山茱fer醇是银杏叶中的主要类黄酮.docx
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山茱fer醇是银杏叶中的主要类黄酮
山茱fer醇是银杏叶中的主要类黄酮,通过与血管内皮生长因子结合来增强培养的内皮细胞的血管生成功能。
卫回沪,1,2,3,† 怀友旺,1,2,† 毅腾霞,1,2 戴安娜坤戴,1,2 青熊平,2,4蒂娜庭夏东,1,2 冉都厂,1,2 浩嘉伦灿,1,2 齐魏琴,3和 卡尔哇强尖1,2,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 免责声明
介绍
业已证明,血管生成是由血管系统中已有血管的新血管形成所决定的(Folkman和D'Amore,1996年),这有助于许多生理和病理过程,包括伤口愈合,胚胎发育,恶性肿瘤和慢性炎症(Folkman,1995;Carmeliet和Jain,2000)。
血管形成的过程是高度动态且复杂的,它控制着大量促血管生成分子和/或抗血管生成分子(Rafii等,2002)。
在血管生成过程中需要几个步骤,包括内皮细胞的增殖和迁移,基底膜的顺序降解以及新血管的稳定:
这些步骤的调节增强或抑制了新血管的形成。
已经确定了许多专注于血管生成的生长因子和相关受体。
在这些已知的血管生成因子中,血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的主要调节剂,起着主要的促血管生成因子的作用(Ferrara,1996)。
VEGF具有六种成员,即从VEGF-A到VEGF-E和胎盘生长因子。
通过结合其受体,即从VEGF受体1(VEGFR1)到VEGFR3,VEGF成员负责调节血管功能。
VEGF-A(此后对应于VEGF)和VEGFR2是血管生成的主要参与者。
血管生成在提供组织再生或修复部位,提供足够量的营养,氧气和各种生长因子方面起着至关重要的作用:
此过程也是去除废物的前提条件(Griffith和Naughton,2002年)。
加快血管生成过程应该是修复组织损伤(例如由缺血引起的损伤)的一种极好的方法,因此它为治疗性新血管形成的发展提供了有力的支持(Timar等,2001;Emanueli和Madeddu,2005)。
然而,以生长因子作为治疗剂时,生长因子的药理活性不能在体内持续很长时间。
由于其稳定性差,特别是那些蛋白质型生长因子。
此外,注射大剂量的蛋白型血管生成因子可能会引起副作用。
因此,寻找在血管生成中具有调节作用的天然化合物可能是一个可能的方向。
中药(TCM)是寻找不同疾病新疗法的绝佳来源。
银杏叶是一种常用的草药,已知含有丰富的类黄酮化合物。
根据中国药典(2015年),山竹酚(3,4',5,7-tetrahydoxyflavone)在银杏叶中含量很高,而这种黄酮确实是评估银杏叶质量的指示性化学物质之一。
山emp酚已被证明具有药理活性,例如降低由冠心病引起的死亡率和降低心肌梗塞的发生率(Hertog等,1993),通过促进与抗氧化作用有关的酶的表达(歧化酶,血红素加氧酶-1)来诱导抗氧化活性。
和过氧化氢酶)(Linetal。
,2003 ; Hong等,2009),抑制NF-κB的抗炎作用(Wang等,2006),诱导成骨细胞分化(Guo等,2012),减弱香烟烟雾对永生肺的损害。
上皮细胞的生长(Puppala等,2007)。
通过将HerboChips用作药物筛选平台,我们鉴定了多聚甜蛋白(Hu等,2019a)和白藜芦醇(Hu等,2019b)与VEGF的结合; 它们都来自中草药草Poly(PolygoniCuspidatiRhizomaetRadix)(Huetal。
,2018)。
多肽和/或白藜芦醇与VEGF的高亲和力结合抑制了VEGF的血管生成作用,即降低了VEGF与其受体的结合。
在HerboChips的筛选中,银杏叶被鉴定为与VEGF结合的阳性药物之一。
进一步筛选和分离银杏叶中的山奈酚可以与VEGF结合。
然而,与多肽和白藜芦醇相反,这种结合增加了VEGF 的体外血管生成作用和体内。
在这项研究中,我们揭示了山emp酚在影响VEGF触发信号转导中的药理特性。
去:
材料和方法
细胞系和化学物质
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自Lonza(加利福尼亚州圣地亚哥):
使用了从三到六次的细胞传代。
在EGM-2内皮细胞培养®根据说明书(Lonza)中BulletKit培养基。
RAW264.7细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州),人角质形成细胞系(HaCaT)获自CellLinesService(德国海德堡)。
在含有1%链霉素,1%青霉素和10%热失活胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基中培养RAW264.7细胞,而HaCaT细胞在添加1%链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养,1%青霉素和10%FBS。
HUVEC,RAW264.7细胞,并将温度设定为37℃。
人蛋白(VEGF 165)是重组的,并从R&D系统(明尼阿波利斯,明尼苏达州)和以下抗体获得:
基质金属蛋白酶(MMP)-2,MMP-9,磷酸化p44/42MAPK[细胞外信号调节激酶(Erk)1/2](Thr202/Tyr204),p44/42MAPK(Erk1/2),磷酸化内皮一氧化氮合酶(eNOS)(Ser1177)和eNOS来自CellSignalingTechnology(Danvers,MA);3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体和地塞米松购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。
山emp酚由香港科技大学中药检测实验室提供,其纯度用HPLC-DAD分析纯度超过98%。
为了制备山emp酚储备液,将其新鲜溶解在二甲亚砜(DMSO)中,浓度设置为100mM。
免疫沉淀分析
在有或没有在95°C加热的情况下,将浓度为0.5µM的山奈酚溶液(100µl)与蛋白质或生物素化的蛋白质反应10分钟。
反应在4℃下持续1小时。
然后,使反应后的溶液分别与100µlPureProteome链霉亲和素磁珠反应。
结合反应在4℃下持续24小时。
使用磁力架使珠子聚集在磁铁上。
然后,在不接触珠子的情况下,轻轻地收集上清液,并且在用PBS溶液洗涤3次之后,用乙腈(ACN)分别沉淀VEGF复合物和生物素标记的VEGF复合物。
将该溶液注入配备有安捷伦GraceVisionHTC18色谱柱(4.6×250mm,5μm)的UPLC仪器中,以测量山emp酚的含量。
流动相的优化如下:
A,ACN中的0.1%甲酸;B,0.2%的稀甲酸水溶液,然后进行优化的梯度洗脱:
溶剂A在12分钟内从8%逐渐增加到18%,在24分钟内从18%逐渐增加到24%,从24%逐渐增加到25%5分钟,到15分钟从25%增加到40%,最后到96分钟从40%增加到75%。
测得的流速为1ml/min,进样量为10μl。
样品温度保持在室温。
柱温为30℃。
检测器的波长为360nm。
测得的流速为1ml/min,进样量为10μl。
样品温度保持在室温。
柱温为30℃。
检测器的波长为360nm。
测得的流速为1ml/min,进样量为10μl。
样品温度保持在室温。
柱温为30℃。
检测器的波长为360nm。
质谱检测是与配备有在正电离模式下运行的电喷雾电离源的Synapt™四极杆飞行时间(Q-TOF)高分辨质谱仪(Waters)一起进行的。
流动相由ACN中的0.1%甲酸(A)和0.2%的稀甲酸水溶液(B)组成。
溶剂的线性梯度与UPLC分析相同,并且在两次进样之间有两次弱的(90%ACN)和强(20%ACN)溶剂冲洗系统。
质谱参数确定如下:
毛细管电压2.5kV;毛细管电压2.5kV。
样品锥,25V; 抽气锥,4.0V; 源温度120°C;脱溶剂温度为350℃。
将氮气用于去溶剂化,并分别以600和50L/h的流速确定锥气。
氩气充当碰撞气体。
以1秒扫描间隔将m/z设置为80至800的全扫描模式扫描和分析样品。
在高分辨率模式下,以1-s扫描间隔将m/z设置为80至800,以全扫描模式扫描和分析样品。
分子对接
蛋白质(VEGF)结构可从蛋白质数据库(PDB)下载,而山emp酚(PubChem:
5280863)可从NCBI-PubChem数据库下载。
在分析之前,使用Chemoffice2014软件(CambridgeSoft,Cambridge,MA)将山ka酚的结构转换为MOL2模式,并基于山emp酚-VEGF蛋白模型进行对接分析。
通过应用AutoGrid程序优化了40×40×40Å网格点(作为亲和度(网格)图)以及x,y和z以及0.375Å间距。
盒子中心进行了优化。
x的值为:
0.38,y为-2.98,z为20.51(Morris等,1998)。
产生了大多数结合模式以进行可能的结合,并且可以粗略估计能量(Grosdidier等,2011)。
)。
绑定相互作用是使用vina软件运行的;而代表结合强度的值则在PyMOL分子图形系统中得到证实。
细胞活力测定
首先使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定山determine酚在细胞上的工作浓度。
简而言之,将HUVEC接种到无菌96孔板的每个孔中,密度设置为5×10 3 /孔。
HUVEC用药物处理48小时后,新鲜制备浓度设置为5mg/ml的MTT溶液,每孔使用10μlMTT溶液。
确定了细胞的活力(Huetal。
,2019a ; Huetal。
,2019b)。
通过使用细胞毒性检测试剂盒加(LDH)(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN),参照试剂盒的说明书进行测定LDH释放的测定。
为了测量每组的LDH含量,使用以下公式:
细胞毒性(%)=(实验值-低对照)/(高对照-低对照)×100。
内皮细胞迁移分析
为了确定细胞在体外的迁移能力,进行了伤口愈合测定(Hu等,2019a;Hu等,2019b)。
简而言之,将1,000μl培养基中的20×10 4个 HUVEC接种到无菌12孔板的每个孔中。
细胞接种200小时后,使用200μl移液器吸头,直接在细胞单层中心形成一个伤口,并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗每个孔,将其预热以除去附着的细胞。
细胞。
然后,在相差显微镜(A t0)下拍摄照片。
药物治疗持续8小时,药物处理后,自由选择每个孔中的三个划痕区域并拍照(A t8)。
最后,使用Tscratch软件(瑞士CSE实验室)确定药物治疗前后的内皮细胞伤口面积。
根据以下公式量化细胞的回收百分比:
回收率(%)=A t0 -A t8/A t0 ×100%。
管形成分析
根据先前的描述进行管形成测定(Ashton等,1999;Hu等,2019a)。
简而言之,首先用基质胶覆盖24孔板,然后首先使其在37°C下聚合1小时。
基质胶聚合后,将经VEGF(5ng/ml)或山奈酚处理的细胞培养物置于经基质胶预处理的每个孔上。
细胞密度为20×10 4细胞/孔。
在37℃下进行药物治疗并持续8小时。
与药物一起孵育后,在相差显微镜下拍摄与每个孔中的试管相似的结构图像。
根据连接点对对照组和其他药物治疗组的图像进行定量。
手动计算分支点。
斑马鱼血管生成分析
斑马鱼在有流动水和定期曝气的环境中进食,温度为28.5°C。
系统保持10小时的周期:
黑暗/明亮14小时。
严格按照科大动物伦理委员会批准的动植物护理设施的要求和指南,对斑马鱼进行实验。
根据先前的经验,选择了健康的胚胎(Hu等,2019a ; Hu等,2019b)。
将脱氯的胚胎保存在12孔板中。
脱氯后,将8〜10个胚胎放在每个孔中,并自由分为不同的组。
胚胎用含有VEGF或山emp酚或其组合的水处理。
与药物孵育48小时后,检查其活力,观察眼睛和胚胎的形态特征。
接下来,使用多聚甲醛(4%)在4°C下固定胚胎,固定反应持续20h。
然后将胚胎用含0.1%Tween-20溶液(PBST),50%甲醇和甲醇的PBS洗涤。
每次持续5分钟。
冲洗后,将样品保存在甲醇中,并保存在-20°C下。
然后,通过使用PBST溶液,将胚胎再连续漂洗四次,每次持续5分钟。
首先要进行基于碱性磷酸酶的血管染色测定,将样品浸入9.5T缓冲液中,然后保存在硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(NBT/BCIP)中(CellSignalingTechnology)。
为了消除NBT/BCIP的干扰,染色后,将胚胎用PBST洗涤直至溶液澄清。
最后,在立体显微镜(NikonAZ100)下用数码相机(OlympusDP71)捕获代表肠下血管的图片。
使用ImageJ软件对小肠部分的面积和分支血管进行定量。
在立体显微镜(NikonAZ100)下,用数码相机(OlympusDP71)捕获代表肠下血管的图像。
使用ImageJ软件对小肠部分的面积和分支血管进行定量。
在立体显微镜(NikonAZ100)下,用数码相机(OlympusDP71)捕获代表肠下血管的图像。
使用ImageJ软件对小肠部分的面积和分支血管进行定量。
主动脉环发芽试验
通过进行少量修改的主动脉环萌芽实验评估了山萘酚增强的VEGF触发的微血管生长(Nicosia和Ottinetti,1990)。
简要地,从Sprague-Dawley大鼠(6周龄)中轻轻解剖胸主动脉,并用预热的PBS清洗组织。
用小剪刀剪开主动脉周围的纤维脂肪组织,将主动脉轻轻切成碎片,在显微镜下固定在1毫米厚。
然后,将片段放入预先涂有基质胶(200μl)的24孔板中。
为了覆盖主动脉碎片,将另外100μl基质胶添加到每个孔中。
将基质胶聚合并固化1小时后,使用500μl含有VEGF和不同浓度山of酚的培养基处理片段。
阿瓦斯汀以200μg/ml的浓度作为对照,用于治疗主动脉碎片。
药物治疗持续了8天后,在相衬显微镜下拍摄主动脉碎片的照片。
使用ImageJ软件对微血管的发芽面积进行定量。
蛋白质印迹分析
进行了蛋白质印迹试验以确定一些关键蛋白的表达水平,包括MMP-2,MMP-9以及磷酸化的p44/42MAPK(Erk1/2),eNOS(S1177)VEGFR1(Y103)和VEGFR2(Tyr1175))。
在药物处理之前,使用无血清的基础培养基处理细胞1小时。
药物处理后,进行培养基抽吸,然后在新鲜制备的低盐裂解缓冲液(2%SDS,200mM2-巯基乙醇,10%甘油,125mMTris-HCl,pH6.8)中裂解培养物,将样品转移到离心管中。
将试管中的细胞裂解液在95°C煮沸3次,每次5分钟。
通过应用7%或8%的丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质提取物进行分析和分离。
蛋白质转移反应在4°C进行,此处使用硝酸纤维素膜。
然后,在室温下,通过使用5%的牛奶进行封闭反应60分钟,该牛奶是在含有0.1%TBST的Tris缓冲盐水中制备的。
将膜浸入4℃的一抗中。
将所有使用的一抗稀释至1,000倍,然后将膜与一抗孵育24小时。
与第一抗体一起温育后,洗涤膜,然后使其与辣根过氧化物酶缀合的第二抗兔抗体反应。
此处,二抗以1:
2,000稀释。
与二抗反应2小时后,将膜用TBST溶液冲洗四次,每次持续5分钟。
通过滴落ECL(Invitrogen),可以看到膜中的反应带。
通过使用ChemidocImagingSystem(Bio-Rad;Hercules,CA)获得代表反应带的图片。
对照组和药物治疗组在同一块凝胶上电泳并在标准ECL条件下拍照的谱带强度进行了分析,并使用相关软件进行了比较,这些软件是基于平行图的校正图进行的凝胶与其中一个样品,以一系列不同的比例稀释。
为了量化每组中磷酸化的蛋白质印迹,将每组10分钟的条带与0分钟后的条带与其相应的总蛋白进行比较。
然后,将每个组与对照组进行比较。
这是根据平行凝胶与其中一个样品(以一系列不同比例稀释)的校准图进行的。
为了量化每组中磷酸化的蛋白质印迹,将每组10分钟的条带与0分钟后的条带与其相应的总蛋白进行比较。
然后,将每个组与对照组进行比较。
这是根据平行凝胶与其中一个样品的校准图进行的,这些样品以一系列不同的比例稀释。
为了量化每组中磷酸化的蛋白质印迹,将每组10分钟的条带与0分钟后的条带与其相应的总蛋白进行比较。
然后,将每个组与对照组进行比较。
荧光强度分析
将HUVEC细胞(20×10 4)接种到无菌12孔板的每个孔中。
培养24小时后,将新鲜培养基中添加了5ng/ml生物素化的VEGF,或与山emp酚一起用于处理细胞。
用新鲜培养基孵育的组仅用作背景对照。
药物处理在37°C下持续24小时,然后与生物素化的VEGF杂交,将链霉亲和素-Cy5™加入培养物中,杂交反应在37°C持续60分钟。
冲洗后,将培养物固定在乙醇中,并在激光共聚焦荧光显微镜下捕获图像。
使用相关软件对每张照片的荧光强度进行定量。
皮肤细胞迁移测定
使用细胞迁移测定法通过使用HaCaT细胞在体外确定皮肤细胞的伤口恢复。
简而言之,将50×10 4 HaCaT细胞接种到无菌6孔板的每个孔中。
细胞生长至融合的单层后,在每个孔的中间进行刮擦,并使用无菌P200微量移液器吸头。
在药物治疗的不同时间(0和16小时),使用相差显微镜对每个孔的伤口区域进行拍照,每个孔随机确定6个点。
然后使用ImageJ软件分析伤口区域。
通过在每个实验中通过将药物治疗组的伤口面积的变化除以未进行药物治疗的对照组的伤口面积的变化来计算,获得相对伤口面积。
单核细胞迁移分析
通过使用鼠RAW264.7巨噬细胞进行细胞迁移测定以确定体外单核细胞的伤口恢复。
简而言之,60×10 4将巨噬细胞接种到12孔板的每个孔中。
细胞生长到90%汇合后,使用无菌P200微量移液器吸头在每个孔的单层中心进行刮擦。
在药物治疗的不同时间(0和24小时),使用相差显微镜对每个孔的伤口区域进行拍照,每个孔随机确定6个点。
位于伤口区域内的细胞数量用于量化细胞迁移,并使用ImageJ软件进行分析。
通过在每个实验中通过将药物处理组的细胞数的变化除以未进行药物处理的对照组的细胞数的变化,来计算相对细胞数。
统计分析
通过Bradford方法(Hercules,CA)测定蛋白质。
使用单向方差分析(ANOVA)进行统计分析,然后使用SPSS16.0软件进行Bonferroni多重比较测试。
数据显示为平均值±平均值的标准误(SEM)。
统计学显着性设定为p<0.05。
去:
结果
山emp酚结合VEGF
从我们的HerboChips筛选中鉴定出山emp酚可与VEGF结合。
显示了山emp酚的化学结构(图1A)。
分子对接使用PyMOL分子图形系统和AutoDock工具进行。
所示的山奈酚与VEGF蛋白之间的结合相互作用已显示出来(图1A)。
山emp酚与VEGF蛋白之间的结合亲和力估计为-6.9至-6.1。
根据自动对接结果,山ka酚与VEGF蛋白的特异性结合位点显示位于生长因子的肝素结合域。
该结合区与白蛋白或白藜芦醇的结合区相反(Hu等人,2019a ; Hu等人,2019b)。
为了确认山emp酚与VEGF的结合,在此应用了免疫沉淀测定法。
具有生物素化VEGF的样品中沉淀出的山ka酚比不含有VEGF或加热过的变性VEGF的样品中的山ka酚含量高得多(图1B),表明了结合特异性。
此外,肝素与山emp酚与VEGF的结合被肝素显着取代(图1C)。
沉淀的山/酚通过LC-MS/MS分析进一步分析。
对于山emp酚,以正模式在m/z287.0557处检测到[M+H] +离子,并产生了较小的m/z213.0540和157.0662碎片(图1D)。
因此,上述结果支持了VEGF蛋白和山emp酚之间的直接结合相互作用。
图1
山emp酚与VEGF结合。
(A)显示了山ol酚的结构(左),并且从PDB下载了VEGF的蛋白质结构(即VEGF-A)以进行分子自动对接。
显示了山emp酚-VEGF的结合相互作用的可视化(右)。
VEGF:
绿色;山emp酚:
棍棒,碳的颜色:
粉红色,氧:
红色,氢:
银;建议的结合位点:
黄色。
(B)在链霉亲和素磁珠的免疫沉淀测定中,使用UPLC色谱图检测生物素化的VEGF或VEGF(66.1ng/ml)后上清中山emp酚的含量(左图)。
测试加热的变性VEGF与山奈酚的结合(右图)。
(C)肝素(500μg/ml;左图)干扰了VEGF与山奈酚的结合。
(D)在电喷雾的电离(ESI)源中将电离设定为质谱仪的正模式,求出山ol酚的质荷比(右图)。
证实了典型数字,n=3。
VEGF,血管内皮生长因子。
山萘酚可增强VEGF介导的血管生成。
基于山emp酚和VEGF之间的结合,我们怀疑山emp酚可能在VEGF诱导的血管生成和细胞增殖中发挥作用。
山ka酚的浓度高达10µM,对内皮细胞的处理对细胞活力没有明显影响(图2A)。
内皮细胞的增殖是通过以剂量依赖的方式应用VEGF来触发的(补充图1),这表明亚最大反应下的5ng/mlVEGF可用于此处的测定。
在山emp酚存在下,以5ng/mlVEGF触发的细胞增殖以剂量依赖性方式进一步增强(图2B)。
抗VEGF的单克隆抗体Avastin作为抑制VEGF作用的对照(迈克尔,2014年;Hu等,2019a ; Hu等人,2019b)。
图2
山emp酚可促进VEGF介导的内皮细胞增殖,细胞迁移和管形成。
(A)将不同浓度的山emp酚应用于内皮细胞48小时,并测定MTT测定和LDH细胞毒性测定。
(B)将 HUVEC以5,000个细胞/孔接种到96孔板上,并在有或没有VEGF的情况下用山ka酚处理48小时。
(C)在细胞迁移测定中,HUVEC的大小为20×10 4将细胞/孔接种到12孔板上。
在孔的底部手动创建受伤的内皮细胞单层,并通过相差显微镜分别在0和8h拍摄代表伤口恢复的图像。
HUVEC与VEGF一起孵育,有或没有山奈酚或Avastin。
在试管形成试验中,将内皮细胞以20×10 4的密度接种到12孔板中每口井。
该井已预先用基质胶包被。
将VEGF,与或不与山emp酚一起,用于处理细胞8小时。
为了量化管形成的图像,随机选择一张照片中的三个视野,并手动确定分支点。
在所有实验中,VEGF的浓度均为5ng/ml,Avastin(阳性对照)的浓度设为200μg/ml。
数据显示为与对照组相比变化百分比的平均值±SEM,其中n =4;与VEGF治疗组相比,p <0.05* p <0.01** p<0.001(***)。
棒=40μm。
MTT,3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑; HUVEC,人脐静脉内皮细胞。
内皮细胞迁移和管形成有助于新血管的形成,并且它们正在开始修复受损血管。
在此,通过体外伤口愈合测定法确定山emp酚对内皮细胞迁移的促进作用。
伤口培养物用VEGF或与山奈酚一起处理。
作为对照,在Avastin的存在下,由VEGF诱导的内皮细胞迁移减少了(图2C)。
山emp酚单独对细胞迁移没有作用。
HUVECs中山萘酚和VEGF的联合治疗可显着减少裸露区域,即增加伤口恢复率(图2C))。
为了进一步研究山emp酚在血管生成中的增强作用,在VEGF处理的内皮细胞中确定了管的形成。
用VEGF处理后,形成细长的实心管状结构。
阿瓦斯汀治疗后明显显示出毛细血管样管的中断;但是,在与山奈酚共同处理VEGF后,毛细管状管中的连接牢固地增加(图2C)。
单独的山emp酚对管的形成没有影响。
这些药物研究为山ka酚可以在培养的内皮细胞中增强VEGF诱导的血管生成做出了很大贡献。
在斑马鱼模型中,肠下血管的新血管形成被用于研究山fer酚在体内 VEGF介导的血管生成中的作用。
对斑马鱼的胚胎进行脱氯处理,然后与VEGF,Avastin或kaempferol一起孵育。
血管内皮生长因子治疗后,肠下部分的血液微血管拉长。
此外,面积也扩大了(图3)。
单用山奈酚的治疗,肠下血管几乎没有变化。
但是,山奈酚与VEGF一起使用可以以浓度依赖的方式增强VEGF介导的胚胎血管形成(图3)。
如所期望的,Avastin抑制了VEGF诱导的血管形成。
图3
山fer酚增强体内血管生成。
每组均挑选出健康的斑马鱼胚胎,并置于密度为8-10个胚胎/孔的12孔板上。
胚用含有5纳克/毫升VEGF具有或不具有山奈
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- 山茱 fer 银杏叶 中的 主要 类黄酮