不同地区蛇莓水煎剂对常见细菌体外抑菌作用的比较.docx
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不同地区蛇莓水煎剂对常见细菌体外抑菌作用的比较
不同地区蛇莓水煎剂对常见细菌体外抑菌作用的比较
药学王芙娟
指导老师林居纯
摘要:
目的研究采自不同地区的蛇莓水煎液对标准菌及临床分离菌的抑菌活性,为蛇莓体内抑菌,以及消除细菌耐药性的研究提供基础。
方法采用管碟法,测定蛇莓对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌标准菌及其临床分离菌的抑菌作用。
结果不同地区蛇莓对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有不同程度的抑制作用,其中采自雅安地区的蛇莓抑菌作用最显著,尤其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著。
结论雅安地区的蛇莓水煎液对标准菌和临床分离菌均有较强的抑菌活性。
关键词:
蛇莓;体外抑菌;管碟法
ComparativesofvitroantimicrobialeffectofDuchesneaindicafromdifferentareastodifferentBacterium
WangfujuanMajorofPharmacy
DirectedbyLinjuchun
Abstract:
ObjectiveThevitroantimicrobialeffectsofdifferentDuchesneaindicasamples,whichwerecollectedfrom4locationsinSichuanprovince,werestudied.TheresultsoftestwereprovidedforevaluationofantimicrobialfunctionofDuchesneaindica,forbasicinformationsoftheeliminationofbacterialresistance.MethodsBacteriostasisofDuchesneaindicatostandardbacteriaofStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Salmonella,and30differentisolatesweredetermined,byusingtubeplatemethod.ResultsTheantimicrobialeffectsofdifferentDuchesneaindicasamplesonStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Salmonellaweredifferent,andDuchesneaindicacollectedfromYa,anharboredbetterbacteriostasis,andespeciallythebacteriostasisonStaphylococcusaureusweresignificant.ConclusionDuchesneaindicacollectedfromYa,ananinhibitstandardbacteriaandisolates.
Keywords:
Duchesneaindica;bacteriostasisinvitro;tubeplatemethod
蛇莓Duchesneaindica(Andr.)Focke为蔷薇科植物蛇莓的全草,为民间常用草药,始载于《别录》[1],列为下品。
自梁代以来诸家本草,尤其是《本草纲目》所述蛇莓蔓生,节上生根,三出复叶,有齿,开黄花,果托鲜红色,膨大如覆盆等主要特征与生长环境以及本草附图,均与今之蛇莓DuchesneaIndica相符。
别名三匹风、鸡冠果、地莓、一点红、蛇含草、宝珠草等[2]。
性甘,味苦,性寒,有小毒,入肺、肝、大肠经,具有清热解毒、凉血止血、散瘀消肿之功效,用于治疗热病、惊痫、感冒、痢疾、咽喉肿痛、咳嗽吐血、疔疮痈肿、蛇虫咬伤、湿疹等[3]。
研究表明,蛇莓是一种开发前途十分广阔的植物资源。
蛇莓果实含有丰富的糖类、蛋白质、维生素和丰富的红色素。
蛇莓种子中占油脂含量53%的成分是营养保健价值很高的亚油酸,亚油酸能促进人体肝脏把胆固醇分解为胆汁酸排出体外。
尤其令人惊奇的是蛇莓种子中的亚油酸是一种特异磷质亚油酸,它能阻止胆固醇沉积在血管壁上,对防止动脉硬化有奇效。
近年来有报道,蛇莓多与其他中草药如白英、龙葵、白花蛇舌草、半支莲、蟾酥、郁金、当归等组成复方用于中晚期癌症的治疗,包括肺癌、胃癌、食管癌、膀胱癌等,收到了较好的成效[4~6],其主要通过抑制癌细胞增殖和调节机体免疫功能达到治疗的目的[7]。
此外,有研究表明蛇莓还具有一定的抑菌作用[8],如梁薇在蛇莓抗菌作用的实验研究中发现,蛇莓对7种常见致病菌,包括金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌具有明显的和不同程度的抑制作用。
近年来,抗生素滥用现象日益严重,抗生素在治疗人类疾病的同时,也导致了大量耐药菌的出现,使有效的抗生素效果变差,或者完全失效,给人类带来不容忽视的危害。
此外,大量应用抗生素还可能造成正常菌群失调,产生免疫力下降和医源性感染等危害。
而传统中药高效,低毒,药源广泛,且不易产生耐药性,对一些具有耐药性的细菌还有抑制作用。
本试验采用不同地区蛇莓的水煎液对标准菌进行测定,观测其抗菌活性,再对临床分离的耐药菌株进行试验,优选出抑菌活性较强的蛇莓产地,为蛇莓的临床应用提供基础研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器与试剂
101-4型电热鼓风干燥箱购自上海实验仪器厂;超菌工作台购自苏净集团安泰公司;手提式压力蒸汽灭菌器购自上海华线医用核子仪器;SPX型生化培养箱购自宁波东南仪器有限公司;HR-215S型冰箱购自海尔公司;微量移液器购自德国Eppendorf公司;ESL-4型电子分析天平购自沈阳龙腾电子有限公司。
1.1.2药材
蛇莓,夏秋季节采自雅安、内江、自贡、遂宁地区,经四川农业大学动物医学院药学实验室鉴定为正品,淘洗法洗净,阴干,贮藏于阴凉通风处。
1.1.3供试菌株
标准菌株:
金黄色葡萄球菌ATCC25923,大肠杆菌ATCC25922,沙门氏菌C79-13。
临床分离菌株:
金黄色葡萄球菌(耐磺胺类)10株(SA1~SA10)、大肠埃希菌(耐阿莫西林和四环素)10株(E1~E10)、沙门氏菌(耐喹诺酮类药物)10株(S1~S10),由四川农业大学药学实验室提供。
1.1.4培养基
伊红美蓝琼脂,M-H肉汤,麦康凯琼脂,高盐甘露醇琼脂,营养琼脂,均购自杭州天和微生物试剂有限公司;M-H琼脂,购自北京双旋微生物培养基制品厂。
1.2方法
1.2.1煎煮法提取蛇莓
称取洁净干燥全草蛇莓,粉碎后置于烧杯中,加蒸馏水没过药材1cm左右,浸泡20min后加十倍于药材量的水,置于电炉加热,煮沸20min,用纱布过滤,再加五倍于药量的水没过滤渣,煮沸15min后过滤,合并滤液,浓缩至含药材1g/mL,流通蒸汽灭菌20min,4℃冰箱保存备用[9]。
1.2.2细菌的纯化
取实验室保存的金黄色葡萄球菌接种于高盐甘露醇琼脂培养基,置37℃培养18~24h,挑选呈金黄色的特征菌落,接种于M-H肉汤中增菌培养12~16h,作为原菌液。
取实验室保存的大肠杆菌接种于伊红美蓝琼脂培养基,置37℃培养18~24h,挑选呈紫黑色有金属光泽的特征菌落,接种于M-H肉汤中增菌培养12~16h,作为原菌液。
取实验室保存的沙门氏菌接种于麦康凯琼脂培养基,置37℃培养18~24h,挑选呈透明针尖大小的特征菌落,接种于M-H肉汤中增菌培养12~16h,作为原菌液。
1.2.3细菌计数
经纯培养的含菌肉汤用无菌生理盐水作10倍比例稀释,用微量移液器取5×105~1×106稀释梯度的稀释液0.2mL置于平板上,利用L棒均匀涂布,每个稀释度涂2~3个平板,在37℃培养24小时后,对细菌数在30~300个的平板进行计数,求平均值,以cfu/mL为单位[10]。
1.2.4供试菌液的制备
根据细菌计数结果,将原菌液稀释10000倍,使其浓度为107~108cfu/mL,备用。
1.2.5M-H平板的制备
将干粉培养基按说明书溶解灭菌,倾注至无菌平板,待培养基冷却后成厚度为4mm的平板。
制成的M-H平板取出一个置37℃温箱孵育24h做无菌试验,其余用密封袋封好置4℃冰箱保存,七日内用完。
1.2.6含菌M-H平板的制备
用无菌棉签蘸取制备好的菌液,并在液面上管壁内轻轻旋转挤压,将多余菌液挤出,用微量移液器吸取0.1mL制备好的菌液于平板上,分三次均匀涂布在M-H培养基表面,每次旋转60°,使细菌分布均匀,最后用棉签绕平板边缘旋转一周,待菌液完全吸收干燥备用。
按此方法共制备6个含菌M-H平板,置37℃恒温培养箱孵育18~24h。
1.2.7抑菌试验
取用棉签涂布法制备的含菌M-H平板,用无菌镊子将牛津杯均匀摆放于平板上。
静置10~15min,使牛津杯在琼脂内稍下沉稳定,然后开始滴加不同地方的蛇莓水煎液,加至液面与牛津杯表面平行即可[11],将制好的平板置37℃恒温培养箱培养。
其中,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养8~10h,沙门氏菌培养10~12h,用游标卡尺测量抑菌圈大小。
根据所测结果,初步选出抑菌效果最好的蛇莓产地,再按照前面所述方法,分别针对三种标准菌株及其临床分离菌各10株进行重复试验,以比较不同地区蛇莓水煎液的体外抑菌作用。
1.2.8结果判定标准
结果判定:
D-抑菌圈直径;D≥20mm代表高度敏感;10≤D<20mm代表中度敏感;D<10mm代表不敏感[12]。
2结果与分析
2.1蛇莓产地筛选结果
雅安、自贡、内江、遂宁四个地区蛇莓对标准菌的抑菌效果显示这几个地区的蛇莓水煎液都有不同程度的抑菌效果,采自雅安的蛇莓抑菌作用最显著,自贡次之。
2.2蛇莓抑菌试验结果
2.2.1蛇莓水煎液对标准菌的抑菌效果
蛇莓提取物对3种标准菌抑菌活性检测结果见表1。
结果表明,金黄色葡萄球菌(ATCC25923)标准菌株对雅安和遂宁的蛇莓水煎液高度敏感,其余均为中度敏感。
大肠杆菌(ATCC25922)和沙门氏菌(C79-13)菌株对各地区蛇莓水煎液均为中度敏感。
表1蛇莓水煎液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌标准菌的抑菌活性检测结果
Table1ResultsofAntibacterialactivityofDuchesneaindicatostandardbacteriaofStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Salmonella
提取物
浓度(g/mL)
抑菌圈直径
(mm)±s
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
沙门氏菌
ATCC25923
ATCC25922
C79-13
雅安
1
24.12±0.7
16.98±0.3
19.52±1.2
内江
1
18.18±0.6
13.10±1.2
10.88±0.2
自贡
1
16.92±0.8
13.64±1.1
12.08±1.2
遂宁
1
20.18±2.9
14.06±2.3
11.30±1.7
2.2.2蛇莓水煎液对临床菌的抑菌效果
蛇莓水煎液对临床分离的10株金黄色葡萄球菌、10株大肠杆菌、10株沙门氏菌抑菌活性检测结果见表2。
结果表明,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌对雅安蛇莓水煎液高度敏感,其余均为中度敏感,大肠杆菌对各地区蛇莓水煎液均表现为中度敏感。
表2蛇莓提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌临床分离菌抑菌活性检测结果
Table2ResultsofAntibacterialactivityofDuchesneaindicatoClinicalbacteriaofStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Salmonella
提取物
浓度
(g/mL)
抑菌圈直径
(mm)±s
金黄色葡萄球菌
(SA1~SA10)
大肠杆菌
(E1~E10)
沙门氏菌
(S1~S10)
雅安
1
20.30±0.9
17.34±1.5
23.44±3.0
内江
1
16.24±1.0
12.80±1.9
16.38±2.7
自贡
1
17.24±1.5
14.40±1.2
18.52±2.1
遂宁
1
15.70±1.0
12.32±1.8
12.76±1.2
2.2.3蛇莓提取物对标准菌和临床分离菌的抑菌活性比较
由图1可以看出,蛇莓水煎液对金黄色葡萄球菌标准菌和临床分离菌均有抑制作用,其中采自雅安的蛇莓水煎液效果最显著。
由图2可以看出,蛇莓水煎液对大肠杆菌标准菌和临床分离菌均有抑制作用,其中采自雅安的蛇莓水煎液效果最显著。
由图3可以看出,蛇莓水煎液对沙门氏菌标准菌和临床分离菌均有抑制作用,其中采自雅安的蛇莓水煎液效果最显著。
图1蛇莓提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较
Fig1ComparativesofantimicrobialeffectsofDuchesneaindicatoStaphylococcusaureus
注:
1-雅安2-内江3-自贡4-遂宁
图2蛇莓提取物对大肠杆菌的抑菌效果比较
Fig2ComparativesofantimicrobialeffectsofDuchesneaindicatoEscherichiacoli
注:
1-雅安2-内江3-自贡4-遂宁
图3蛇莓提取物对沙门氏菌抑菌效果比较
Fig3ComparativesofantimicrobialeffectsofDuchesneaindicatoSalmonella
注:
1-雅安2-内江3-自贡4-遂宁
3讨论与结论
抗菌药的广泛使用,尤其是抗菌药的滥用是国内外公认细菌耐药的重要原因,使抗菌药面临强大的选择压力,耐药菌株被筛选出来,并不断繁殖,通过耐药基因及耐药质粒遗传给后代,或者以接合、转化、转导等方式在不同菌种间传递[13]。
微生物耐药已成为人类一个公共卫生问题,在动物疾病治疗方面也是非常棘手的问题。
近年来研究的具有抗菌活性的中草药,来源于大自然,药源广泛,对机体无毒或毒性和不良反应小,且不易产生耐药性,对一些具有耐药性的细菌还有抑制作用。
本试验采用不同地区蛇莓水煎液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌标准菌进行测定,再对其临床分离的耐药细菌进行试验,优选出抑菌活性较强的蛇莓产地。
含菌M-H平板的制备有含菌琼脂倾注法和棉签涂布法,由于前者的琼脂温度难以控制,温度太高容易导致细菌死亡,温度太低又会使琼脂凝固,导致菌液与其混合不均匀,故本实验采用棉签涂布法。
体外抑菌试验方法有二倍稀释法、纸片扩散法、管碟法、平板打孔法等。
根据有关文献研究表明二倍稀释法操作较繁琐且药液颜色不易观测[14]。
平板打孔法因中药液粘稠度大,扩散力差,以至滴在孔内的药液难以扩散,故不选用。
管碟法又称牛津杯法,用于抗生素效价的测定。
纸片扩散法又称K-B法,是最成熟的耐药试验方法[15]。
但是,由于药液浓度不同,纸片所吸附的药量不好确定,且吸附到纸片上的药液又不易扩散,影响药物应有的抑菌效果。
而管碟法,取量精确,单位体积中药物浓度一致,实验结果较为准确有规律,故本实验采用管碟法。
经试验发现,蛇莓水煎液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌标准菌和临床分离菌都有一定的抑制作用,其中尤以对金黄色葡萄球菌作用最强,这与梁薇在蛇莓抗菌作用的实验研究中的结果一致[16],与朱玉兰、刘惠萍、谢大斌在蛇莓有效成分的提取及抑菌试验中的结果一致[17],与朴惠善等在蛇莓中抗癌及抗菌活性物质中的结果一致[18]。
梁薇等将蛇莓水煎液用于体外抗菌研究,测定了其体外最低抑菌浓度,研究发现蛇莓对7种常见致病菌,包括金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌具有明显的和不同程度的抑制作用,最低抑菌浓度在1:
32-1:
1024之间。
蛇莓对金黄色葡萄球菌和变形杆菌的抑菌作用最强,最低抑菌浓度均为1:
1024。
而朱玉兰、刘惠萍等将蛇莓提取液用于体外抗菌研究发现,蛇莓水煎液与丙酮液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比蛇莓甲醇液的抑菌效果好,这与有关文献中蛇莓抗菌活性存在于水溶性部分和不能溶于水但能溶于丙酮的部分的报道一致[19]。
但目前尚没有确切的关于蛇莓抑菌的有效成分方面的研究,蛇莓的有效成分还有待进一步研究,故本试验主要研究蛇莓水煎液的抑菌活性。
由表1~2可知,采自雅安的蛇莓水煎液对标准菌和临床分离菌的抑菌效果最好,自贡次之,采自其余地方的蛇莓对标准菌和临床分离菌也有一定的抑菌作用。
由于各地区蛇莓均在同一季节采集,无季节性差异,因此,引起各地区蛇莓抑菌效果差异的原因可能是:
各地区光照、湿度等不同对蛇莓抑菌成分生成有一定的影响,另外雅安地区的蛇莓采自学校草坪、农场、菜地等土壤肥沃处,蛇莓生长状况较好,也可能是其抑菌效果较好的原因。
图1~3可以看出蛇莓水煎液对标准菌和临床分离菌都有抑制作用,虽然抑菌圈大小有一定差异,但经t检验差异无显著性(P>0.05),说明蛇莓水煎液对敏感菌和耐药菌皆有效,故针对筛选出的采自雅安地区的蛇莓可进一步开展消除细菌耐药性的研究。
另外,考虑到蛇莓化学成分复杂,而体外抑菌作用与机体内作用效果存在一定差异,故可开展蛇莓水煎液的体内抑菌作用研究,以便更好地指导临床用药。
有资料显示,蛇莓具有抑菌、降压、促进免疫功能、抗肿瘤等药理作用[20~21]。
其抗菌作用方面的资料尚少见,临床应用显示,蛇莓在治疗细菌性痢疾、白喉、慢性咽炎、急性乳腺炎、急性穿孔性阑尾炎等各类炎症或感染性疾病方面具有良好的疗效[22~25]。
本试验结果表明蛇莓可有效抑制几种常见细菌,其水煎剂效果显著,制备水煎剂方法简便易行,成本低,实验条件容易控制[26],故蛇莓在抗感染方面具有很高的开发价值及临床应用前景[27]。
参考文献
[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:
上海科学技术出版社,1999,2628..
[2]江苏中医学院.中药大词典[M].上海:
上海科学技术出版社,1985,2115.
[3]徐智勇.中药蛇莓的化学成分与药理研究进展[J].中医药导报,2006,12(11):
1.
[4]章新奇,曹水宁.白蛇六味汤加味治疗中晚期肿瘤临床观察:
附27例报告[J].山西中医,1992,8
(2):
34~35.
[5]张正习.加味逍遥散治疗中晚期腺癌32例临床观察[J].中华实用中西医杂志,2003,16
(2):
285~285.
[6]高雪艳,陈家俊,黄慧琳.抗癌平丸对胃癌化疗免疫功能的影响[J].福建医药杂志,2004,26
(2):
106~107.
[7]ShoemakerM,HamiltonB,DairkeeSH.InvitroanticanceractivityoftwelveChinesemedicinalherbs[J].Phytotherapyresearch,2005,19(7):
649~51.
[8]祝丽香.蛇莓[J].植物资源,2004
(1):
8~9.
[9]王航,孟春,石贤爱等.抗菌中草药的筛选及其有效成分的分离提取和初步鉴定[J].中国药业,2006,15(20):
15~16.
[10]周长林.微生物实验与指导[M].北京:
中国医药科技出版社,2003,84~87.
[11]马绪荣,苏德模.药品微生物检验手则[M].北京:
科学出版社,2000,265.
[12]杜锐,韩文瑜,雷连成.金黄色葡萄球菌中草药抑菌剂的筛选研究[J].中国兽药杂志,2006,40(9):
10~13.
[13]段世俊.几种中药对金黄色葡萄球菌的抑菌作用研究[J].中医药导报,2008,14(10):
73~74.
[14]林炳炎.中草药抑菌试验方法探讨[J].医学检验杂志,1991,6
(1):
43~45.
[15]沈映君.中药药理学[M].北京:
人民卫生出版社,2000,239~240.
[16]梁薇,梁莹,应惠芳.蛇莓抗菌作用的实验研究[J].咸宁学院学报,2005,19(3):
168.
[17]朱玉兰,刘惠萍,谢大斌.蛇莓有效成分的提取及抑菌试验[J].总装备部医学学报,1999,1
(2):
83.
[18]朴惠善.蛇莓中抗癌及抗菌活性物质[J].朝鲜.日本医学资料,1990,11(3):
77.
[19]InGyu,JI,TaeJeong.PolysacchariderichedfractionisolatedfromDuchesneachrysanthaprotectsagainstoxidativedamage[J].BiotechnologyLtters,2002,24(16):
1299~1305.
[20]薛红卫.蛇莓药理与临床研究进展[J].中国中医药信息杂志,2002,9(9):
79.
[21]段泾云,刘小平,李秦.蛇莓抗肿瘤作用研究[J].中药药理与临床,1998,14(3):
28.
[22]ZhengL,GaoZQ,WangSX.Achroniculcerativecolitismodelinrats[J].WorldJGastroenteiol,2006,6:
150.
[23]泸州医专三匹风治疗白喉科研组.草药三匹风治疗各型白喉127例疗效分析[J].四川中草药通讯,1977,
(2):
25.
[24]苏文扬.蛇莓治疗慢性咽炎65例[J].广西中医药,1984,7
(2):
53.
[25]兰宝明.蛇莓临床应用实例[J].浙江中医杂志,1989,24(5):
226.
[26]丁月云,李茜,王恬.21种中药对奶牛乳房炎3种病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧与兽医,2004,36(12):
5~7.
[27]TozawaK,HanaiH.Edenceforthecriticalroleofinterleukin.12butnotinterfeIon.gammainthepathogenesisofexperimentalcolitisinmice[J].JGas.tioenteio1Hepatol,2003,18:
578.
致谢
在本次论文的撰写中,我得到了导师林居纯老师和药学实验室的师兄师姐的精心指导,不管是从开始定方向还是在查资料准备的过程中,一直都耐心地给予我指导和意见,使我在总结学业及撰写论文方面都有了较大提高。
在此,我对林居纯老师和药学实验室的师兄师姐表示诚挚的感谢以及真心的祝福。
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