QTRAPIDA指南.docx
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QTRAPIDA指南.docx
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QTRAPIDA指南
IDA指南
InformationDependentAcquisition(IDA)自动关联扫描能够在一个色谱过程中进行MS/MS谱的“onthefly”采集。
AnalystSoftwareIDA通过组合特定的surveyscans,高分辨扫描和灵敏的子离子扫描产生大量有用的MS/MS数据。
在一个典型的IDA实验中,surveyscan产生了一个所有出现离子的峰列表。
峰列表根据用户定义的标准除去不想要的母离子。
留下的离子则进行MS/MS实验。
这个循环在整个采集过程中不断重复,产生了大量的信息丰富的数据。
由于QTRAPTMSystem仪器灵活性强,有多种不同的扫描选择,所以IDA功能强大而灵活。
多个水平的MS/MS和MS/MS/MS可以以完全自动的方式执行。
IDA实验可以手动方式建立或者借助IDAWizard帮助。
本指南介绍采用这两种方式建立IDA实验。
另外还描述了一些用于蛋白质组学的典型方法;蛋白质鉴定的标准方法,在多肽混合物中筛选磷酸化位点的方法。
注意:
关于不同扫描方式的更多信息参见QTRAPTM系统的LIT扫描模式。
6.1击活硬件Profile
打开导航栏(屏幕的左边)中的HardwareConfigurationEditor,选择与MS系统相联的LC系统的合适的硬件配置并击活Profile。
这些外围设备将自动加入到IDA方法中,所以必需提前选好。
关于硬件Profile更多的信息参见LCPackingSystem指南或者AgilentcapLC系统指南。
6.2IDAWizard
双击导航栏的Acquire部分的IDAMethodWizard,可以登录IDAWizard。
建立IDAExperiment的窗口如下。
IDAWizard简化了建立IDAExperiment的过程。
Wizard包括了三个IDAMethod,可以采用4个surveyscans。
前两个采用线性离子阱MS扫描作为surveyscans,即EMS和EMC扫描,然后击发EPI从属扫描。
第三个选择是用三重四极杆建立实验,即用母离子扫描或中性丢失扫描作为surveyscans击发EPI从属扫描。
(关于不同扫描方式的更多信息参见QTRAPTM系统的LIT扫描模式,或QTRAPTM系统的四极杆扫描模式。
)
6.3使用IDAWizard建立一个蛋白鉴定的IDA方法
第一个介绍的IDA实验是一个典型的蛋白鉴别实验,得到尽可能多的多肽的高质量的MS/MS数据。
任何一种LITMS扫描都适合这个实验,本实验采用EnhancedMS>>EnhancedProductIonscan选择。
强烈推荐这类实验中使用EnhancedResolutionScan。
母离子的精确性较好,而且可以精确断定离子的电荷状态。
其信息优势远远超过执行该扫描所花费的少量的时间。
如下所示两个框均打勾后,点击Next。
在下面的窗口中,EnhancedMSSurveyScan的参数被设定。
测定多肽质量数的典型的扫描范围为400-1200amu,在Startmass/StopMass窗口输入该质量范围。
由于母离子的分辨率将在ER扫描中获得,所以使用最快的扫描速度(4000amu/sec)。
最后,LITfilltime默认为20ms,在大多数情况下都是好的设置。
但是,如果对于样品有一定的信息,也可以进行调整。
如果希望得到数量多的多肽则将filltime减少到10ms。
如果需要增加灵敏度则将filltime增加到20-50ms。
点击Next继续。
下面的窗口定义DependentScan的参数。
一般地,每次对最强的1-3个多肽进行MS/MS。
如下所示,在窗口上方设定。
EPI实验的碰撞能量(CE)可以通过两种不同的方式设定。
选择的每一个母离子可以至多有三个不连续的碰撞能量。
例如,如果两个最强的离子被选择,两个不连续的碰撞能量被设定,那么在每次循环中将进行4个独立的EPI扫描。
对于蛋白鉴别实验,最好采用UseRollingEnergy设置每一个多肽的CE值。
(UseRollingEnergy将在6.5部分的设置IDA选择标准中描述)。
其特点是根据每一个多肽的m/z值和电荷状态计算最优的碰撞能量。
在Startmass/StopMass窗口输入扫描范围100-1700。
在EPI扫描中采用最快的扫描速度(4000amu/sec),碎片离子仍然可以达到单位分辨。
这种扫描方式中,filltime设置为50ms,也可以根据灵敏度的要求进行调整。
点击Next继续。
以下描述IDA实验的选择标准。
设定潜在的母离子的质量范围,在Forionsgreaterthan和Forionssmallerthan框中输入要考虑的质量范围。
强度阈值允许设定EMSsurveyscan的离子的最小强度的阈值。
在Whichexceeds_counts(cps)框中输入希望的强度阈值。
强度低于指定强度阈值的离子将从峰队列中除去不进行ER扫描。
50000-100000cps是一个好的强度阈值的起点。
在Withchargestate框中打勾,指定进行MS/MS扫描的母离子的预期的电荷状态。
当这个选择标准激活以后,只有在ER谱中具有预期电荷状态的离子才会保留在从峰队列中考虑进行子离子扫描。
如果电荷状态在ER扫描中没有确定,可以在Includeunknowns框中打勾将其包括在峰队列中。
对于蛋白消化产物,如果电荷状态不确定,它极有可能是多电荷,因而很有意义。
ExcludeFormerTargetIons标准可以排除已经做过MS/MS的离子。
Always打勾可以将这些离子从剩余的运行中排除。
做LCIDA实验时,选择For_(sec);可以排除有限的时间窗口,在那段时间洗脱的母离子不进行多于一次的MS/MS扫描。
如果Never打勾,动态排除关闭。
最后,设定After_repeatoccurrences,允许一个离子在排除之前进行多次MS/MS扫描。
此处输入1,则离子在排除之前进行多于一次MS/MS扫描,意味着对于指定的肽离子共发生两次MS/MS。
点击Finish建立IDA方法。
6.4MS方法的精细调节
在AcquisitionMethod窗口的左边,MassSpec实验自动组合。
而且硬件profile设置的LC系统的外围设备自动添加进方法中。
关于外围设备的控制在建立LC系统的指南中有描述。
按照其它指南将泵及自动进样器加入IDA方法中。
一旦泵及自动进样器参数定义好后,MassSpec方法完成。
点击窗口左边的+EMS条目查看surveyscan参数。
在窗口右边输入Duration,这个时间不能够比泵走的时间长,应该反映在肽的MS/MS方法的时间窗口中。
选择Numberofscanstosum可以控制进行surveyscan的时间。
一般地,surveyscan花费的时间为TotalScanTime为0.5-1sec,或者Numberofscanstosum为2。
注意当Numberofscanstosum改变时,TotalScanTime相应改变。
接下来,点击EditParameters…钮选择源的设置。
如果用FlowNanosprayTM源,IonSprayVoltage(IS)设为~2300V(负离子模式为~-1700V),GS1设为0。
如果用TurboIonspray源,IS设为~5500V(负离子模式为~-4500V),IonSourceGas1(GS1)则与流速有关(流速越高,雾化气流速GS1也应该越高)。
点击窗口底端的一个或两个钮,Source/Gas或Compound的参数可以用于所有的实验。
点击OK,保存参数。
接下来,点击窗口左边的ERscan查看实验设置。
Center项下有两个条目,可以进行两个ERscans。
当样品有限时,可以打开在AdvancedMS表中的Q0Trapping,ER的扫描速度用250amu/sec,Resolution表中,Q1Resolution设为Open。
注意进行两个ERscans总的时间仅为400ms。
额外的这点时间是宝贵的,因为从较高分辨率的扫描中可以获得大量信息。
检查dependentscans的设置,点击左边的EPI实验。
注意当采用IDA时,ProductOf窗口设为30。
这表明该数值将由IDA软件自动设置。
改变Numberofscanstosum,可以调节每个子离子扫描的时间。
典型的设置为1-2sec或共2-4次扫描。
6.5设定IDA选择标准
点击方法的IDACriteria观察由IDAWizard得到的设置。
设定潜在的母离子的质量范围,在Forionsgreaterthan和Forionssmallerthan框中输入质量范围。
在Withchargestate框中,可以定义进行MS/MS扫描的母离子预计的电荷状态。
当该选择标准被激活以后,只有那些在ER谱中具有预期电荷状态的离子才会保留在峰队列中考虑进行子离子扫描。
如果ER扫描的电荷状态被破坏,可以在Includeunknowns框中打勾将其包括到峰队列中。
对于蛋白消化产物,如果电荷状态被破坏,很可能是多电荷,因而很有意义。
注意:
一定在UseEnhancedResolutionScantoconfirmstate框中打勾,否则EMSsurveyscan将被用于确定电荷状态。
在IntensityThreshold中设定进行EMSsurveyscan的离子的最小强度的阈值。
在Whichexceeds_(cps)框中输入希望的强度阈值。
强度低于指定强度阈值的离子将从峰队列中排除不进行ER扫描。
50000-100000cps是一个比较好的起点。
Excludeformertargetions标准可以排除已经进行了MS/MS扫描的离子。
在Always打勾可以从剩余的运行中排除这些离子。
进行LCIDA实验时,选择For_(sec);可以在有限的时间窗口排除,所以具有相同m/z值的母离子在那段洗脱时间内不再进行多于一次的MS/MS扫描。
如果Never被选择,动态排除被关闭。
最后,设定After_repeatoccurrences,在排除之前允许一个离子被多次进行MS/MS扫描。
当输入1时,在一个离子被排除之前,可以进行多余一次的MS/MS扫描,意味着对于一个指定的肽离子共有两次MS/MS扫描。
MassTolerance中设置的为各种include/excludefeatures的误差允许量,默认值为250mmu。
合理的质量允许范围为250-500mmu,与期望的MS数据的质量精确度有关。
激活Excludeisotopeswithin将特异性排除指定母离子的一定窗口之上的C13同位素的质量数。
对于这一部分3-4amu是有用的。
适用于出现在变量排除队列中的特定离子。
在确定相关同位素峰时,采用特定的质量允许范围。
仅相关同位素峰被特异性排除,而不是整个质量窗口。
在IDA过程中激活RollingCollisionEnergy,对于每一个进行MS/MS扫描的肽根据它的m/z值和电荷状态优化碰撞能量。
点击Setting钮可以看到定义m/zvs.CE关系的方程。
软件带有预先定义的关系(由斜率和截距定义直线)用于优化正常的胰蛋白酶肽的裂解。
用户可以调整这些值。
一般地,如果希望得到更多的碎片,可以增加截距的值。
如果知道样品的其它信息,可以建立Inclusion或Exclusionlists,确保在Include/Excludelist中得到希
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