实验三果酒酵母的分离.docx
- 文档编号:29504031
- 上传时间:2023-07-24
- 格式:DOCX
- 页数:24
- 大小:40.84KB
实验三果酒酵母的分离.docx
《实验三果酒酵母的分离.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实验三果酒酵母的分离.docx(24页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
实验三果酒酵母的分离
实验三果酒酵母的分离
实验方案
果酒酵母的分离、纯化及选育
果酒酵母发酵
院(部)名称:
生物科学与工程学院
学生姓名:
胡菲菲
20092474
隆冬玲
20092499
马忠孝
20092526
张晶
20092475
张静艳
20092462
专业:
生物工程
指导教师姓名:
倪志娼
实验三果酒酵母的分离、纯化及选育
原始数据记录
1.筛出5株酵母菌
2.发酵力试验:
采纳CO?
失重法
不同酵母菌株在发酵过程中C02失重的动态变化
不同发酵时刻(d)下三角瓶的重量/g
原重
Id
2d
3d
4d
5d
6d
CO:
开释量
菌种
1
164.8
163.82
161.51
159.43
158.24
157.25
155.49
9.31
菌种
2
152.5
151.83
150.85
149.38
148.34
147.32
145.94
6.56
菌种
3
158.4
156.73
154.78
152.99
152.1
151.24
150.04
8.36
菌种
4
155.1
153.97
152.04
150.34
149.42
148.66
147.7
7.4
菌种
5
156.1
155.22
152.86
151.02
149.95
149.28
148.15
7.95
从上表能够看岀1号菌株在发酵终了时CO:
开释量(g)最多,即1号菌株发酵速度最快,是发酵速度较髙的酵母。
不同发酵时刻(d)CO:
开释量/g
1
2
3
4
5
6
菌种1
0.98
2.31
2.08
1.19
0.99
1.76
菌种2
0.67
0.98
1.47
1.04
1.02
1.38
菌种3
1.67
1.95
1.79
0.89
0.86
1.2
菌种4
1.13
1.93
1.7
0.92
0.76
0.96
菌种5
0.88
2.36
1.84
1.07
0.67
1.13
发酵时间
从上表能够看岀1号和5号菌株在发酵开始时CO;开释量(g)最快,即1号和5号菌株发酵力最强。
3.耐受性试验
做1号菌株和5号菌株的耐受性试验:
采纳杜氏管发酵法测圮所选择的酵母菌对乙醇(5%、6%、7%、8%、9%)二氧化硫(30、50、60、90、120mg/L)的耐性。
1号菌株
酒精量(%)
5
6
7
S
9
杜氏小管产气情形
充满小管
半管
小气泡
无气体
无气体
二氧化硫浓度(mg/L)
30
50
60
90
120
杜氏小管产气情形
充满小管
充满小管
、卜管
小气泡
无气体
5号菌株
酒精量(%)
5
6
7
S
9
杜氏小管产气情形
充满小管
充满小管
半管
无气体
无气体
二氧化硫浓度(mg/L)
30
50
60
90
120
杜氏小管产气情形
充满小管
充满小管
'卜管
小气泡
无气体
从上表能够看岀1号和5号菌株对二氧化硫耐受力差不多相同,5号菌株对酒精耐受力比1号菌株强。
实验方案
果洒是利用新奇水果为原料,在储存水果原有营养成分的情形下,利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。
果洒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分,还含有丰富的生理活性物质,经常适量饮用具有一左的保健作用。
酵母品种是酿造果洒的关键因素之一,酵母性状的好坏直截了当阻碍到所酿果酒的口感和风味,决立果酒品质的优劣。
果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿洒酵母,前者的应用提髙了果酒酿造的生产效率,后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的阻碍。
野生型果酒酵母经分离纯化后,结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他冇种技术,英酿造性能显箸提高,酿造的果洒品质明显改善,因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。
本实验选用当季新奇水果为原料,分离纯化3-5株酵母菌,并对其选择使其适合果酒酿造。
一、实验目的和内容1•学习把握果洒酵母分离纯化的方法:
2•对分离纯化得到的酵母菌进行选择使其适合果酒酿造。
二、实验原理
酿酒酵母细胞透亮,呈圆形或椭圆形,形体比较大,一样为7x12pm,含有转化酶能将匍萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。
优良纯种酵母应具备下列性能:
(1)除酿酒水果本身的果香外,酵母也应产生良好的果香与酒香。
(2)生长速度快,有较髙的发酵能力,能将糖分全部发酵完。
(3)具有较髙的抗SO?
能力,有较好的凝集力和较快的沉降速度。
(4)培养基成分简单,来源广泛,价格低廉,对温度,pH,离子强度,溶氧等环境因素不敏锐。
(5)能在低温或果酒适宜温度下发酵,以保持果香和新奇淸新的口味。
由此可见,酵母的品质对果酒的产量和质量阻碍专门大。
要获得优良的酿酒酵母,必须对英进行分离选育。
果洒酵母的选择应从相应的果品及英种植环境中采样分离,如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的丄壤等相关场所。
依照实践体会,在果汁和自然发酵的果酒醪液中检岀率较高,因为它们的基质环境与酿洒环境专门相似。
为使我们需要的酵母易于检出,应对采集的样品进行富集培养,通过设置较高的洒精浓度、添加SO?
、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长,使期望检出的微生物得到增殖。
酵母检出后,应对英的发酵性能进行考察,包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等,这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
三、实验仪器与材料
样品:
苹果
YEPD培养基(富集培养基):
蛋白腺20g,匍萄糖20g,酵母膏10g,蒸馅水泄容至
1000ml.
PDA培养基(酿洒酵母培养基):
马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馅水泄容至1000ml.(马铃萼去皮,切成块煮沸后再煮30分钟,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂溶化后左容至1000mlo121°C火菌30分钟。
)
器具:
三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒,血细胞汁数板,显微镜,磁力搅拌器,台式离心机,丧荡混合器等。
四、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范畴专门广泛,能够从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。
在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富,可针对不同水果原料分离岀适合其自身特点的酿酒用酵母菌。
(1).酵母菌的分离初筛
1)菌种采样
样品
土壤
叶片
果实(带柄)
腐果
瓜根际上壤藤下方土壤垄间隙上壤
采集
方法
用无菌小铲淸去表层石块露出上壤后,戴好无菌手套取500g左右的上样装入无菌袋内。
用无菌剪刀剪取不同生长时期的叶片装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜(幼龄期,膨大期,成熟期)分别装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。
随机选择三块样地采样,每样采三份,将采集到的样品迅速储存在低温箱内(冰块降温)。
2)富集培养与纯种分离
方法一:
配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml髙温火菌冷却,然后分别取适量样品(土样lg,果皮5g,果柄若干,叶片若干〉各三份接种,120r/min,289摇床培养4天。
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上,每个样品接三个平板,28aC恒温培养。
待菌种长出小菌落,镜检为酵母菌后,将苴挑取于PDA平板划线并标号后28°C恒温培养。
待再次长出单菌落后,挑取划线于PDA培养基上,28°C恒温培养。
菌种划线三到四次后差不多纯化。
方法二:
将腐果装无菌袋宜于恒温箱内培养。
腐果表而长有白色菌落,镜检为酵母菌后,用接种环将其划线至PDA培养基上,28°C恒温培养。
待长出单菌落后,挑取划线于PDA培养基上,28C恒温培养。
菌种划线三到四次后差不多纯化。
(2).酵母菌种的复筛
选择果洒生产中生产性能优良的新奇果汁液作为复筛培养基。
将初选菌种接入保藏培养基。
培养24h后每支斜面接入三角瓶培养,宜于23-25*C的培养箱中培养,测龙其发酵水平及产香水平,选育出优良健壮、耐性强的适合果洒发酵的酵母菌种。
发酵力试验:
采纳CO2失重法,取100mL三角瓶(差不多烘干、称重),各加入80mL果
汁,宜于80°C的水浴杀菌5min,冷却到30°C后,按每升接种30mL的比例分别接入酵母种子液,在20°C下发酵。
发酵过程中每24h测泄1次CO?
缺失量,每次测左时,摇动瓶子,以排岀CO2。
随着发酵时刻的连续,瓶重逐步减轻,直到减轻量不高于0.2g,即表示发酵终止,以CO2失重量为纵坐标,发酵时刻为横坐标,绘制发酵力曲线,并确左菌株发酵力的强弱。
(3).酵母菌的耐受性试验
采纳杜氏管发酵法测定所选择的酵母菌对乙醇(8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%)、二氧化硫(60、80、100、120、140、160、180、200mg/L)的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO?
的果汁培养基中,在相同条件下培养,观看杜氏管中气泡产生情形,重复3次。
活化条件:
28°C条件下,将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h
发酵条件:
28°C条件下,水果原汁培养基中静止发酵4d;
接种量:
1x10'cfu/mLc
1)耐酒精度试验
采纳先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml,再以水果原汁为培养基,制成含酒精量为10%、12%.14%.16%、18%系列的液体培养基。
按下表在试管中加入果汁。
然后加入杜氏小管倒苣使其充满果汁,塞好棉塞,115°C20min灭菌。
火菌完后,待试管温度为常温后按下表加入洒精,加完后摇匀。
最后在每个编号试管中接入对数期酵母lxlO:
个,289静止培养。
观看产气情形,选出耐洒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上,标10、12、14、16、18,按下表每管加入果汁量:
试管编号
0
10
12
14
16
18
20
95%酒精/mL
0
1.05
1.26
1.4
1.68
1.90
2」5
果汁/mL
10
8.95
&74
8.60
8.32
&10
7.85
培养液含洒精%(V/V)
0
10
12
14
16
18
20
2)耐SO?
试验
按亚硫酸含量为6%计,运算出60、100、120、180、240mg/L浓度所需的量,分别加入到果汁中制成SO2不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入果汁,然后加入杜氏小管倒置使英充满果汁,塞好棉塞,115t20min火菌。
火菌完后,待试管温度常温后按上表加亚硫酸(科密欧试剂SO?
含M>6%),加完后摇匀。
最后在每发酵管中接入对数期酵母1x10?
个,28°C静止培养。
观看产气情形,选出耐SO2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上,标1、2、3、4、5,按下表每管加入果汁量:
亚硫酸/uL
0
10
17
20
30
40
果汁/mL
10
10
10
10
10
10
培养液含SOzmg/L
0
60
100
120
180
240
五、技术指标
1.富集培养:
指从微生物混合群开始,对特定种的数量比例不断增髙而引向纯培养的一种培养方法
富集培养基:
富集培养所采纳的培养基为富集培养基
富集培养基的作用:
使混合微生物中的特泄种的数量比例不断增髙,并引向纯培养。
2.酵母菌镜检:
酵母菌是不运动的单细胞頁•核微生物,其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍。
因此,不必染色即可用显微镜观看其形状。
3.血球计数板的使用
以计数酵母菌为例
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.
(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一样稀释10倍即可.
⑶将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央计数室上加盖专用的厚玻片.
(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴宜于盖玻片的边缘,使菌液慢慢渗入,余外的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球汁数室内.
⑸计数时,假如使用16格X25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.假如规格为25格X16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.
⑹当遇到位于大格线上的酵母菌,一样只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只汁数下方和左方线上的酵母细胞).
(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式运算每lml菌液中
运算公式
(1)16格X25格的血球计数板运算公式:
酵母细胞数/ml二100小格内酵昭细胞个数/100X400X10,X稀释倍数
(2)25格X16格的血球计数板运算公式:
酵母细胞数/ml二80小格内酵母细胞个数/80X400X10;X稀释倍数
六、实验时刻进程表
1・3月11日10:
00-12:
00
配制YEPD培养基(富集培养基),配制PAD培养基(酿酒酵母培养基)
将买来的苹果削皮,把果皮放到研钵捣碎,等待接种用
2.3月11日16:
00-18:
00
将配制好的YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温火菌冷却,然后分別取适果皮各三份接种,120r/min,28°C摇床培养4天
将PDA培养基火菌,倒平板
将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养
3.3月14日16:
00-18:
00
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上,每个样品接三个平板,2LC恒温培养。
腐果表而长有白色菌落,镜检为酵母菌后,用接种环将其划线至PDA培养基上,28°C恒温培养。
4.3月16B14:
00-17:
00
第一次纯化:
挑取单个菌落镜检为酵母菌后,用接种环将其划线至PDA培养基上,28°Cfe温培养
将PDA培养基火菌,倒平板待用
5.3月18010:
00-12:
00
第二次纯化
配制PDA培养基,PYG培养基(菌种保藏培养基)
6.3月18日16:
00-18:
00
培养基、培养皿、试管火菌
PDA培养基倒平板,PYG培养基倒斜而待用
7.3月19B10:
00-12:
00
观看酵母菌生长状况,镜检看是否已纯化
第三次纯化
&3月20日10:
00-10:
30
观看平板上是否长菌,未长出
9.3月21日14:
00-14:
30
观看平板上是否长菌,未长出,老师建议改日再来看,可能是培养基有问题
10.3月22日14:
00-15:
00
第四次纯化
镜检无杂菌的接种倒斜面上,保藏菌种2株
11.3月23日14:
00-16:
00
镜检无杂菌的接种倒斜而上,保藏菌种3株
开始进行复筛前预备
12.3月25日10:
00-12:
00
发酵力试验:
采纳CO2失重法
制作酵母种子液:
将配制好的YEPD培养基分装于5个100ml三角瓶内每瓶50ml髙温火菌冷却,然后将斜而上的5株菌分別接种到三角瓶中,120r/min,28°C摇床培养2天
133月27日14:
00-19:
00
稀释酵母种子液为2.67X103个/ml
配制PAD培养基(发酵培养基),分装于5个100ml三角瓶内每瓶80ml高温火菌冷却,然后,将酵母种子液(2ml)对应接种到发酵培养基,称重,28°C恒温培养。
酵母菌的耐受性试验:
采纳杜氏管发酵法测龙所选择的酵母菌对乙醇(5%、6%、7%、8%、9%)二氧化硫(30、60、60、90.120mg/L)的耐性。
将酵母菌分別接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO?
的PDA培养基中,在相同条件下培养,观看杜氏管中气泡产生情形
14.3月28日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
15.3月29日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
16.3月30日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
17.3月31日14:
00-17:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
重复做一次酵母菌的耐受性试验
1&4月1日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
19.4月2日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
20.4月3日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
21.4月4日14:
00-14:
30
称取发酵培养基的重量,记录数据观看酵母菌的耐受性试验现象。
实验四果酒酵母发
原始数据记录
1.果浆1.2L
2.果浆中总糖含量
F(g>
G(g/ml)
V(ml)
Vi(ml)
V2(ml)
V3(ml)
X(g/L)
第一次
0.0625
0.0025
23
1
20
1
10
第二次
0.0625
0.0025
23
1
50
1
250
第三次
0.0625
0.0025
23.5
1
50
1
187.5
第四次
0.0625
0.0025
22.6
1
30
1
130
第五次
0.0625
0.0025
24.2
1
50
1
50
第六次
0.0625
0.0025
24.X
1
50
1
25
xlOOO
(5)
式中:
X——总糖或还原糖的含量,g/L:
F—费林溶液I、II各5mL相当于葡萄糖的克数,g:
VI——吸取的样品体积,mL:
V2——样品稀释后或水解泄容的体积,mL:
V3—消耗试样的体积,mL:
G——痢萄糖标准溶液的准确浓度,g/mL:
V——消耗葡萄糖标准溶液的体积,mL°所得结果应表示至一位小数。
第一次测得果浆中糖的含虽为10g/L,1.2L果浆中含糖12g,向果浆中加糖316g,最后到25g/L
测定酒度
3•果浆中酸的含量
xlOOO-
式中:
X——样品中滴泄酸的含量,g/L;c——氢氧化钠标准溶液浓度,niol/L;VI——样品滴左时,消耗氢氧化钠标准溶液的体积,n】L;V0——空白滴定时,消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;V2——吸取样品的体积,mL;S苹果酸=0.067
V](ml)
Vo(ml)
V2(ml)
X(g/L)
第一次
0.57
0」0
2
1.57
第二次
0.50
0.09
1
2.75
第三次
0.65
0.05
1
4.02
第四次
1.64
0」2
2
5.09
第五次
0.63
0.05
1
3.89
第六次
0.81
0」0
1
4.76
第七次
0.61
0.05
1
4.20
第一次测得果浆中酸的含量为l・57g/L,向果浆中加入苹果酸4.43g
4.取100ml果汁加50ml蒸餾水,蒸馅得100ml液体,29°C下,测得酒精度7.5%依照酒精度温度校正表得,20<>C下,果汁的酒精度8。
实验方案
选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验,在品尝合格并符合规左的感官及理化指标后,选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
一、实验目的和内容
1.把握果洒酿造的原理并对选择果酒酵母菌种进行发酵性能测定(起酵时刻、产酒精度、耐受性能)。
2.用实验十三所选择果洒酵母进行小型酿洒实验,把握果酒酿造一样工艺流程,并对自酿果洒进行感官品评和理化分析检测(糖度、酸度、洒精度)。
二、实验原理果洒发酵:
果浆或果汁中的匍萄糖和果糖在酵母菌的作用下,最后生成洒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明:
酵母菌
►2C2HsOH+2C02
葡萄稱酒精+二氧化碳
果酒发酵是一个极英复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与,除了最后生成洒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外,还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个时期,主发酵是将发酵液的糖分变成酒精,后发酵是连续分解残糖为酒精,加速洒的转化,使酒更加稳固。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵,利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
三、实验仪器与材料
样品:
新奇水果及压榨汁。
试剂:
亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄上(有机物含量少的黄土)或者红上;
器皿:
三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(ImL及5n】L)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安甑管、冰箱、冷冻真空干燥装豊、酒精喷灯、滤纸条(0.5X1.2cm)冰箱,低温冰箱(-30°C),液氮冷冻保藏器,玻璃涂棒,I血细胞计数板,显微镜,紫外线等(15W),磁力搅拌器,台式离心机,震荡混合器等。
四、实验方法与步骤
1.自选酵母发酵性性能的检测试验:
用选择菌种发酵果酒
(1)果酒酿造的工艺流程
鲜果-分选-破裂、除梗T果浆-分离取汁―澄淸-淸汁一发酵一倒桶-贮洒-过滤一冷处理-调配T过滤-成品
(2)工艺简述
1)发酵前的处理
前处理包括水果的选别、破裂、压榨、果汁的澄淸,果汁的改良等。
1破裂、除梗:
破裂要求每粒种子破裂,但不能将种子和果梗破裂,否则种子内的油酯、糖苜类物质及果梗内的一些物质会增加洒的苦味。
破裂后的果浆赶忙将果浆与果梗分离,防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
2二氧化硫处理:
二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄淸、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使洒的风味变好等。
使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐,前者可用管道直截了当通入,后者则需溶于水后加入。
发酵基质中二氧化硫浓度为60-lOOmg/L-(以匍萄洒为例:
二氧化硫添加量的运算:
[痢萄果实x70%x601/[0.06xl000]o)此外,尚需考虑下述因素:
原料含糖高时,二氧化硫结合机会增加,用量略增:
原料含酸量高时,活性二氧化硫含量髙,用量略减:
温度高,易被结合且易挥发,用量略减:
微生物含量和活性越高、越杂,用虽:
越髙:
專变严峻,用量增加。
2)果汁的调整:
取汁测左果汁中糖度和酸度,依照发酵需要调整糖度和酸度。
1糖的调整:
酿造酒精含量为10%-12%的酒,果汁的糖度需17-20°BXo假如糖度达不到要求则需加糖,实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
2酸的调整:
酸可抑制细菌繁冇,使发酵顺利进行:
使酒颜色鲜亮;使洒味淸新,并具有柔软感:
与醇生成酯,增加洒的芳香:
增加酒的贮藏性和稳固性。
干酒易在0.6%-0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 实验 果酒 酵母 分离