实验二碱性磷酸酶的提取及其比活性测定docx.docx
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碱性磷酸酶的提取及其
比活性测定
带教:
张学礼、戴薇薇
龚张斌、黎志萍
材料选择——►细胞的破碎——►分离纯化
m・14^^s(alp》akp)
Alkalinephosphatase
\实验目的
1、掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶
的原理和方法;
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算;
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方
法。
二、实验原理
1、AKP概述
①催化有机单磷酸酯水解,并有转移磷酸基的作用
0
CgHs—0—P—ONa+H20竺Q5H5OH+血叭
ONa
4体内位置:
细胞膜表面
-肾小管的筛状缘
-肠粘膜的微绒毛-胆小管的细胞膜缘
-肝窦状腺表面
-胎盘合体细胞滋养层细胞外表面
5正常血清:
ALP主要来自肝(或胆管)和骨骼,约各占总活性的一半。
6临床意义:
血清ALP活力增高常见于
-肝胆疾病(胆道阻塞等)-骨骼疾病(佝偻病等)
■■甲状腺功能亢进-妊娠和生长期儿童
2、AKP的分离、提取、及纯化
整个制备过程可分为5个阶段:
1材料的选择和预处理,
2细胞的破碎,
3提取,
4纯化(包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳
等),
5浓缩、干燥及保存。
1取材
取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织
本次实验:
肝脏
2生物组织与细胞的破碎
>机械破碎法:
高速组织捣碎机、匀浆器、研钵
>渗透破碎法:
低滲条件使细胞溶胀而破碎
>反复冻融法:
>超声波法:
超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎
>酶法:
如用溶菌酶破坏微生物细胞
3选择合适分离提取方法
(把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分
子物质(核酸、脂类、多糖)去除掉
把酶从溶液中提取出来
有机溶剂方法
有机溶剂分段沉淀法
原理:
利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。
有机溶剂:
1正丁醇
能去除与pro结合的脂类物质,使pro溶解在溶
液中
2
乙醇
3丙酮
33%AKP溶解状态
50%AKP沉淀状态”
4保护酶活性措施
a・低温条件下操作
b.所有试管均需洗干净c.选择合适的pH及合适的缓冲体系,以稳定
酶活性
Mg(Acb~NaAc混合液提取AKP
保护和稳定AKP
pH8.8Tris缓冲液测AKP活性
1、操作步骤
2g新鲜兔肝剪碎-匀浆管
I加0.01MMg(Ac)2・001MNaAc
I混合液2ml,匀浆
匀浆液入离心管
用4ml上述混合液冲洗匀浆器,并倒入离心管,混匀,记体积Va
0.1mlA液+
0.1mlA液+
4・9ml生理盐水
(待测蛋白质含量)
4.9ml0.01MpH8.8Tris
剩余A液
加2ml正丁醇,搅拌
3-5*,室温放置30',
过滤,入离心管
上述滤液
I加等体积冷丙酮,混匀,
离心2000rpm、5分钟
上清入回收瓶
沉淀
|加4.0ml0.5MMg(Ac)2,尿拌,记体积Vb
)
0.10mlB液+
4.9mlO.OIMpH8.8Tris
B2管
0.1mlB液+
4.9ml生理盐水
(待测酶活性)
(待测蛋白质含量)
剩余B液Vb'
加0・45Vb‘冷乙醇96%—30%,混匀,离心2500rpm,5分钟
上清
弃沉淀
入离心管,记体积VbS加0.83Vb“冷乙醇96%
(30%—60%)混匀,离心2500rpm,5分钟
沉淀
加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液4ml,搅拌,记体积VC
剩余C液Vc・
0.1mlC液+
0.4ml生理盐水
O.lOmlC液+
1.9mlO.OIMpH8.8Tris
加0・5Vc,冷丙酮—33%,混匀,离心2000rpm,5分钟
剩余D液
弃沉淀
上清
入离心管,记体积Vc笃加1/3VL冷丙酮—50%,混匀,离心2000rpm,5分钟
、
沉淀
0.10mlD液+
0.9mlO.OIMpH8.8Tris
二、实验原理
3、建立测定酶比活性的方法
比活性:
指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位
比活性=酶活性单位数/mg蛋白
1②
①测定酶活性
磷酸苯二钠法原理:
磷酸苯二钠上匚苯酚2(CN)6-酿类化合物
4・氨基■安替比林
入=510nm
AKP活性单位定义:
37°C5
反应15分钟,产生1ug苯酚
一个AKP活性单位(u)
立即混匀。
将各管置于37°C水浴精确保温15分钟
立即混匀。
终止酶促反应,室温静置10分钟。
战0调零,
A=510nm比色,记录各管OD。
计算酶活性:
各制剂总AKP单位数(U)
=查表所得值X稀释倍数X总体积
(标准曲线)
注:
A〕、B[、G、D液分别稀释50、50、20、10倍
2测定蛋白质含量
考马斯亮蓝法
(CoomassieBrilliantBlueG-250,Bradford法)
+蛋白质
蛋白质-染料复合物
595nm
试剂(ml)
B
1
2
3
4
生理盐水
0.10
A2稀释液
0.10
B2稀释液
0.10
C2稀释液
0.10
溶液D
0.10
考马斯亮兰试剂
5
5
5
5
5
混匀。
2分钟后,巴0调零,A=595nm比色,记录各管0D。
计算蛋白质含量:
各制剂总蛋白含量(mg)
=查表所得值X稀释倍数X总体积
注:
A2.B2.C2液分别稀释50、50、5倍
3各制剂的比活性,得率及纯化倍数的计算
1、AKP比活性:
每ml制剂中AKP活性单位数(U)
AKP比活性(U/mg)=
每ml制剂中蛋白质含量(mg)
2、得率
每一制剂中总的酶活性单位
得率=
X100%
溶液A中总的酶活性单位
3、纯化倍数
纯化倍数=
每一制剂AKP比活性(U/mg)
溶液A制剂AKP比活性(U/mg)
总体积(ml)蛋白含量(mg/ml)总蛋白量(mg)
AKP活性单位(U7r环总AKP活性单位而'比活性(u/mg)纯化倍数
有机溶剂体积的计算一96%乙醇
Vb,中加乙醇96%
(VBZ+Vx)X30%=96%XVx
Vb"中加乙醇(96%)从30%―60%
(Vb〃+Vx)X60%・Vb〃X30%=96%XVx
Vx
=5/6(0.83)V
//
注意事项
1
2
3
4
5
低温条件进行
有机溶剂边加边搅拌
加完有机溶剂后,立即离心,分析沉淀
加有机溶剂的量计算精确
乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理
代表:
有色物质对光的吸收能力
」三三二
Lambert定律:
A*L
ABeei•定律:
Aocc
»合并Lambert-Bee律:
A8C・L
即:
A=K・C・L
摩尔吸光系数
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