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裸鼠高致瘤性人白血病细胞系的生物学特性分析
裸鼠高致瘤性人白血病细胞系的生物学特性分析
摘要
目的和意义通过对K562和HL.60细胞系衍生的裸鼠高致瘤性人白血病细胞系K562.n和HL60.11不同克隆株生物学特性的观察研究,探索人白血病细胞在裸鼠体内致瘤的细胞生物学机理及白血病与裸鼠致瘤性有关的特异性染色体核型变化,并初步探索与K562.n细胞致瘤性相关的基因表达变化,为进一步深
入研究白血病发生、发展的分子生物学机理打下基础。
,
一一/方法通过裸鼠体内接种与体外培养相结合的方法,分别自K562和H/.,-60
、
细胞系建立高致瘤性的人白血病细胞系K562.rl和HL60.n,应用极限稀释法分别
建立K562.n、HL60-n细胞系的不同克隆株,并以K562、HL.60细胞为对照,比较K562.n、HI_,60.13细胞不同克隆株在裸鼠致瘤性、软琼脂培养集落形成率、电镜超微结构、流式细胞仪细胞周期分布、对裸鼠NK细胞杀伤的耐受性、裸鼠体内所致肿瘤病理等方面的差异。
并对致瘤性不同的各个细胞株进行染色体核型分析,观察与致瘤性相关的染色体变化。
在此基础上,应用DNA芯片技术对K562和K562.n细胞进行基因表达谱差异研究,分析与K562.n细胞裸鼠高致瘤性相关的基因表达变化。
结果所建立的高致瘤性K562.B、K562.C、K5620E、HL60.A、HL60.B克隆株,其软琼脂培养集落形成率,较K562、HL-60细胞显著增高。
电镜细胞超微结构提示高致瘤性细胞株相对其母细胞,常染色质增多,异染色质少见,胞浆量少,可见线粒体等细胞器聚集成堆,胞浆内微丝增多且排列紊乱;流式细胞仪细胞周期分析提示高致瘤性的细胞株,S期细胞比例较高,提示高致瘤性的克隆株细胞增殖和DNA合成活跃。
实验结果还表明裸鼠NK细胞对K562.n和HL60.n细胞高致瘤性克隆株的杀伤活性显著降低,证实人白血病细胞系在裸鼠体内的致瘤性与其对NK细胞的敏感性呈负相关。
对裸鼠肿瘤的病理观察显示低致瘤性的白血病细胞在裸鼠所致的肿瘤组织内有大量的淋巴细胞等炎性细胞浸润,可见大量肿瘤细胞死亡,血供丰富区尤甚;而高致瘤性克隆株所致肿瘤组织内炎性细胞浸润少,仅在瘤组织中央血供不足处有缺血性坏死,表明接种高致瘤性白血病细胞株可使宿主的免疫力受到抑制。
染色体核型分析结果表明,K562细胞染色体数目为44.71,干系为亚三倍体,染色体众数(62±2,占52%)。
高致瘤性的K562-n细胞干系为近二倍体,分析比较K562、K562-n细胞及K562.n细胞衍生
摘要
的K562-A克隆株的染色体核型,发现K562.n细胞的致瘤性主要与1、2、16、18、20、21、11及12号等染色体的变化有关。
HL-60细胞系的染色体数目为38.71,干系为近二倍体,从高致瘤性的HL60.rl细胞系衍生的各克隆株都为近三倍体,比较分析致瘤性不同的细胞株的染色体核型,发现Mar3、19、21、22和5号等染色体的变化与HL60.n细胞的致瘤性相关。
用含有12800个基因的eDNA芯片对K562.n和K562细胞系进行基因表达差异分析。
结果发现K562-n和K562细胞差异表达的基因有139条,其中K562.n细胞表达上调的有42条,表达下调的有97条。
在这139条基因中,有85条已在GeneBank中登录,54条为新序列。
这些在K562.n细胞中表达变化的基因可以划分为不同的功能群。
上调的基因包括原癌基因、转录调节相关的基因、与细胞骨架、细胞动力学相关的基因及编码细胞代谢酶和物质转运蛋白的基因。
下调的基因包括潜在的肿瘤抑制基因、调控凋亡、细胞周期和信号传导的基因、某些代谢相关的基因及与免疫功能相关的基因。
结论:
与K562和HL.60细胞相比,裸鼠高致瘤性的K562.11、HL60-n细胞的细胞生物学行为表现为:
软琼脂培养集落形成率增高;S期细胞比例增多;常染色质增多、异染色质减少、微丝增多等超微结构改变;对裸鼠NK细胞杀伤的耐受性增强;所致裸鼠肿瘤组织内炎性细胞浸润减少。
细胞染色体核型分析示K562-n细胞干系核型由K562细胞干系的亚三倍体转变为近二倍体,1、2、16、18、20、21、1l、12等染色体的改变与K562.n细胞系的裸鼠致瘤性升高有关。
而高致瘤性的I'-IL60.n细胞系各克隆株由HL.60细胞的近二体核型转变为近三倍体,Mar3、19、21、22、5号等染色体变化与HL60-n细胞的致瘤性相关。
对K562-n和K562细胞的DNA芯片基因表达差异研究表明K562-n细胞的致瘤性增高涉及多基因的表达变化,包括一系列肿瘤相关基因的表达上调和肿瘤抑制基因的表达下调,一系列转录调节因子和细胞周期调节蛋白的表达变化,使细胞凋亡受阻,促进细胞周期进展,增殖过度,另外还涉及编码细胞骨架蛋白和代谢酶的基因表达变化。
这些差异表达的基因代表了一个与K562-n细胞裸鼠致瘤性相
关的特异的基因表达谱。
正是这些基因的表达变化,使K562-n细胞表现出一系、/
列相关的生物学特性,并导致其在裸鼠体内致瘤性增强。
_)j
,
关键词:
白血病致瘤性裸鼠生物学特性
2
Abstraet
Abstract
objectivesweexaminedthebiologicalcharacteristicsofdifferentclonesderivedfromhumanleukemiacelllinesK562-nandHL60·nwi协hi曲tumorigenicityinnudemicewhichwereestablishedfromK562andHL-60celllinesrespectively,inordertosearchthecytobiologicalmechanismsofincreasedtumorigenicityandthe
specifickaryotypesassociated、vitllthehightumorigenicity.Furthermore,Weplanedtoidentifythegenesdifferentiallyexpressedbetweenhi【ghtumorigeniccelllineK562·nandtheparentalK562celllinebyDNAmicroarrays.wepredictedtoexplorethepotentialoncogenesandtumorsuppressorgenesrelativedtoleukemogenesisandprogressionofleukemiasaccordingtothemicroarraygeneexpressionanalysis.
MethodsCombinedwithsubcutaneouslyinoculationinnudemiceandculturein
vitro.thecelllinesK562-nandHL60-n、ⅣitllllightumorigenicityinnudemicewereestablishedfromK562andHL-60cellsrespectively.ThedifferentclonesofK562·nandHL60-ncellswereobtainedbylimiteddilution.Thenthebiologicalfeaturesofdifferentcloneswerecomparedwitll/(562andIlL-60cells.intherespectof
tumorigenicityinnudemice,colonyformationpercentageinsoftagar,ultrastructore
byelectronmicroscopy,cellcycledistributionbyflowcytometer,thesusceptibilitytonudemiceNKcellsandthehistopathologyofnudemicetumors.Thecytogeneticsanalysisofdifferentstrainswithdistincttumorigenicitywasdonetoobservethe
chromosomechangesrelativedtothetumorigenicity.Atlast,thedifferentialgeneexpressionprofilesongenomicscalewereidentifiedbytheDNAmicroarraytechniquestosearchthegenesassociatedwiththetumorigenicityofleukemiacellsinnudemice.
ResultsThehightumorigenicityleukemiacelllinesK562·nandHL60一nwereestablishedandseveralcloneswitlldifferenttumorigenicityofK562-nandHL60-nwerederivedThecolonyformationpercentagesinsoftagar,especiallythelargecolonyformationpercentagesofthehightumorigenicclonestrainsK562·B,K562-C,K562-E,HL60一AandHL60-BweresignificantlyhigherthanthecontrastK562andHL·60celllines.Thereworenosignificantlydifferencesbetweenthelowornon-tumorigenicclonesla-ainsK562一A,K562-D,HL60-EandHL60-Fwiththecontrast
K562andHL一60cells.Ultrastructurely,inthehightumorigeniccells,thenuclearis
hi曲lyabnormal,theeuchromaticelementofnuclearchromatinisincreasedandthe
heterochromafinisveryrare,themicrofilumentsincytoplasmareincreasedandthe
3
Abstract
arrangementWaSdisturbedcomparedwiththeparetantalcelllines.ThecellcycleanalysisbyflowcytometershowedhigherSphasefractionsofhightumorigenticcells.TogetherwiththeultraStructuresuggestedtheproliferationandDNAsynthesisis
moreactiveinhightumorigenicitycellstrains.Thestudyalsoshowsthatthekilling
activitiesofNKcellstothehighclonestrainsaresignificantlowerthanthecontrast,
whichdemonstratesthetumorigenicityofleukemiacelllinesisnegativecorrelative
withthesusceptibilitytoNKcells.Thehistopathologyofnudemicetumorsproducedbylowtumorigenicleukemiacellsshowedthereweremanyinflammatorycells
infiltratedmajoritywerelymphocytes,andmanytllmorcellswerekilledespeciallyinvessel曲undantareas.Intllecontrast,therewere勰inflammatorycellsinfiltratedinthetumorsproducedbyhightumorigeniccellstrains.butischemicnecrosis咖be
seeninthecenterofthelargetumors.ThecytogeneticanalysisshowedthechromosomenumbersofK562cellsvariedfrom44to71,thel(aryotypeofstemlinewashypotriploid,chromosomesmodelwas(62_+2,occuply52%)Aneardiploidchromosomesmodelwasobservedinthehi【ghtumorigeniccelllineK562一n..K562,K562。
ncellsandK562-AclonederivedfromK562·ncells,wesupposethechanges
ofchromosome2,16,18,20,21,11,12arerelatedtothetumorigenicityofK562cell
line.ThechromosomenumbersofilL·60cellsrangedfrom38-71,therepresentative
karyotypewasnealdiiploid,butthekaryotypesofsubclonesderivedfromtheHL60.ncellswereallneartriploid.Accordingtothekaryotypesanalysed,wethjnkthe
changesofchromosome19,21,22,5andtheabnormalchromosomeMar3are
associatedwiththetumorigenicityofHL60-ncells。
DNAmicroarrayanalysisofthegeneexpressionprofilesofK562-nandK562cellsshow139genesweresignificantlydifferentlyexpressedofthe12,000genesscreened.42geneswereup-regulatedin
K562-ncellsand97genesweredown-regulated.Amongthem85geneshavebeenregisteredintheGeneBankand54areunknowngenes.Thegenesup-regulatedinK562-nincludesomeoncogenesandgeneswhoseproductsaleinvolvedin
transcriptionregulation,cytoskeletonandcytodynamic,metabolism,transport.The
down—regulatedgenesinK562-nincludesometumor-supressorgenesandgenesassociated、Ⅳithapoptosis,cellcycleregulation,signaltransduction,metabolism,immunesystem.
Conclusions:
IncontrasttotheparentalK562andHL-60celllines,the
cytobiologicalcharacteristicsofhightumorigenicK562.-nandHL60-.ncelllinesare
4
Abstract
highercolonyformationpercentagesinsoftagar,higherSphasefraction,uRrastructurelyincreasedeuchromaticandveryrdxeheterochromatin,increasedanddisorderlyarrangedmicrofilamentsincytoplasm,decreasedsusceptibilitytonude
miceNKcells.1essinflammatorycellsinfiltratedinthetumorsproducedinnudemice.
ThecytogeneticanalymsshowedtherepresentativekaryotypeinK562-nceilschangedfromhypotriploidtoneardiploidandchangesofchromosome2,16,18,20,21,II,12arerelatedtothetumorigenicityofK562·ncells.TherepresentativekaryotypewasneardiploidofHL·60cellsandthekaryotypesofderivedclonesfromHL60-ncellswereallncartriploid.wethinkthechangesofchromosome19,21,22,5andtheabnormalchromosomeMar3aleassociatedwiththetumorigenici母ofHL60-ncells。
DNAmicroarrayanalysisidentifiedgenesup-regulatedinK562·nincludingsomeoncogenesandgeneswhoseproductsareinvolvedintranscriptionregulation,cytoskeleton,metabolism,transport.Thedown-regulatedgenesinK562-nincludesometumor-supressorgenesandgenesassociatedwithapoptosis.cellcycleregulation,signaltransduction,metabolism,immunesystem.Weconcludethehightumorigenici母ofK562-niscausedbythespecif沁genesexpressionalteration.
Keywords:
LeukemiaTumofigemcityNudemiceBiological
characteristiCS
5
引言
引言
人肿瘤细胞的裸鼠致瘤性试验是肿瘤生物学特性观察的一项重要指标,已广泛应用于实体瘤发病机理与治疗的研究,但由于人类各种类型的白血病细胞在胸腺缺陷裸鼠体内的致瘤性甚低,使白血病开展该项研究存在一定困难,其主要原因是胸腺缺陷裸鼠体内NK细胞活性较高,而白血病细胞多数是NK细胞敏感的靶细胞。
为此,国内外学者曾研究过一系列抑制裸鼠NK细胞活性的致瘤方法,但效果均不理想。
如Watanabe等【卜2】采用白血病细胞接种前4.7周对裸鼠作切脾术,接种前3天再行x线照射,致瘤率可显著提高,但因操作过于繁琐,未被其他实验室采用。
Zlegler等13】将经x线照射的人纤维肉瘤细胞HT.1080与白血病细胞混合接种到全身照射的裸鼠皮下,致瘤率可达75%左右。
但这种肿瘤细胞混合接种的方法,显然会对实验结果的分析带来不利影响。
利用裸鼠特殊部位进行接种的方法也有人尝试,White等[41将急性T淋巴细胞自血病患者的原代细胞接种于裸鼠的眼前房,实验组2只裸鼠均发病,而皮下接种的对照组均未成功。
但这一方法裸鼠须在全麻状态下显微操作,难度颇大。
应等嘲采用T和NK细胞联合缺陷裸鼠作为接种对象,成功率达90%以上。
但T和NK细胞联合缺陷裸鼠来源困难,难以在一般实验室开展研究。
通过裸鼠体内选择途径包括直接序列肿瘤移植或将从皮下、肺、肝和淋巴结等转移肿块获取的细胞再次行体外培养,可获得具有与母细胞不同致瘤性、转移潜能及其它生物学特性的变异体【矾。
许等[7-9]采用在胸腺缺陷裸鼠体内接种和体外传代相结合的方法,建立了两株致瘤率达100%的人白血病细胞系HL60.n和K562.n。
这两株细胞系分别来源于IlL一60和K562细胞。
并利用这两株高致瘤率细胞系,成功地进行了转移外源性野生型p53基因诱导白血病细胞凋亡的体内外实验研究。
结果表明,这种方法具有操作简便,致瘤率高等优点,非常适合人白血病化疗或诱导分化的体内实验研究。
至于HL60.n和K562.n细胞的高致瘤机理,作者未作深入研究。
在实体瘤的研究中发现,染色体的某些特定部位与肿瘤细胞的裸鼠致瘤性有关。
如Horikana等【m】报道Hela细胞系的3个高致瘤性克隆lip、1lq位点为杂合性,而2个弱致瘤性克隆和4个无致瘤性克隆为纯合子,也就是说一条11号染色体丢失,另一条11号染色体复制与Hela细胞系的致瘤性降低有关。
6
引言
Zimonjie等【ll】对在裸鼠体内致瘤性不同的4个乳腺癌细胞系进行了核型和基因表达情况的比较研究,发现18q的缺失与细胞系在裸鼠体内致瘤性增强相关。
我们推测,经过裸鼠体内外传代培养的人白血病细胞系致瘤性增强的原因可能是因为染色体核型发生了特异性的改变,由此还必将涉及到某些与细胞生长调控有关基因表达的异常,从而导致其对裸鼠NK细胞的杀伤活性产生较高的耐受性。
现代医学及分
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