ测定值明显低于理论值说明存在不完全氧化的中间代谢物和葡萄糖以外的碳源,比如油等
油主要用于控制生长,并作为维持和产物合成的碳源
2.9补料对发酵的影响及其控制
补料的作用是及时供给菌体合成产物的需要
1.补料的策略
●补料的方法
一次性大量补料;多次少量;连续流加;快速、恒速、指数、变速
抗生素生产:
多次少量
补料培养基成分单一成分
多组分补料
●补料速率的优化
■依据菌体对养分的消耗速率及所设定的最低维持浓度
■方法
▲连续培养方法
产黄青霉不同μ下:
C、N、O、P、S、乙酸盐,
最适生长所需的各种基质补料速率
▲模型法
青霉素发酵
建立菌体生长、产物合成和基质消耗模型,优化不同设备供氧能力的补料速率
不论KLa的大小,都有一最佳补料速率
补料速率的最佳点与KLa有关
KLa大,补料速率加大,产量提高;KLa小,补料速率减小,达到相应最高水平
▲间歇补糖
黄原胶发酵
以间歇补糖方法;生长期:
葡萄糖含量控制在30~40g/L;维持较高的葡萄糖传质速率;提高比生产速率;发酵96h达43g/L
2.补料的依据和判断
●补料的依据
菌的形态、糖浓度、DO浓度、尾气中的氧和CO2含量、摄氧率、RQ的变化等
一般以发酵液中的残糖浓度为补料依据
次级代谢产物,控制还原糖浓度在5g/L
■以其他指标做依据
纤维素酶生产:
监控CO2的生成进行控制
现代酵母生产:
测量尾气中的微量乙醇控制糖蜜的流加
■不同的补料方式会产生不同的效果
大肠杆菌培养(通过补料):
控制DO不低于临界值,菌体浓度﹥40g/L;控制pH值,有利提高产率;控制生长速率适中,有利提高菌体浓度和产率
谷氨酸发酵:
补料速率用摄氧率控制
使补料速率与基质消耗速率相等
摄氧率OUR与糖耗速率qsX的关系:
K=OUR/qsX=耗氧量/糖耗(2-10)
由K和OUR估算糖耗
K理论值为1.5,最佳值为1.75
计算:
K=1.51,糖耗估算过高,补糖过量;K=2.16,糖耗估算过低,补糖不够;K=1.75,加糖速率与糖耗速率相当
青霉素发酵:
通过补料控制生长和氧耗
生长期:
补糖过量,酸的积累和供氧不足;补糖不足,有机氮当作碳源,pH上升和菌量失调;控制补糖,维持一定范围的DO和pH;菌体处于半饥饿状态
生产期:
DO比pH的影响更大,主要控制DO
补料控制的依据:
糖、CO2、pH的相关性作为补料控制的参数;尾气CO2中的变化比pH更敏感
测定尾气CO2的CER来控制补糖速率
前体苯乙酸的补加:
少量多次补加;控制在亚水平;高产菌种399#:
0.3g/L;菌种RA18:
1.0~1.2g/L
3.比生长速率作用和控制
μ是生物
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