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第二章微生物发酵产酶
◆酶的生物合成:
酶在生物体内合成的过程。
◆酶的发酵生产:
经过预先设计,通过人工操作,利用微生物的生命活动,获得所需的酶的技术过程。
◆大多数酶的生产采用发酵生产→原因:
微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点
◆优良的产酶微生物具备的条件:
(1)酶的产量高;
(2)产酶稳定性好;
(3)容易培养和管理;
(4)利于酶的分离纯化;
(5)安全可靠、无毒性等。
◆酶的发酵生产的方式:
固体培养发酵
液体深层发酵
固定化微生物细胞发酵
固定化微生物原生质体发酵
1.酶生物合成的基本理论
◆蛋白类酶和核酸类酶→酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程
◆合成过程:
酶的基因(DNA)→(转录)→RNA→(翻译)→多肽链→(加工、组装)蛋白质
1.1RNA的生物合成—转录(参考相应的生物化学与分子生物学课程知识)
1.2蛋白质的生物合成—翻译(参考相应的生物化学与分子生物学课程知识)
1.3酶生物合成的调节
◆组成型酶(Constitutiveenzyme):
生物细胞中合成的酶的量比较恒定,这些酶的合成速率影响不大。
如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。
◆适应型酶(Adaptiveenzyme)或调节型酶(Regulatedenzyme):
生物细胞中合成的酶的含量却变化很大,其合成速率明显受到环境因素的影响。
如大肠杆菌β-半乳糖苷酶。
◆生物体为了适应环境的变化,使代谢过程有条不紊地进行,需要根据各种条件的变化,对各种适应型酶的生物合成进行调节控制。
◇转录水平的调节
◇转录产物的加工调节
◇翻译水平的调节
◇翻译产物的加工调节和酶降解的调节等
◆转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节
1.3.1原核生物中酶生物合成的调节机制
◆原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节
◆雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)于1960年提出的操纵子学说(Operontheory)来阐明的。
◇操纵子学说概述
启动基因(Promotergene):
由两个位点组成,一个是RNA聚合酶的结合位点,另一个是环腺苷酸(cyclicAMP,cAMP)与CAP组成的复合物(cAMP-CAP)的结合位点。
操纵基因(Operatorgene):
与调节基因产生的变构蛋白(阻遏蛋白)中的一种结构结合,从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。
调节基因(Regulatorgene):
产生一种阻遏蛋白。
阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白,它可以通过与某些小分子效应物(诱导物或阻遏物)的特异结合而改变其结构,从而改变它与操纵基因的结合力。
当阻遏蛋白与操纵基因结合时,由于空间排挤作用,RNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上,也无法进行结构基因的位置进行转录,酶的生物合成也就无法进行。
结构基因(Struturalgene):
结构基因与多肽链有各自的对应关系。
结构基因上的遗传信息可以转录成为mRNA上的遗传密码,再经翻译成为酶蛋白的多肽链,每一个结构基因对应一条多肽链。
◆操纵子(Operon):
是基因表达和控制的一个完整单元,其中包括结构基因,调节基因,操纵基因和启动基因。
◇诱导型操纵子(Inducibleoperon)—大肠杆菌乳糖操纵子
◇阻遏型操纵子(Repressibleoperon)—色氨酸操纵子(Trpoperon)
(1)Trp作为辅阻遏物(corepressor)
(2)阻遏物和RNApol在P,O重叠区产生竞争性抑制;
(3)阻遏物的阻遏能力低,是LacR的1/千;
(4)trpO调节合成代谢,存在衰减作用。
色氨酸阻遏衰减子作用
◇分解代谢物阻遏作用:
是指某些物质(主要是指葡萄糖和其它容易利用的碳源等)经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象。
(葡萄糖效应、二次生长现象)
(1)乳糖操纵子的启动基因内,除RNA聚合酶结合位点外,还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点
(2)cAMP是环腺苷酸,CAP是降解物基因活化蛋白(又称为cAMP受体蛋白,CRP),当CAP与cAMP结合后,就会被活化。
(3)CAP-cAMP复合物又会激活启动基因,并使RNA聚合酶与启动基因结合。
(4)乳糖与葡萄糖同时存在时,因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶,能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物(X),X既会阻止ATP环化形成cAMP,同时又会促进cAMP分解成AMP,从而降低了cAMP的浓度,继而阻遏了与乳糖降解有关的诱导酶合成。
1.3.2真核生物酶生物合成的调节
◆目前为止,还没有统一的理论和模型来阐述真核生物酶生物合成的调节规律。
◆真核生物细胞中酶合成的调节控制:
从细胞分化改变酶的生物合成、基因扩增加速酶的生物合成、增强子促进酶的生物合成、抗原诱导抗体酶的生物合成等。
2.常用的产酶微生物
◆用于酶的生产的细胞必须具备几个条件:
(1)酶的产量高
(2)容易培养和管理
(3)产酶稳定性好
(4)利于酶的分离纯化
(5)安全可靠,无毒性
◆产酶微生物:
细菌、放线菌、霉菌、酵母等。
2.1细菌
细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。
在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
(1)大肠杆菌(Escherichiacoli)
大肠杆菌细胞有的呈杆状,有的近似球状,大小为0.5×1.0~3.0μm,一般无荚膜,无芽孢,革兰氏染色阴性,运动或不运动,运动者周生鞭毛。
菌落从白色到黄白色,光滑闪光,扩展。
大肠杆菌可以用于生产多种酶。
大肠杆菌产生的酶一般都属于胞内酶,需要经过细胞破碎才能分离得到。
例如,大肠杆菌谷氨酸脱羧酶,用于测定谷氨酸含量或用于生产γ-氨基丁酸;大肠杆菌天门冬氨酸酶,用于催化延胡索酸加氨生产L-天门冬氨酸;大肠杆菌青霉素酰化酶,用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素;大肠杆菌天门冬酰胺酶,对白血病具有显著疗效;大肠杆菌β-半乳糖苷酶,用于分解乳糖或其他β-半乳糖苷。
采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等,在基因工程等方面广泛应用。
(2)枯草杆菌(Bacillussubtilis)
枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。
细胞呈杆状,大小为0.7~0.8×2~3μm,单个细胞,无荚膜,周生鞭毛,运动,革兰氏染色阳性。
芽孢0.6~0.9×1.0~1.5μm,椭圆至柱状。
菌落粗糙,不透明,不闪光,扩张,污白色或微带黄色。
枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物,可以用于生产α-淀粉酶,蛋白酶,β-葡聚糖酶,5’-核苷酸酶,碱性磷酸酶等。
例如,枯草杆菌BF7658是国内用于生产α-淀粉酶的主要菌株;枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。
枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶,而其产生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
2.2放线菌(actinomycetes)
放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。
常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌(Streptomyces)。
链霉菌菌落呈放射状,具有分枝的菌丝体,菌丝直径0.2~1.2μm。
革兰氏染色阳性。
菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分,基内菌丝不断裂,只有气生菌丝形成孢子链。
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。
还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
此外,链霉菌还含有丰富的16α羟化酶,可用于甾体转化。
2.3霉菌
霉菌是一类丝状真菌。
用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。
(1)黑曲霉(Aspergillusniger)
黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。
菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成,菌丛黑褐色,顶囊大球形,小梗双层,分生孢子球形,平滑或粗糙。
黑曲酶可用于生产多种酶,有胞外酶也有胞内酶。
例如,糖化酶,α-淀粉酶,酸性蛋白酶,果胶酶,葡萄糖氧化酶,过氧化氢酶,核糖核酸酶,脂肪酶,纤维素酶,橙皮苷酶,柚苷酶等。
(2)米曲酶(Aspergillusoryzae)
米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。
菌丛一般为黄绿色,后变为黄褐色,分生孢子头呈放射形,顶囊球形或瓶形,小梗一般为单层,分生孢子球形,平滑,少数有刺,分生孢子梗长达2mm左右,粗糙。
米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强,这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。
此外,米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P等。
(3)红曲霉(Monascus)
红曲霉菌落初期白色,老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。
通常形成红色色素。
菌丝具有隔膜,多核,分枝甚繁。
分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端,单生或成链,闭囊壳球形,有柄,其内散生十多个子囊,子囊球形,内含8个子囊孢子,成熟后子囊壁解体,孢子则留在闭囊壳内。
红曲霉可用于生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。
(4)青霉(Penicillium)
青霉属半知菌纲。
其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色,有横隔,分生孢子梗亦有横隔,光滑或粗糙,顶端形成帚状分枝,小梗顶端串生分生孢子,分生孢子球形、椭圆形或短柱形,光滑或粗糙,大部分在生长时呈蓝绿色。
有少数种会产生闭囊壳,其内形成子囊和子囊孢子,亦有少数菌种产生菌核。
青霉菌种类很多,其中产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要作用于青霉素)果胶酶、纤维素酶等。
桔青霉(Penicilliumcityrinum)用于生产5’-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。
(5).木霉(Trichoderma)
木霉属于半知菌纲。
生长时菌落生长迅速,呈棉絮状或致密丛束状,菌落表面呈不同程度的绿色,菌丝透明,有分隔,分枝繁复,分枝上可继续分枝,形成二级分枝、三级分枝,分支末端为小梗,瓶状,束生、对生、互生或单生,分生孢子由小梗相继生出,靠粘液把它们聚成球形或近球形的孢子头。
分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。
光滑或粗糙,透明或亮黄绿色。
木霉是生产纤维素酶的重要菌株。
木霉生产的纤维素酶中包含有C1酶、Cx酶和纤维二糖酶等。
此外,木霉中含有较强的17-α羟化酶,常用于甾体转化。
(6)根霉(Rhizopus)
根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝,匍匐枝的末端生出假根,在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗,梗的顶端膨大形成孢子囊,囊内产生孢子囊包子。
孢子呈球形、卵形或不规则形状。
根霉可用于生产糖化酶、α-淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。
根霉有强的11-α羟化酶,是用于甾体转化的重要菌株。
(7)毛霉(Mucor)
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延,无假根。
菌丝体上直接生出孢子囊梗,一般单生,分枝较少或不分枝。
孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊,囊壁上常有针状的草酸钙结晶。
毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
2.4酵母
(1)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)
啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。
细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。
在麦芽汁培养基上,菌落为白色,有光泽,平滑,边缘整齐。
营养细胞可以直接变为子囊,每个子囊含有1~4个圆形光亮的子囊孢子。
啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外,还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。
(2)假丝酵母(Candida)
假丝酵母的细胞圆形,卵形或长形。
无性繁殖为多边芽殖,形成假菌丝,也有真菌丝,可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。
不产生色素。
在麦芽汁琼脂培养基上,菌落呈乳白色或奶油色。
假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。
具有较强的17-羟基化酶,可以用于甾体转化。
3.发酵工艺条件及其控制
◆微生物发酵产酶的一般工艺流程如图2-7所示:
保藏细胞
细胞活化
固定化细胞
原生质体
细胞扩大培养养
发酵
固定化原生质体
预培养
培养基
无菌空气
分离纯化
酶
图2-7微生物发酵产酶的工艺流程
3.1细胞活化与扩大培养
保藏的菌种在用于发酵生产之前,必须接种于新鲜的固体培养基上,在一定的条件下进行培养,使细胞的生命活性得以恢复,这个过程称为细胞活化。
活化了的细胞需在种子培养基中经过一级乃至数级的扩大培养,以获得足够数量的优质细胞。
种子扩大培养所使用的培养基和培养条件,应当适合细胞生长、繁殖的最适条件。
种子培养基中一般含有较为丰富的氮源,碳源可以相对少一些。
种子扩大培养时,温度、pH值、溶解氧等培养条件,应尽量满足细胞生长和繁殖的需要,使细胞长得又快又好。
种子扩大培养的时间一般以培养到细胞对数生长期为宜。
有时需要采用孢子接种,则要培养至孢子成熟期才能用于发酵。
接入下一级种子扩大培养或接入发酵罐的种子量一般为下一工序培养基总量的1~10%。
3.2培养基的配制
培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。
培养基的基本组分包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等几大类组分。
◆碳源:
碳源是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。
在一般情况下,碳源也是为细胞提供能量的能源。
大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物,如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。
◆氮源:
是指能向细胞提供氮元素的营养物质。
氮元素是各种细胞中蛋白质、核酸等组分的重要组成元素之一,也是各种酶分子的组成元素。
氮源是细胞生长、繁殖和酶的生产的必不可少的营养物质。
氮源可以分为有机氮源和无机氮源两大类。
有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物,例如,酪蛋白,豆饼粉,花生饼粉,蛋白胨,酵母膏,牛肉膏,蛋白水解液,多肽,氨基酸等。
无机氮源是各种含氮的无机化合物,如氨水,硫酸铵,磷酸铵,硝酸铵,硝酸钾,硝酸钠等铵盐和硝酸盐等。
不同的细胞对氮源有不同的要求。
应当根据细胞的营养要求进行选择和配置。
一般说来,动物细胞要求有机氮源;植物细胞主要使用无机氮源;微生物细胞中,异养型细胞要求有机氮源,自养型细胞可以采用无机氮源。
碳和氮两者的比例,即碳氮比(C/N),对酶的产量有显著影响。
所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素(C)的总量与氮元素(N)总量之比。
◆无机盐:
是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素,并对细胞内外的pH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。
无机元素是通过在培养基中添加无机盐来提供的。
一般采用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐等。
有些在微量元素在配制培养基所使用的水中已经足量,不必再添加。
◆生长因素:
是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。
主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。
氨基酸是蛋白质的组分;嘌呤、嘧啶是核酸和某些辅酶或辅基的组分;维生素主要起辅酶作用;动、植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分裂起调节作用。
在酶的发酵生产中,一般在培养基中添加含有多种生长因素的天然原料的水解物,如酵母膏、玉米浆、麦芽汁、麸皮水解液等,以提供细胞所需的各种生长因素。
也可以加入某种或某几种提纯的有机化合物,以满足细胞生长繁殖之需。
◆微生物发酵产酶常用的几种发酵培养基
微生物发酵产酶的培养基多种多样。
不同的微生物,生产不同的酶,所使用的培养基不同。
即使是相同的微生物,生产同一种酶,在不同地区、不同企业中采用的培养基亦有所差别。
必须根据具体情况进行选择和优化。
现举例如下:
(1)枯草杆菌BF7658α-淀粉酶发酵培养基:
玉米粉8%,豆饼粉4%,磷酸氢二钠
0.8%,硫酸铵0.4%,氯化钙0.2%,氯化按0.15%(自然pH)。
(2)枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基:
玉米粉4%,豆饼粉3%,麸皮3.2%,
糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(自然pH)。
(3)黑曲霉糖化酶发酵培养基:
玉米粉10%,豆饼粉4%,麸皮1%(pH4.4~5.0)。
(4)地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基:
玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH8.5)。
(5)黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶发酵培养基:
玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH5.5)。
(6)游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基:
糖蜜2%,豆饼粉2%,磷酸氢二钠0。
1%,硫酸镁0。
05%(pH7.2)。
(7)桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基:
淀粉水解糖5%,蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。
(8)黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基:
麸皮5%,果胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。
(9)枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基:
葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)
3.3pH值的调节控制
培养基的pH值与细胞的生长繁殖以及发酵产酶关系密切,在发酵过程中必须进行必要的调节控制。
不同的细胞,其生长繁殖的最适pH值有所不同。
一般细菌和放线菌的生长最适pH值在中性或碱性范围(pH6.5~8.0);霉菌和酵母的最适生长pH值为偏酸性(pH4~6);植物细胞生长的最适pH值为5~6。
细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。
细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。
有些细胞可以同时产生若干种酶,在生产过程中,通过控制培养基的pH值,往往可以改变各种酶之间的产量比例。
例如,采用米曲霉发酵生产蛋白酶时,当培养基的pH值为碱性时,主要生产碱性蛋白酶;培养基的pH值为中性时,主要生产中性蛋白酶;而在酸性的条件下,则以生产酸性蛋白酶为主。
随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累,培养基的pH值往往会发生变化。
这种变化的情况与细胞特性有关,也与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。
◆含糖量高的培养基,由于糖代谢产生有机酸,会使pH值向酸性方向移动;
◆含蛋白质、氨基酸较多的培养基,经过代谢产生较多的胺类物质,使pH值向碱性方向移动;
◆以硫酸铵为氮源时,随着铵离子被利用,培养基中积累的硫酸根会使pH值降低;
◆以尿素为氮源的,随着尿素被水解生成氨,而使培养基的pH值上升,然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降;
◆磷酸盐的存在,对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。
◆在氧气供应不足时,由于代谢积累有机酸,可使培养基的pH值向酸性方向移动。
所以,在发酵过程中,必须对培养基的pH值进行适当的控制和调节。
◆调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例;
◆也可以使用缓冲液来稳定pH值;
◆或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法,调节培养基的pH值,以满足细胞生长和产酶的要求。
3.4温度的调节控制
细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件。
在一定的温度范围内,细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢。
不同的细胞有各自不同的最适生长温度。
例如,枯草杆菌的最适生长温度为34~37oC,黑曲霉的最适生长温度为28~32oC等。
有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同,而且往往低于生长最适温度。
这是由于在较低的温度条件下,可以提高酶所对应的mRNA的稳定性,增加酶生物合成的延续时间,从而提高酶的产量。
但是细胞生长速度较慢。
若温度太低,则由于代谢速度缓慢,反而降低酶的产量,延长发酵周期。
在细胞生长和发酵产酶过程中,由于细胞的新陈代谢作用,会不断放出热量,使培养基的温度升高,同时,由于热量的不断扩散,会使培养基的温度不断降低。
为此必须经常及时地对温度进行调节控制,使培养基的温度维持在适宜的范围内。
◆温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。
为了及时地进行温度的调节控制,在发酵罐或其他生物反应器中,均应设计有足够传热面积的热交换装置,如排管、蛇管、夹套、喷淋管等,并且随时备有冷水和热水,以满足温度调控的需要。
3.5溶解氧的调节控制
细胞必须获得充足的氧气,使从培养基中获得的能源物质(一般是指各种碳源)经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。
◆在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。
在发酵过程中必须不断供给氧(一般通过供给无菌空气来实现),使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。
◆溶解氧的调节控制,就是要根据细胞对溶解氧的需要量,连续不断地进行补充,使培养基中溶解氧的量保持恒定。
◆细胞对溶解氧的需要量与细胞的呼吸强度及培养基中的细胞浓度密切相关。
可以用耗氧速率KO2表示:
KO2=QO2·Cc
式中,KO2为耗氧速率,指的是单位体积(L,mL)培养液中的细胞在单位时间(h,min)内所消耗的氧气量(mmol,mL)。
耗氧速率一般以[mmol氧/h·L]表示。
QO2为细胞呼吸强度,是指单位细胞量(每个细胞,g干细胞)在单位时间(h,min)内的耗氧量,一般以[mmol/h·g干细胞]或[mmol氧/h·每个细胞]表示。
Cc为细胞浓度。
指的是单位体积培养液中细胞的量。
以[克干细胞/L]或者[个细胞/L]表示。
◆氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数,以Kd表示。
溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。
其单位通常以[mmol氧/h·L]表示。
◆溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。
◆当溶氧速率和耗氧速率相等时,即:
K02=Kd的条件下,培养液中的溶解氧的量保持恒定,可以满足细胞生长和发酵产酶的需要。
◆调节溶解氧的方法主要有:
(1)调节通气量:
通气量是指单位时间内流经培养液的空气量(L/min).也可以用培养液体积与每分钟通入的空气体积之比(VVM)表示。
例如,1M3培养液,每分钟流经的空气量为0.5M3,即通气量为1:
0.5;
(2)调节氧的分压:
提高氧的分压,可以增加氧的溶解度,从而提高溶氧速率。
(3)调节气液接触时间:
气液两相的接触时间延长,可以使氧气有更多的时间溶解在培养基中,从而提高溶氧速率。
(4)调节气液接触面积:
氧气溶解到培养液中是通过气液两相的界面进行的。
◇为了增大气液两相接触面积,应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。
◇在发酵容器的底部安装空气分配管,使气体分散成小气泡进入培养液中,是增加气液接触面积的主要方法。
◇装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散,也可以有效地增加气液接触面积,从而提高溶氧速率。
(5)改变培养液的性质:
培养液的性质对溶氧速率有明显影响,若培养液的黏度大,在气泡通过培养液时,尤其是在高速搅拌的条件下,会产生大量泡沫,影响氧的溶解。
◇可以通过改变培养液的组分或浓度等方法,有效地降低培养液的黏度;设置消泡装置或添加适当的消泡剂,可以减少或消除泡沫的影响,以提高溶氧速率。
3.6提高酶产量的措施
◆添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂等。
3.6.1添加诱导物
◆对于诱导酶的
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