关于所有PCR总结模板计划模板doc.docx
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PCR总结
若模板为环状质粒,最好先用酶将其切开成线性分子。
酵母、细菌及质粒基因组,每次反应的模板最大加入量分别为10ng,1ng和1pg。
引物的设计原则
1.引物的长度应适宜,一般要求18~25bp,一对引物中两
个引物之间的长度差异应小于3bp。
2.基本成分:
G+C的含量一般为40%~60%。
四种碱基应
随机的分布,避免碱基堆积的现象。
尤其引物的3’端,不应有
连续的3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从
而影响PCR的特异性。
3.引物自身:
引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列,否则引物自身会折叠形成发夹结构,将影响
引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
4.引物之间:
引物之间不应存在互补序列,尤其应避免
3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。
由于PCR反应体系中含
有高浓度的引物,即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会
使引物相互杂交,最终得到引物二聚体的扩增产物。
若引物二
聚体在PCR反应的早期形成,它们将通过竞争DNA聚合酶、引
物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。
通过精心设计
引物、应用热启动PCR(hotstartPCR)或者降落PCR(touchdownPCR)及特制的DNA聚合酶,可以减少引物二聚体的生成。
5.3’末端:
引物的3’端(羟基端)是引发延伸的起点,因此一定要与模板准确配对,应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。
引物3’端最佳碱基的选择是G和C,因为他们形成的碱基配对比较稳定。
6.溶解温度:
3’端引物和5’端引物应有相似的Tm值(不同序列的DNA,Tm值不同。
DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。
),其差别不应大于5℃。
扩增产物与引物的Tm值的差别应小于10℃,以确保PCR循环中的扩增产物有
效的变性。
8.引物的特异性:
引物与非特异扩增序列的同源性不要超
过70%或有连续8个碱基同源。
9.引物的简并性:
引物的3’端应为保守的氨基酸序列,即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp,且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
引物的用量
在PCR反应体系中,引物的浓度一般要求在0.1~0.5μM之间,这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩
增30次。
引物浓度过低,则产物量低;引物浓度过高则会促进
引物二聚体的形成以及非特异性产物的形成。
反应缓冲系统
反应缓冲系统提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。
目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3~8.8,20℃),在72℃时,其pH值为7.2左右。
反应缓冲系统中还含有KCl,50mM以内的KCl有利于引物的退火,而50mM以上的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性。
然而,也有
人认为含有50mMKCl的缓冲系统有利于大于500bp的DNA片段的扩增,然而将缓冲系统中的KCl浓度提高到70~100mM则有利于提高较小的DNA片段的扩增产量。
Mg
2+
反应体系中
Mg2+浓度低时,酶的活力显著降低
;过高时,酶
则催化非特异性扩增。
此外,Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生
成等。
值得注意的是,由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度,
因此一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。
dNTPs
许多厂商出售专门用于PCR的dNTP(deoxy-
ribonucleoside
dATP,dGTP,
triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写。
是包括
dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称。
在各种PCR(RT-
PCR、Real-time
PCR
)中起原料作用
)储存液。
这种储存液
具有较强的酸性而不含焦磷酸盐,其目的是保护
dNTP在储存液的冷冻和加热期间受到破坏。
因此
在使用前应用NaOH将pH值调至7.0~7.5。
无论是自
配的还是购买的dNTPs溶液在储存前都应分成较小
的几份,然后在-20℃下储存,经过两次冷冻-加热
循环后储存液就必须丢弃。
若长期在-20℃下冻
存,储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存
容器上,因此储存dNTP液的容器在加热后应在微
型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。
PCR的反应条件的选择
退火温度确定后,退火的时间并不是关键性的因素,但也应加以控制。
退火时间过短,会导致延伸失败;而退火时间太长会
增加引物与模板间的非特异性结合。
目的序列上并不存在的附加
序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物
5'端而不影响特异
性。
当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和
内部二级结构的检测。
引物的另一个重要参数是
熔解温度(Tm)。
这是
当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。
Tm对于设定PCR
退火温度是必需的。
在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目
的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
合理的退火
温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的
Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。
第一个公
式来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于
18碱基的引物。
第二个公式根
据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
表5.估算Tm的公式
如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。
或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。
循环在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1℃到2℃,直到退火温度低于Tm5℃。
只有同同源性最高的目的模板会被扩
增。
这些产物在随后的循环中继续扩增,并会将扩增的非特异性产物排挤出去。
递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用,如AFLPDNA指纹分析
通常的PCR反应体系中,dNTP的浓度应在20~200μmol/L之间,在此范围内,PCR的产量、特异性和忠实性之间的平衡最佳。
由于Taqpol没有校正阅读功能,在扩增过程中可引起碱基错配,通常可应用低浓度的dNTP(各
20μmol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度,可提高Taqpol的忠实性。
此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taqpol的错配率约为0.25%)。
在其它参数最佳的时候,
每100μl反应液中加入1~2.5U的Taqpol为最佳。
通常在100μl的反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验酶的最佳浓度。
循环参数
1.变性:
变性的温度取决于模板DNA分子的G+C含量和DNA聚合酶的热稳定性,而变性的时间与模
板DNA链的长度及DNA聚合酶的热稳定性有关。
在90℃~97℃的温度范围内,即使再复杂的DNA分子也可以变性成为单链。
通常的变性温度和时间分别为95℃、30秒,有时用97℃、15秒。
尽管DNA在
其链分解温度(strandseparationtemperature,Tss)时
的变性只需几秒钟,然而要使反应管内部达到Tss还需要一定的时间,因此需要延长变性时间。
通常在加入耐热DNA聚合酶之前先使模板在97℃下变性
7~10min,再按94℃或95℃的温度进入循环。
通常G+C含量约为55%的线性模板DNA分子的变性温度和时间为94~95℃45秒。
扩增100~300bp的短片段时,可用简便、快速的两步PCR法,同时在5~10个循环后,可将变性温度降至87℃~90℃以改善PCR的产量。
此外,由于环状DNA复性太快,通常待扩增的环状质粒DNA模板在扩增前最好先酶切线性
化。
2.退火:
合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。
通常引物与模板的退火温度在45~55℃之间,一般情况下在Tm值允许的范围内选择偏高的退火
温度以提高PCR反应的特异性。
优化退火温度的最理想的方法是设置一系列的对照反应。
即通过在低
于计算出的引物Tm值2℃到10℃的温度范围内进行退火的一系列平行反应来确定最佳退火温度。
此外我们还可以通过在低于计算出的引物Tm值2℃到
10℃的范围内由高到低的设定同一反应体系中连续的不同循环的退火温度从而确定最佳退火温度,即降落PCR。
3.延伸:
延伸温度取决于所使用的耐热DNA聚合酶的最适作用温度,一般为70~75℃。
通常扩增
1kb以内的DNA片段延伸1min即可,而当待增序列长达3~4kb时,则需延长3~4min;然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤,因为在退火温度下TaqDNA聚合酶的活性已足以完成靶序列的合成。
应注意在前几轮循环中的延伸时间要足够,以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。
此外当待扩增DNA的浓度较低时,由于碱基掺入率较低,可适当的延长反应延伸时间。
循环次数:
当待增靶序列数分别为×5、
4.310
1.5×10?
4、1×103和50拷贝分子时,最适循环数分别
为25~30、30~35、35~40和40~45次。
降低错配几率
通常在反应体系中加入的模板数应为102~105拷贝,以降低错配几率。
当反应体系中的dNTP浓度明显低于Km值
(dNTP<1μmol/L)或者某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错配碱基的掺入。
当dNTP浓度过高(>1mmol/L)时则会促进错配碱基的延伸。
因
此,在PCR反应体系中应采用较高浓度的dNTP,且四种dNTP的浓度应相同。
通常,当每种dNTP浓度
为10~50μmol/L时,能够最大程度的保持PCR反应的忠实性。
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液
10ul
4种dNTP混合物
各200umol/L
引物
各10~100pmol
模板DNA
0.1~2ug
TaqDNA聚合酶
2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水至
100ul
引物量:
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,
dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris-HCL的缓冲液将
其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP
降解。
在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP
的浓度要相等(等摩尔配制)。
Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的
PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~
2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,
浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,但是包含200μMdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM。
较高的游离镁离子浓度可以增加产量,但也会增
加非特异性扩增,降低忠实性。
为了确定最佳浓度,从1mM到3mM,以0.5mM递增,进行镁离子滴定。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增,延伸时间要
稍长些。
引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。
1、先按以下经验公式稀释引物:
2000×OD/引物长度(bp)=加水体积(μl),这样稀释出的引物浓度为50μM(记得配引物前,干粉状引物一定要先离心);
2、配制PCR反应Mix,体系如下(以配100次反应为例):
10×buffer(含镁离子):
2.5μl
dNTPs(10mM):
0.5μl
F-prime(50μM):
0.125μl
R-prime(50μM):
0.125μl
补水至总体积为5μl
以上各物质均乘100,即配成100次反应Mix,混匀,-20度冻存备用。
3、需要做PCR时,取出Mix,配制反应体系如下:
水:
18μl
Mix:
5μl
模板:
1μl
酶(1U/μl):
1μl
总体积25μl,混匀即可。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
其对策有:
①减少酶量,或调换另一来源的
酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量,减少循环次数。
表1.反应成分
ComponentFinalConcentration
Template
10^4-10^6copiesofDNAtemplate
Primer1
0.1-0.5μM
Primer2
0.1-0.5μM
10XReactionbuffer
1X
Magnesium
1.0-3.0mM
dNTPmix
200μMeachdNTP
ThermostableDNA
1-4units/100mlreaction
polymerase
Target
Amountof
GenonicDNA
Size(bp)*
Molecules/μg
DNA(μg)for
ofGenomicDNA
-10^5Molecules
E.coli
4.7×10^6
1.8×10^8
0.001
Saccharomyces
2.0×10^7
4.5×10^7
0.01
cerevisiae
Arabidopsis
7.0×10^7
1.3×10^7
0.01
thaliana
Drosophila
1.6×10^8
6.6×10^5
0.5
melanogaster
Homosapiens
2.8×10^9
3.2×10^5
1.0
Xenopus
2.9×10^9
3.1×10^5
1.0
laevis
1.0Mus
3.3×10^9
2.7×10^5
1.0
musculus
Zeamays
1.5×10^10
6.0×10^4
2.0
pUC18
2.69×10^3
3.4×10^11
1×10^(-6)
plasmidDNA
*Haploidgenomesize
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋
白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,
SDS还能与蛋白质结合而沉
淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与
DNA结合的组蛋白,再用有
机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
蛋白酶K的主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白,是DNA提取的关键试剂。
苯酚的pH6.0,呈酸性,在酸性环境下DNA可溶于有机溶剂,且酸性条件可使DNA变性降解,因此在提取DNA前,苯酚需用Tris-HCl平衡至pH8.0,以防酸性苯酚溶解DNA。
氯仿的作用是使蛋白变性,除去蛋白酶、去垢剂及残留蛋白。
其次氯仿的另一作用是有助于水相与有机相分离及除去酚抽提后水相中残留的酚。
异戊醇的作用主要是消除在抽提过程中产生的泡沫。
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