重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达鉴定资料.docx

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重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达鉴定资料

重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定

【摘要】目的：

利用PCR技术[1]扩增hIL-8 cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。

方法：

PCR技术扩增hIL-8 cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。

结果：

带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。

结论：

hIL-8成功在大肠杆菌中表达。

【关键词】hIL-8， PCR ，重组DNA

【Summary】Purpose：

ConnectingthehIL-8cDNAwhichisamplificatedusingPCRtechnologywiththeplasmidofprokaryoticexpressionvectordigestedpKpL3a（includingPLpromoter）,anddetectingtheexpressionandidentificationofrecombinanthIL-8inE.coli。

Method：

GettargetgenebyamplificatinghIL-8 cDNAusingPCRtechnology.ExtracttheE.coliplasmid.ConnectthetargetgenewithE.coliplasmidpKpL3aexpressionvector.TransformrecombinationDNAintoE.coliPop2136,andregulategeneexpressionofexogenoususingthetemperature-sensitiveλrepressorprotein,thendetecttheexpressionlevelsbyELISAreaction。

Result：

RecombinantplasmidPKpL3awithhIL-8geneissuccessfullytransformedintoE.coliPop2136andexpressesIL-8.TheexpressionleveloftheIL-8isdetectedbyELISAreaction.Conclusion：

hIL-8issuccessfullyexpressedinE.coli. 

【Keywords】hIL-8， PCR ，RecombinationDNA

白细胞介素8（Interleukin-8）是一种具有趋化作用的细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。

另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。

天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产[2]。

本实验通过PCR获得IL-8的c-DNA，将其连接于原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）中，用温度诱导表达技术使外源基因得以表达。

1材料与方法

1.1材料试剂

⑴模板（cDNA文库，CLONTECH公司）；大肠杆菌（含pKpL-3a质粒）；

⑵上游hIL-85ˊ引物（agt gct aaa gaa ctt aga tgtTm=56℃，由Takara公司合成）；

下游hIL-83ˊ引物（ccg tct aga tta tga att ata agc cct ctTm=56℃，由Takara公司合成）；

⑶酚-氯仿-异戊醇；NaAc；70％乙醇，无水乙醇；

⑷缓冲液A（50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl，pH8.0）；碱溶液；乙酸缓冲液；TE缓冲液；RNA酶A溶液；

⑸TAE电泳缓冲液；GEBS样本液；溴化乙锭；

⑹LA培养基；LA培养皿；100mMCaCl2；

⑺包被抗体（抗IL-8单克隆抗体）；酶标抗体（酶标记IL-8单克隆抗体）；标准品（rHuIL-8，200ng/ml）；包被缓冲液（Ph9.60.05MCBS）；抗体稀释液（pH7.20.01MPBS）；洗涤液（pH7.20.15MPBS）；稀释液（pH7.20.15MPBS）；封闭液（牛血清白蛋白）；底物液（A液：

TBM，B液：

3％H2O2）；终止液（2mol/LH2SO4）

⑻工具酶

TaqDNA聚合酶及其buffer：

北联生物医学工程公司；

dNTPmix：

Takara公司；

Klenow酶：

北联生物医学工程公司，1U/μl；

内切酶StyⅠ、XbaⅠ：

Takara公司，﹣20℃保存；

T4 DNA连接酶及其buffer：

Takara公司

1.2仪器

PCR仪，微量加样器（20μl、200μl、1000μl），台式高速离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，37℃孵箱，酶标仪，一次性酶标板

1.3实验方法

⑴PCR技术扩增[3]hIL-8cDNA

①在0.2ml反应管中加入下列成份：

ddH2O 4μl、10×buffer 5μl、dNTPmix 5μl、模板2μl、5ˊ引物2μl、3ˊ引物2μl、Taq酶10μl，构建总量为20μl的反应体系。

②在设定好的PCR仪上进行反应（95℃，3分钟；95℃，30秒；52℃，30秒；72摄氏度，30秒），反应35轮，72℃，6分钟。

③反应结束后取出8μl进行琼脂糖凝胶电泳，向管中余下的12μl反应体系中加入Klenow酶 1μl，室温30分钟，以修平扩增片段的3ˊ末端。

④转至1.5ml离心管中，加入50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，离心10000rpm，30秒。

⑤吸取上层清液，转至另一已加入5μl 3M NaAc的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，-20℃放置30min。

⑥离心10000rpm，5分钟，弃上清，加入0.5ml 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟，弃上清，空气中干燥，溶于20μl TE。

⑵质粒提取 

①从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。

取菌液1ml转至Eppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。

②加入200μl缓冲液A，充分混悬细菌。

③加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。

④加200μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。

⑤离心10000rpm，2分钟，上清转至另一Eppendorf管中。

⑥加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时。

⑦离心10000rpm， 5分钟，弃上清，加入70%乙醇0.5ml。

勿混匀，离心10000rpm， 5分钟，弃上清，干燥。

⑧加入50μl TE，使质粒溶解，酶切备用。

⑶限制性内切酶消化 

①取两个Eppendorf管分别标记A、B后加入以下试剂，A管：

ddH2O 14μl 、10×M buffer 2μl、0.1%BSA 2μl、PCR产物1μl、XbaⅠ1μl；B管：

ddH2O 16μl 、10×H buffer 2μl、质粒DNA 1μl、StyⅠ1μl。

②37℃水浴45分钟。

③A管中加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心2分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底30min，10000rpm 离心5分钟，弃上清，500μl 70%乙醇洗一次，10000rpm 离心2分钟，弃上清，干燥，加20μl TE进一步用于连接反应。

④B管中加入1μl Klenow酶、2μl dNTPmix，室温放置30分钟。

加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心 5分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时，10000rpm 离心5分钟，弃上清，500μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。

将沉淀溶于15μl水中，加入2μl 10×M buffer、2μl  0.1%BSA、1μl XbaⅠ，37℃水浴30分钟。

⑤B管加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 离心5min，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底30min，10000rpm 离心5min，弃上清，500μl 70%乙醇洗涤一次，干燥，加20μl TE，进一步用于连接反应。

⑷ DNA琼脂糖凝胶电泳 

①0.8%琼脂糖凝胶板的：

取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3min，将其冷却至55℃-65℃，倒入制胶槽中。

②充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。

③DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。

④稳压电泳80v约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5V/cm。

⑤取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。

⑥在凝胶成像仪观察结果。

⑸ DNA连接 [4]

①在Eppendorf管中加入下列物质进行连接反应：

H2O 9.5μl、10×T4 DNA连接酶buffer 2.5μl、pKpL3αDNA 7μl、IL-8 PCR产物5μl、T4 DNA连接酶1μl。

②置16℃水浴反应过夜。

③65℃水浴15分钟，灭活T4 DNA连接酶，用于转化。

⑹ 转化 

①将无质粒大肠杆菌pop2136接种于1ml LB培养基，37℃培养3-5小时。

②待OD600=0.4时，转移至Eppendorf管中，离心8000rpm ，2min，弃上清。

③加200μl 100mM Cacl2，混匀，置冰浴30分钟。

④加10μl连接好的质粒DNA，混匀，置冰浴30分钟。

⑸37℃水浴2分钟，冰浴2分钟。

⑥加入1ml LB培养基，37℃培养20min。

⑦取出100μl涂于LA培养皿上，37℃倒置培养过夜。

⑧检查转化菌是否生成（只有转化的细菌才能在平皿上生长）。

⑺细胞因子的测定—ELISA双抗体夹心法 

①包被：

将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，放置湿盒中，4℃ ，过夜。

②封闭：

洗板3次，加封闭液，200μl/孔，放置湿盒中，37℃30min。

③待检样本：

洗板3次，加入待测样品，阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，放置湿盒中，37℃30min。

④加酶标抗体：

洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，放置湿盒中，37℃30min。

⑤显色：

洗板3次，加入显色液，A液一滴，B液一滴。

室温或37℃显色5-10min。

⑥加终止液一滴。

⑦酶标仪测450nm处OD值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。

2结果

2.1DNA琼脂糖凝胶电泳见图1

1组2组3组4组

图1 DNA琼脂糖凝胶电泳图

注：

PCR Products:

228bp

本小组为第1组，扩增结果显示一致的扩增区带，PCR产物与设计的228bp相符，并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。

2.2转化结果见图2

本小组为第1组，转化结果显示，LA培养基上培养出散在的透明菌落，说明目的基因hIL-8cDNA与质粒表达载体pKpL-3a的连接是成功的。

2.3 ELISA双抗体夹心法检测IL-8含量所测OD值和标准曲线见表1和图3

表1 450nm处OD值

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

B

0.173

0.108

0.116

0.104

0.099

0.099

0.102

0.113

标准品1

C

0.141

0.122

0.158

0.104

0.11

0.102

0.094

0.098

标准品2

D

0.128

0.125

0.121

0.083

样品1

E

0.149

0.125

0.119

0.152

样品2

F

0.395

0.394

+对照

G

0.082

0.094

-对照

H

线性方程为y＝255.09x－24.502

样品组的4个浓度分别为：

C1＝255.09×0.128－24.502＝8.14952；

C2＝255.09×0.125－24.502＝7.38425；

C3＝255.09×0.121－24.502＝6.36389；

C4＝255.09×0.083－24.502＝－3.32953（负值舍去）

待测样品的浓度值为C＝（C1＋C2×2＋C3×4）/3＝16.12ng/ml

3讨论

3.1设计的原理及意义

⑴PCR[5]是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。

是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，由DNA聚合酶催化，按照半保留复制的原则合成两个子代DNA双链。

反应过程为[6]①变性：

将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的DNA称为模板）；②退火：

将温度降至引物的Tm值以下（55℃左右），5ˊ端和3ˊ端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合；③延伸：

将温度升到75℃左右，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种dNTP，从引物3ˊ-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链[7][8]。

⑵在含质粒的大肠杆菌混悬液中加SDS和NaOH，使菌体充分裂解，并使蛋白质和染色体DNA变性，加醋酸钾使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存于上清中，异丙醇可使质粒DNA沉淀，即可用于内切酶消化。

在某些情况下，需要用酚-氯仿-异戊醇去除残留的蛋白质。

⑶限制性内切酶是一群从原核细胞提取的DNA酶，不同的内切酶能够特异性地识别不同的核苷酸序列，并在一定部位切割双链DNA的磷酸二酯键，内切酶是基因组中重要的工具酶。

⑷琼脂糖是一种从海藻中提取的长链状糖类多聚物,为白色的小颗粒或粉末状。

在水中加热到90-100℃，3-5分钟融化成清亮的液态,缓慢降温至45℃，即可形成内部有孔隙半固体状凝胶。

可以根据需要配制一定的浓度。

DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。

因此，利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。

⑸T4噬菌体DNA连接酶（T4DNA连接酶）最早从T4噬菌体感染的大肠埃希菌中发现并分离出来，能催化一个DNA片段的3ˊ-OH与另一个DNA片段的5ˊ-P之间形成磷酸二酯键，其底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端，基因工程中常用。

在本实验中，将表达载体pKpL-3aDNAStyⅠ切，Klenow补齐，XbaⅠ切和IL-8cDNA的PCR产物用XbaⅠ切割后，重新用T4连接酶连接，可将人IL-8cDNA片段插入pKpL-3a质粒中构建成表达人重组IL-8的质粒克隆。

⑹体外构建的重组DNA分子需要导入合适的受体细胞才能进行复制扩增或表达。

不同的重组DNA分子需要在适当的受体细胞中扩增、表达，因此应选择不同的导入方法。

转化是指将质粒载体的重组DNA分子导入细菌（原核细胞）的过程。

感受态细胞氯化钙转化法：

感受态细胞是指处于能摄入外源DNA的这种生理状态的细胞。

①用低渗氯化钙溶液在0-4℃条件下处理快速生长期的细菌，使细菌细胞壁和膜的通透性增加，处于感受态；②然后加入重组DNA或质粒DNA,通过42℃热激45~90s，促使DNA分子进入细胞内。

由于不同的细菌带有不同的抗生素抵抗基因（本实验质粒均带有氨苄青霉素抵抗基因），根据转化菌的耐药特性，可将其与非转化菌区别。

⑺在含有λ噬菌体调控序列（如PL启动子）的原核表达载体表达外源基因时，可通过温度诱导表达技术控制外源基因的表达。

本实验选用温度诱导表达技术表达人IL-8,在原核表达载体pKpL-3a上带有PL启动子，大肠杆菌pop2136带有C1857基因，编码温度敏感性。

λ阻遏蛋白。

30℃培养时，λ阻遏蛋白保持活性，抑制PL启动子的转录，外源基因不能表达，细菌得以正常生长；在细菌充分扩增后，42℃培养，使λ阻遏蛋白失活，PL启动子失去抑制，外源基因得以表达。

⑻采用两株识别不同表位的IL-8单克隆抗体，其中一株作为包被抗体，以识别和结合待检测标本中的IL-8，另一株作为酶标抗体，与结合于包被抗体的IL-8的另一表位结合，并催化底物显色，根据标准品OD值绘制标准曲线，从而计算出待检标本中IL-8的含量。

ELISA实验中常用的酶为辣根过氧化物酶，显色方法为联苯胺法，联苯胺如DAB和四甲基联苯胺TMB能被过氧化物酶分解过氧化氢所产生的氧所氧化，形成有色多聚体沉淀，其中DAB被氧化为棕褐色沉淀，TMB被氧化为深蓝色沉淀。

3.2阳性/阴性结果的意义及其原因

⑴mRNA的合成分为以下阶段，转录起始复合物在启动子部位形成→RNA链随着转录泡的移动得以延长→DNA模板终止信号控制使转录停止→初级转录物加工后成熟；蛋白质的合成分为以下阶段，起始形成翻译起始复合物→加氨基酸经过进位、成肽和转位进行延长→终止密码子导致合成停止。

这意味着，基因指导蛋白质的合成是一个复杂有序的过程。

基因的特殊结构在这一过程中起到重要作用。

人编码IL-8的基因序列包含有启动子、调控序列、关键序列以及终止子，其中关键序列是真正编码IL-8的基因序列，共219bp，在PCR扩增进行引物设计时，关键序列是决定引物设计的重要部分。

引物的设计原则是①引物长度要合适，一般为16～30个核苷酸，常用20bp左右；②引物的碱基组成和特异性，G+C含量一般占40％～60％，有利于引物与模板的结合；③引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构；④引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引物3’端最佳碱基选择是G和C；⑤引物的5’端可以修饰，如：

引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等。

本实验在3’断引物的5’断加入了XbaⅠ酶切位点以及保护性碱基，共9bp，与目的基因关键序列的219bp共228bp，这也是琼脂糖凝胶电泳检测扩增的IL-8DNA产物条带在228bp处的原因。

⑵体外构建的重组DNA分子需要导入合适的受体细胞才能进行复制扩增或表达。

不同的重组DNA分子需要在适当的受体细胞中扩增、表达，因此应选择不同的导入方法。

①转化——重组DNA向细菌细胞转入，有感受态细胞氯化钙转化法和电击转化法（高压电穿孔法）；②转染——是指将噬菌体载体或病毒载体的重组DNA分子引入真核细胞的过程，有磷酸钙沉淀法（DNA/磷酸钙共沉淀法）、二乙氨乙基DEAE-葡聚糖法、电穿孔转染法、显微注射法和脂质体介导法；③感染——是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞，是目的基因得以复制繁殖的过程。

本实验采用转化的方法，将重组DNA分子转入到原核大肠杆菌中，进行筛选鉴定，大肠杆菌治质粒带有抗氨苄青霉素的基因，当带有完整耐药性基因的载体转化无耐药性细胞后，转入载体的细胞获得耐药性，能在含相应抗生素的培养板上生长成菌落，而未被转化的细胞不能生长。

本实验经LA培养基培养转入重组DNA的大肠杆菌后，结果显示有散在的透明菌落，说明有含有抗氨苄青霉素基因的细菌生长，从而可以根据重组载体的遗传表型进行重组DNA的筛选。

⑶酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）--待测抗体（抗原）--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

本实验标准品的OD值与阳性对照相比偏小，而且数值整体不理想，经分析，可能为如下原因：

1）标本因素：

血清或血浆中残留的凝块或红细胞须离心去除，勿用溶血或脂肪过多的血清，细菌的污染等因素会干扰实验，导致实验结果的错误。

2）试剂因素：

过期或被污染的实验试剂导致实验结果的失败。

3）操作因素：

①加样时所加物没有加在ELISA板孔底部，加在了孔壁上部，并且有部分溅出；

②加样时所加物置于ELISA板孔边缘位置，反应温度不平衡，且公司的试剂盒温浴是在空气浴中完成，水浴会对实验结果有一定影响；

③洗涤在ELISA试验中不是一个反应步骤，却决定着实验的成败。

洗涤时未洗干净，经与聚苯乙烯吸附的其他杂质蛋白洗去，洗板时洗涤液在孔内形成气泡，或孔与孔之间液体交叉，均会导致实验结果的错误；

④加显色剂时溅出孔外造成液体回流，加终止液时产生过多气泡会导致假阳性结果。

本实验通过“hIL-8cDNAPCR扩增→PCR产物的纯化、酶切→pKpL-3a质粒提取→内切酶消化→T4连接酶连接→重组蛋白鉴定→诱导表达重组IL-8→IL-8纯度及活性测定”的基本过程。

通过该实验，成功地构建了pKpL-hIL-8重组质粒，并在体外通过基因工程[9]原理对其进行表达及其鉴定，为IL-8的在各个方面的深入研究打下了坚实的基础。

参考文献

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