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人血清Exosome的分离及其miRNA表达特性的研究

人血清Exosome的分离及其miRNA标志物分析方法的建立

李卓，康炜，李蕊，郝晓柯，马越云

【摘要】目的分离、鉴定人血清中的Exosome，检测其中miRNA含量和质量，探讨将人血清中ExosomalmiRNA作为疾病分子标志物的可行性。

方法采用ExoQuick从人血清中分离Exosome，分别用透射电镜、NanoSight纳米颗粒分析仪和WesternBlot对其进行形态学和分子表型鉴定，使用Agilent2100生物分析仪进行ExosomalRNA质量分析。

通过qRT-PCR检测ExosomalmiRNA，并对血清不同组分的miRNA表达量进行比较分析。

结果从人血清中可以分离获得圆形或椭圆形囊泡样物，直径主要集中在40-100nm，最大分布峰值为58nm，表达热休克蛋白Hsp70和四跨膜蛋白CD63，确系Exosomes；Agilent2100生物分析仪结果显示，该Exosome中的RNA组分主要为约25nt的小RNA，提示可能为miRNA；qRT-PCR检测证实4种常见miRNA在人血清Exosome中均有表达；进一步对血清的不同组分进行比较，发现Exosome中miRNA的表达量高于全血清样本和去除Exosome的上清（P<0.05）。

结论人血清中可以有效分离到Exosome，其中存在较高浓度的miRNA。

分离血清Exosome有利于循环miRNA类的疾病标志物的检出。

【关键词】Exosome；血清；miRNA

EstablishamethodforseparationandanalysisofmiRNAmarkersforserumexosome

LiZhuo*,KangWei,LiRui,HaoXiaoke,MaYueyun

*DepartmentofClinicalLaboratory,XijingHospitalAffiliatedtoFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.*DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China

Correspondingauthor:

MaYueyun,Email:

cmbmayy@

【Abstract】ObjectiveToisolateandidentifyexosomesfromhumanserum,analyzetheexpressioncharacteristicsofexosomalmiRNA,andexplorethefeasibilityofdetectingexosomalmiRNAinhumanserum.MethodsExosomeswereisolatedfromhumanserumusingExoQuick,andthenidentifiedbyusingtransmissionelectronmicroscopy,NanoSightnanoparticleanalyzerandWesternBlotformorphologyandmolecularphenotype.ThequalityofexosomalRNAwasanalyzedusingAgilent2100Bioanalyser.ThenqRT-PCRwascarriedouttodetectexosomalmiRNAsindifferentcomponentsofhumanserum.ResultsExosomesisolatedfromhumanserumshowedroundorovalvesicles,mainlyindiameter40-100nm,andwithmaximumpeakat58nm.Moreover,theyexpressedHsp70andfourtransmembraneproteinCD63.Agilent2100BioanalyzerresultsshowedthatthemajorRNAcomponentofexosomewasabout25ntsmallRNA,suggestingthatitmaybemiRNA.qRT-PCRanalysisconfirmedthat4miRNAswereexpressedinhumanserumexosome.Itwasfurtherfoundthatthe expressionof miRNAsinexosomepelletswerehigherthanthewholeserumandexosome-depletedsupernatant（P<0.05）.Conclusion Exosomes,whichexpressmiRNAs,canbeisolatedfromhumanserum.Separationofserumexosome maybehelpfultoimprovethe detection ofthesecirculatingmiRNAs.

【Keywords】Exosome;Serum;miRNA

外周血因其具有创伤小、易获取、可重复、可检测指标众多等优点，一直是临床疾病标志物检测的主要标本来源。

近年研究发现，外周血中存在内源性循环miRNA，且因其具有较高的稳定性和特异性，有望成为诸如肿瘤等多种疾病的生物学标志物[1]。

然而，循环miRNA的检测效率却由于含量低等原因不能满足临床检测要求。

Exosome[2]是细胞释放到胞外环境中的膜性小囊泡，直径约为40-100nm。

有研究者提出假说，循环miRNA主要存在于Exosome中[3,4]。

有可能成为良好的检测血清miRNA的来源。

为此，本研究从人血清中分离并鉴定Exosome，采用qRT-PCR验证ExosomalmiRNA的存在，进而对血清不同组分中miRNA的含量进行比较分析，以探讨外周血中循环miRNA与Exosome的关系，从而为进一步寻求新的疾病生物学标志物奠定研究基础。

材料与方法

一、材料

1．主要仪器与试剂：

TecaiG2Spirit透射电子显微镜（美国FEI公司），NanoSightLM10-HS纳米颗粒分析仪（英国Malvern公司），Qubit2.0荧光计（美国LifeTechnologies公司），Agilent2100生物芯片分析系统（美国AgilentTechnologies公司），7500FastReal-TimePCR仪（美国AppliedBiosystems公司）；ExoQuickExosome沉淀试剂、SeraMirExosomeRNA提取试剂盒（美国SystemBiosciences公司），兔抗人HSP70抗体、兔抗人CD63抗体（美国RayBiotech公司），Real-TimePCR试剂盒（大连TAKARA公司），Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR引物（广州锐博公司）。

2．血清来源：

10名西京医院门诊体检健康男性，年龄40~65岁，空腹采集静脉血5mL，室温静置30min，3000×g离心15min，留取血清。

二、方法

1．血清Exosome提取：

将血清1.5mL3000×g离心15min，去除残留细胞及细胞碎片，转移上清至新管，用0.22μm孔径的滤膜进行过滤。

采用ExoQuickExosome沉淀试剂提取血清Exosome，具体操作依照说明书进行。

取500μL过滤后的血清，加入120μLExoQuick试剂，充分混匀。

4℃静置30min，1500×g离心30min，弃上清。

再次1500×g离心5min，尽弃上清，所得沉淀即为Exosome。

2．透射电镜观察Exosome：

将离心所得的Exosome沉淀物溶解于50μLPBS中制成悬液，载样于铜网上，室温静置2min，用滤纸轻轻从侧面吸干液体，滴加磷钨酸溶液20μL于铜网上，室温负染2min，滤纸吸干液体。

自然干燥后采用透射电子显微镜进行观察。

3．NanoSight纳米颗粒分析仪检测Exosome：

将离心所得的Exosome沉淀物溶解于500μLPBS中制成悬液，1:

4000稀释，充分混匀后取300μL上机，采用NanoSightLM10-HS纳米颗粒分析仪进行粒径和浓度分析。

4．WesternBlot检测：

采用BCA法进行Exosome蛋白定量。

分别取Exosome沉淀物和去除Exosome的血清蛋白样品各20μg，按标准操作进行WesternBlot检测。

12%SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜，室温封闭1h，分别加入兔抗人CD63和HSP70抗体（1:

1000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1:

5000稀释），采用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行结果扫描。

5．ExosomalRNA提取和鉴定：

按照SeraMirExosomeRNA提取试剂盒操作说明，采用吸附柱进行RNA富集，每500μL血清来源的Exosome最终可得到约30μLRNA溶解液。

采用QubitRNA定量仪对其进行浓度测定，并采用Agilent2100生物分析仪进行RNA质量分析。

6．逆转录反应：

采用PrimeScriptTM逆转录试剂盒和miRNA特异性茎凸环结构引物进行逆转录。

总反应体系为10μL，包括2μL逆转录缓冲液、0.5μL逆转录酶混合物（含dNTP、RNA抑制剂）、0.5μL特异性逆转录引物（2μM）、500ngRNA，余量用Rnase-FreedH20补足。

上述体系轻柔混匀、离心，按如下条件进行逆转录反应：

42℃15min，85℃5sec。

7．实时荧光定量PCR检测：

成熟miRNA的表达水平，采用SYBR®PremixExTaq™（PerfectRealTime）试剂进行实时荧光定量PCR检测。

反应体系为20μL，包括10μL2×SYBR®PremixExTaqTM，正、反向引物（10μM）各0.4μL，ROXReferenceDyeⅡ0.4μL，cDNA2μL，双蒸水6.8μL。

每个miRNA检测设3个平行复孔，使用ABI7500FastReal-TimePCR仪，反应条件为：

95℃30sec预变性，95℃3sec、60℃30sec，40个循环。

反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。

引入cel-miR-39作为外参，采用2-ΔΔCT计算miRNA的相对表达量。

数据用GraphPadPrism5软件进行分析。

结果

一、人血清Exosome的提取：

经过ExoQuick试剂分离，所有血清样本均可提取到Exosome沉淀物，为淡黄色脂样沉淀。

二、人血清Exosome的鉴定

1．形态学鉴定：

Exosome提取物经透射电子显微镜下观察，呈圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径约40-100nm，包膜完整，内为均一的低电子密度物质。

整个观察视野中，未见细胞碎片及其他亚细胞器（图1）。

NanoSight纳米颗粒分析仪检测结果显示，提取物的直径主要集中在40-100nm，最大分布峰值为58nm，浓度为1.46x108个/ml（图2）。

2．分子表型鉴定：

经WesternBlot分析，血清Exosome样本中可见明显的Exosome标志物HSP70和CD63的表达条带，而去除Exosome的血清上清液中二者均未能检测到（图3A）。

3．ExosomalRNA质量分析：

将提取到的ExosomalRNA采用Agilent2100进行RNA组分分析，结果显示其中富含约25nt的小RNA，而18SrRNA、28SrRNA未测得。

提示人血清来源的Exosome中主要成分可能为microRNA（图3B）。

三、血清Exosome中miRNA的表达情况：

为明确血清Exosome中是否含有miRNA，我们首先分离血清Exosome，提取RNA，选取4种常见miRNA（分别为miR-21，miR-16，miR-20a和let-7a）[10,18]采用qRT-PCR进行检测，并将CT值小于40定为可检出限。

结果表明，20例样本中均可检出4种miRNAs的表达（图4）。

证实了血清Exosome中确有miRNA。

四、ExosomalmiRNA与血清中游离miRNA的表达比较：

为进一步探究血清中miRNA的分布情况，我们分别对血清Exosome与相应去除Exosome的血清上清以及不做处理的全血清提取RNA，引入cel-miR-39作为外参，并进行qRT-PCR检测。

结果显示，Exosome沉淀与上清中均可不同程度的检出miRNA，且Exosome中4种miRNA的相对表达量均显著高于去除Exosome的上清（6.61±0.27至8.36±0.28倍）（P<0.001）和全血清样本（3.83±0.02至5.17±0.43倍）（P<0.05）（图5），即血清中ExosomalmiRNA的含量显著高于全血清样本和去除Exosom血清上清，提示miRNA在血清中的表达有可能主要来自Exosome，分离血清Exosome有利于提高循环miRNA的检出灵敏度。

讨论

Exosome是细胞多泡体（MVB）与质膜融合并把其内含有的小泡释放到胞外基质中而形成的一类膜性小囊泡，直径约为40-100nm，最初由Johnstone等[5]从网织红细胞的培养上清液中分离所得。

随后，研究发现多种细胞均可形成并分泌Exosome（如树突状细胞、肥大细胞、T/B细胞、血小板、上皮细胞、肿瘤细胞等），不同来源的Exosome会携带其来源细胞的蛋白质、脂类和RNA，因此可以提示机体的某些疾病变化，从而作为疾病诊断的依据[6-8]。

此外，Exosome形成后，既可以分布在分泌细胞周围，也可以通过血液和体液迁移到其它部位。

但是，由于Exosome体积小、密度低，不易获取，一定程度上制约了人们对它的研究。

Exosome的分离方法众多，如滤膜过滤法、蔗糖梯度离心法、免疫磁珠法、色谱法等，其中以超速离心法最为常用，但其耗时长、对设备和人员要求高，在临床应用中可操作性较差。

本研究选用ExoQuick沉淀试剂进行血清Exosome分离，操作简便、省时。

此外，也有研究者对血清、尿液Exosome的多种分离方法分别进行了比较，结果发现用ExoQuick沉淀试剂分离到的Exosome含量最高，适于进行RNA检测；而超速离心法分离到的Exosome则更适于进行蛋白质分析[9,10]。

Exosome有其独特的特性。

透射电镜下，Exosome呈圆形或椭圆形低电子密度囊泡，包膜完整，直径约40-100nm，密度介于1.10-1.18g/mL之间。

本研究中观察到的血清Exosome与之形态一致。

此外，虽然不同细胞来源的Exosome中所含成分不尽相同，但由于都来自晚期核内体，几乎所有Exosome的形成都需要热休克蛋白（HSP）、四跨膜蛋白（CD63，CD9，CD81和CD82）、MHCI类或II类分子、整合素、细胞骨架蛋白及一些生物酶类的参与[11,12]，因此，人们通常将这些特异的蛋白质作为区分和鉴定Exosome的分子标志物。

本研究中我们选用热休克蛋白HSP70和四跨膜蛋白CD63作为人血清来源Exosome的鉴定指标。

WesternBlot结果表明，用ExoQuick从人血清中分离出的Exosome可检测到这两种蛋白标志物，从而进一步证实了血清Exosome的存在和该分离方法的可靠性。

miRNA是一类19-24个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，生物信息学预测表明，miRNA能调控超过60%的基因，在细胞发育、分化、增殖、凋亡、迁移及代谢等多种过程中都有重要作用[13]。

自2008年从血清和血浆中分离出循环miRNA以来，越来越多的研究表明，miRNA可以稳定存在于多种体液中，细胞外miRNA的异常表达与人类的机体变化密切相关，有望成为多种疾病的生物标志物[14,15]，但由于外周血中循环miRNA含量低，导致临床应用受到极大限制。

细胞外miRNA稳定性和起源的研究表明，细胞通过Exosome包裹分泌出miRNA，同时Exosome中的miRNA比细胞内呈现出更高的浓度[3,16,17]。

为确认血清Exosome中miRNA的含量和质量，我们采用Agilent2100生物分析仪对ExosomalRNA进行了鉴定，结果表明其中的RNA组分主要为约25nt的小RNA，提示可能系miRNA。

随后我们确认了了4种已报道miRNA（miR-16，miR-21，miR-20a，let-7a）[10,18]的确在Exosome中有表达，并发现Exosome沉淀中miRNA含量显著高于全血清样本中和去除Exosome的上清，提示血清中的循环miRNA可能主要来自Exosome。

因此，分离血清Exosome有利于提高循环miRNA的检出。

miRNA是多种疾病，特别是多种肿瘤的良好标志物，进一步探讨疾病过程中ExosomemiRNA的表达差异，有可能为其临床检测提供有效的手段。

另一方面，对ExosomalmiRNA的分泌机制的研究尚处于探索初期，要想进一步明确其临床应用价值，还有很长一段路要走。

但随着研究的不断深入，Exosome必将会有广阔的临床应用前景。

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