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生物化学笔记

内容提要：

1、氨基酸与蛋白质

氨基酸分类：

常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸；氨基酸的酸碱化学，氨基酸两性解离，氨基酸的等电点；氨基酸的旋光性和紫外吸收。

蛋白质的共价结构：

蛋白质的化学组成和分类，蛋白质功能，蛋白质的形状和大小，蛋白质构象和组织层次。

肽：

肽键结构，肽的物理化学性质，活性多肽。

蛋白质一级结构测定：

Sanger试剂，DNS及Edman降解，二硫桥位置确定。

蛋白质的三维结构：

XRD原理；稳定蛋白质三维结构的作用力，肽平面和两面角；蛋白质的二级结构：

α-螺旋，β-折叠片，β-转角；超二级结构和结构域；球状蛋白的三级结构；亚基缔合和四级结构。

蛋白质结构与功能的关系：

肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能，镰刀状细胞贫血病；免疫球蛋白。

蛋白质的分离、纯化和表征：

蛋白质分子量测定，沉降分析及沉降系数，沉降系数单位，凝胶过滤及SDS-PAGE法测分子量；蛋白质的沉淀；电泳：

区带电泳、薄膜电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳。

2、酶和辅酶

酶催化作用特点：

反应温合、高效、专一、可调节控制；酶活性调节控制：

调剂酶浓度、激素调节、反馈抑制调节、抑制剂激活剂调节、别构调控、酶原激活，可逆共价修饰；酶的化学本质及其组成，辅酶和辅基，单体酶，寡聚酶和多酶复合体。

酶的命名和分类：

习惯命名法；国际系统命名法及酶的编号，六大类酶的特征。

酶的专一性：

“锁与钥匙”学说；诱导楔合假说；过渡态理论，过渡态类似物与医药和农药的设计，催化抗体。

酶的活力测定：

酶活力单位，比活力。

酶工程：

化学修饰酶，固定化酶，人工模拟酶。

酶促反应动力学：

底物浓度与酶反应速度，酶促反应动力学方程式及推导，米氏常数的意义和求法。

酶的抑制作用：

不可逆抑制和可逆抑制及动力学判断，一些重要的抑制剂，有机磷农药和磺胺药作用机制。

温度、PH、激活剂对酶反应影响。

酶的作用机制：

酶活性部位及研究方法；影响酶催化效率的有关因素：

临近和定向效应、底物形变和诱导契合、酸碱催化、共价催化、金属离子催化、多元催化和协同效应、微环境影响；溶菌酶作用机制和胰凝乳蛋白酶。

辅酶的结构与活性部位：

vit.B1和TPP，维生素PP和辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ，vit.B2和黄素辅酶，泛酸与辅酶A，vit.B6及其磷酸酯，vit.B12，生物素，叶酸，硫辛酸。

3、氨基酸代谢

氨基酸的脱氧、转氨和联合脱氨基作用，氨基酸脱羧基作用。

尿素的形成：

氨的转运和尿素循环。

氨基酸碳骨架的氧化途径，生酮氨基酸和生糖氨基酸。

由氨基酸衍生的生物活性物质：

氨基酸与一碳单位，酪氨酸及儿茶酚胺类物质，色氨酸衍生物，组胺，牛磺酸。

4、氨基酸及其重要衍生物的生物合成

必需氨基酸；氨基酸的生物合成。

氨基酸几种重要衍生物：

NO的形成，谷胱甘肽，肌酸，血红素，胆红素。

5、糖代谢

糖的生物学作用：

糖的结构特点和糖工程。

糖酵解作用：

酵解和发酵，酵解全过程和反应步骤；酵解过程中能量转变的估算；丙酮酸去路。

柠檬酸循环：

丙酮形成乙酰CoA，柠檬酸循环概貌和反应步骤；柠檬酸循环的化学总结算。

生物氧化—电子传递和氧化磷酸化：

氧化还原电势；电子传递和氧化呼吸链，电子传递抑制剂；氧化磷酸化作用，化学渗透假说，氧化磷酸化解偶联和抑制剂。

戊糖磷酸途径及生理意义；葡糖异生作用及途径；糖原的分解与生物合成。

6、脂质和生物膜

脂质：

脂肪酸结构特点，必需多不饱和脂肪酸。

磷脂：

甘油磷脂，卵磷脂，脑磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酰甘油，缩醛磷脂；鞘磷脂，鞘氨醇和神经酰胺。

糖脂：

脑苷脂，神经节苷脂。

类固醇，胆固醇。

生物膜的组成与性质：

膜脂，胆固醇对膜流动性的调节作用；膜蛋白功能和糖的细胞通信作用；生物膜分子结构的作用力和主要特征。

生物膜与物质运输：

被动运输与主动运输，钠钾泵，生物大分子跨膜运输。

人工模拟膜：

模拟膜的功能；模拟膜主要类型：

LB膜，BLM和脂质体

7、核酸

核酸研究进展：

生物技术的兴起，转基因产品，基因工程，基因芯片，人类基因组计划。

核酸的种类和生物功能。

核酸的结构：

碱基、核苷与核苷酸；核酸的共价结构，DNA双螺旋结构，DNA的拓扑异构，DNA的四级结构；mRNA、tRNA和rRNA的高级结构。

核酸的物理化学性质：

核酸的酶水解和核酸的酸碱性质，核酸的紫外吸收。

核酸的变性，复性及杂交。

8、核酸的降解

核酸和核苷酸的分解代谢：

嘌呤碱的分解，痛风病起因及别嘌呤醇作用机制；

嘧啶碱的分解。

核苷酸的生物合成：

嘌呤核糖核苷酸的从头合成及补救途径，抗癌和杀菌剂作用原理；嘧啶环的合成；脱氧核糖核苷酸的合成，5-Fu和氨甲喋呤的抗癌作用机制。

9、DNA的复制和修复

DNA的复制：

DNA的半保留复制，复制叉；DNA聚合酶及DNA聚合要素，DNA连接酶和拓扑异构酶。

DNA半不连续复制和冈崎片段；DNA复制的起始、延伸和终止；DNA复制的复杂性。

DNA损伤修复：

错配修复，直接修复，切除修复，重组修复和应急反应。

10、RNA的生物合成和加工

DNA指导的RNA合成，RNA聚合酶，不对称转录；启动子和转录因子，终止子和终止因子；转录的调节控制，操纵子模型；转录反应四阶段。

RNA生物合成的抑制剂：

嘌呤和嘧啶类似物，DNA模板功能抑制物，RNA聚合酶抑制剂。

RNA转录后加工：

原核生物中RNA的加工，真核生物RNA的加工，RNA拼接、编辑和再编码，酶性核酸；RNA生物功能多样性。

在RNA指导下RNA和DNA的合成：

RNA复制和RNA病毒复制的重要方式，RNA的逆转录和逆转录酶。

11、蛋白质生物合成

遗传密码：

三联密码，遗传密码的基本特性。

蛋白质合成及转运：

m-RNA是蛋白质合成的模板，t-RNA转运氨基酸，核糖体是蛋白质合成的工厂。

翻译的步骤。

蛋白质运输及翻译后修饰。

12、基因工程

DNA克隆的基本原理：

DNA限制酶和连接酶，克隆载体与宿主系统，外源基因导入宿主细胞，分离筛选及克隆；基因文库和cDNA文库。

聚合酶链式反应：

PCR基本原理，最适条件和发展应用。

DNA序列的测定

第一章氨基酸与蛋白质上册P123

1.1氨基酸

（一）蛋白质水解最后成为氨基酸混合物

酸水解得19种L-AA，色氨酸破坏。

碱水解得色氨酸，其余氨基酸消旋破坏。

酶水解不消旋破坏，但水解不彻底。

（二）α-氨基酸的一般结构

生物体内已发现氨基酸180种，常见氨基酸20种

1.2氨基酸的分类：

常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸

（一）常见蛋白质氨基酸，或称基本氨基酸。

每个氨基酸可用三个字母或单字母简写表示。

按侧链R基不同进行分类。

（1）按R基化学结构分类

1.脂肪族氨基酸15个

1.中性氨基酸5个

甘氨酸Glycine氨基乙酸GlyG无旋光

丙氨酸Alanineα-氨基丙酸AlaA

缬氨酸Valineα-氨基-β-甲基丁酸ValV

亮氨酸Leusineα-氨基-γ-甲基戊酸LeuL

异亮氨酸Isoleucineα-氨基-β-甲基戊酸IleI

2.含羟基或硫氨基酸4个

丝氨酸Serineα-氨基-β-羟基丙酸SerS

苏氨酸Threonineα-氨基-β-羟基丁酸ThrT

半胱氨酸Cysteineα-氨基-β-基丙酸CysC

甲硫氨酸Methionineα-氨基-γ-甲硫基丁酸MetM

③．酸性氨基酸及其酰胺4个

天冬氨酸Asparticacidα-氨基丁二酸AspD

谷氨酸Glutamicacidα-氨基戊二酸GluE

天冬酰胺Asparagineα-氨基丁二酸一酰胺AsnN

谷氨酸胺Glutamineα-氨基戊二酸一酰胺GlnQ

④.碱性氨基酸2个

赖氨酸Lysineα，ε-二氨基已酸LysK

精氨酸Arginineα-氨基-δ-胍基戊酸ArgR

2.芳香族氨基酸3个

苯丙氨酸Phenylalanineα-氨基-β-苯基丙酸PheF

酪氨酸Tyrosineα-氨基-β-对羟苯基丙酸TyrY

色氨酸Tryptophanα-氨基-β-吲哚基丙酸TrpW

3.杂环族氨基酸2个

组氨酸Histidineα-氨基-β-咪唑基丙酸HisH

脯氨酸Prolineα-吡咯烷羧酸ProP

（2）按R基极性性质分类

1.非极性R基8个

Ala（A）Val（V）Leu（L）Ile（I）Pro（P）

Phe（F）Trp（W）Met（M）

2.极性不带电R基7个

Gly（G）Ser（S）Thr（T）Cys（C）Tyr（Y）

Asn（N）Gln（Q）

3.带正电荷R基3个

Lys（K）Arg（R）His（H）

4．带负电荷R基2个

Asp（D）Glu（E）

另外Asx（B）：

Asp（D），Asn（N）

Glx（Z）：

Glu（E），Gln（Q）

两个Cys常氧化形成胱氨酸Cystie

（二）不常见蛋白质氨基酸P128

为相应常见氨基酸修饰而来，如：

5-羟赖氨酸，4-羟哺氨酸，γ-羧基谷氨酸，焦谷氨酸，磷酸丝氨酸，甲状腺素等。

（三）非蛋白氨基酸P129

1.L型α-氨基酸衍生物P128

2.β、γ或δ-氨基酸

3.D-氨基酸，如D-Glu和D-Ala

常见有：

肌氨酸（N-甲基甘氨酸），β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，瓜氨酸，鸟氨酸，高半胱氨酸。

1．3氨基酸的酸碱化学

（一）氨基酸两性解离

-H+-H+

A+A0A-

（质子供体）+H++H+（质子受体）

Ka1=[A0][H+]/[A+]pH=pKa1+lg[A0]/[A+]

Ka2=[A-][H+]/[A0]pH=pKa2+lg[A-]/[A0]

综合pH=pHa+lg[质子受体]/[质子供体]

由此1.由pH值、AO/A+或A-/A0测pKa

2.pKa为常数，由pH计算A0/A+或A-/A0

3.由[质子受体]/[质子供体]可计算pH

（1）氨解酸的pKa测定

甘氨酸解离曲线P131图3-9

1molGly溶于水，溶液pH=6.0

用1molNaoH溶液滴定得曲线B，消耗0.5mol时，在pH9.6处有一拐点，此时[A0]=[A-]pH=pKa2测出pKa2=9.6

用1molHcl滴定得曲线A，当消耗0.5molHCl时得一拐点，pH=pKa1测出pKa1=2.34

带有可解离R基的氨基酸相当于三元酸，有三个pKa值，Glu和Lys滴定曲线见P132图3-10

（二）等电点

氨基酸或其他带电颗粒处于净电荷为零的兼性离子状态时介质的pH值，用pI表示，又称等电pH。

对于Gly，pI=5.97，为曲线A和曲线B之间的拐点，Gly为兼性离子，净电荷为零。

等电点pH值计算：

pI=1/2（pKa+）+pKa）

GlypI=1/2（2.34+9.60）=5.97

对于带可解离R基的氨基酸如Asp的pKa，pKa1=2.09pKa2=3.86pKa3=9.82

等电点pIP=1/2（pKa+pKa2）=1/2（2.09+3.86）=2.98

同理推出LyspI=9.74

P133表3-3列出20种氨基酸的pKa值和pI可做常数用，其中七个氨基酸R基有pKa值。

1.4氨基酸的光学性质

（一）旋光性一个无旋光Gly17个含一个不对称碳原子，两个含两个不对称碳原子Thr和Ile，有四种光学异构体。

胱氨酸分子内部对称有内消旋体，有三种异构体。

比旋光为氨基酸物理常数之一，但随pH值变化常见氨基酸比旋光度可用来鉴别氨基酸，P144表3-4

（三）氨基酸的紫外吸收

λmax（nm）ε（摩尔消光系数）

Phe2572.0×102

Tyr2751.4×103

Tvp2805.6×103

蛋白质在280nm波长下测光吸收，光吸收值越大，相对纯度越高，常用在蛋白质提纯过程。

1．5蛋白质的共价结构

（一）蛋白质氨基酸首尾相连形成蛋白质。

平均含氮量为16%

蛋白质含量=蛋白氮×6.25

从细菌到人类所有物种的蛋白质都由这一组20种氨基酸构成。

1.单纯蛋白质：

仅由氨基酸组成，如核糖核酸酶，肌动蛋白等。

见P158

表4-1。

2.缀合蛋白质：

除氨基酸外，还有非蛋白部分，称为辅基或配基，如血红蛋白、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等，见P158表4-2。

（二）蛋白质功能

生物界蛋白质种类估计有1010~1012种，20种氨基酸全排列为Anm=2020。

1.催化（酶）：

生物体内化学反应几乎都是在酶催化下进行的。

2.调节：

基因表达调控中的蛋白因子，阻遏蛋白和激素中许多为蛋白质，如胰岛素等。

3.转运：

血红蛋白输氧气，细胞色素C传递电子。

4.贮存：

如种子中谷蛋白，蛋中卵清蛋白。

5.运动：

肌动蛋白，驱动蛋白。

6.结构：

胶原蛋白，α-角蛋白。

7.信息传递：

受体蛋白。

8.防御和进攻：

免疫球蛋白，毒蛋白如蛇毒。

9.异常蛋白：

胶质蛋白。

（三）蛋白质的构象

为蛋白质具有的特有空间结构或称三维结构。

在生理条件下，蛋白质只有一种或很少几种构象在能量上是有利的。

功能来自构象：

为表达蛋白质结构上不同组织层次，一般采用下列专门术语：

1.一级结构：

又称化学结构，指蛋白质多肽链氨基酸连接在一起的顺序，包括二硫键位置，为共价键连接的全部情况。

2.二级结构：

多肽链借助氢键排列成自己特有的α-螺旋和β-折叠片段（P161图4-1），这些片段构成规则结构，并沿一维方向伸展。

3.三级结构：

由二级结构元件（α-螺旋，β-折叠等）构造成的总三维结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间相互关系。

4.四级结构：

寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。

寡聚蛋白是由两条或多条多肽链构成，其中每条多肽链称为亚基或亚单位。

1.6肽：

P162

肽为氨基酸的线性聚合物，蛋白质是由一条或多条多肽链构成。

（一）肽和肽键结构

肽的命名从N端开始到COOH端，氨基酸残基按顺序从左向右写，-NH2末端在左，-COOH端在右。

如Ser-Gly-Phe，称为：

丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。

一般氨基酸数目<12~20的肽为寡肽（小肽）；>20的肽为多肽。

（二）肽的物理化学性质

（1）与氨基酸同，为离子晶格，熔点高，在水溶液中以偶极离子存在。

多肽中酰胺的氢不易解离，肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基和α-羧基，以及侧链R基上的可解离基团，如Glu的γ-COOH、Lys的ε-NH2。

（2）滴定曲线：

也有等电点，为多价离子等电点。

以Gly-Glu-Lys-Ala四肽为例（P166表4-6）：

1当pH<3.5，末端可解离基团全部质子化，2个+NH3、2个COOH，净电荷+2；

2pH3.5-4.5，C-末端COOH解离（pKa=3.7），为2个+NH3、一个COOH、一个COO-，净电荷+1；

3pH4.5~7.5，Glu的γ-COOH解离，2个+NH3、2个COO-（pKa=4.6），为等电点，净电荷为0；

4pH7.8~10.2，N末端-+NH3解离（pKa=7.8），一个+NH3、一个NH2、2个COO-、净电荷-1；

5pH>10.2，ε-+NH3解离，2个NH2、2个COO-，净电荷-2。

pH在等电点以上（碱性），多肽带负电荷。

pH在等电点以下（酸性），多肽带正电荷。

蛋白质滴定曲线更加复杂。

（3）化学反应

①与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色，为α-NH2反应（注意：

伯胺也可使茚三酮显紫色），氨基酸、多肽均有此反应。

Pro为仲胺（亚氨基氨基酸），与茚三酮生成黄色物质。

茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。

②肽键的双缩脲反应：

多肽，蛋白质中有肽键，有此反应，氨基酸没有此反应。

双缩脲：

H2N-CO-NH-CO-NH2，P163。

双缩脲反应：

含有两个或两个以上肽键的化合物（如双缩脲或二肽以上等多肽）在碱性溶液中能与CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物，可定性或定量测定蛋白质含量，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

（三）活性多肽：

动植物体内存在许多具有生理活性的多肽，多肽药物已获得人们的重视。

二肽：

肌肽β-Ala-His，抗氧化，抗自由基，消炎，调节免疫。

甜二肽AspartameAsp-Phe-OCH3，比蔗糖甜200倍。

三肽：

谷胱甘肽γ-Glu-Cys-Gly，维持红细胞及其蛋白质中Cys的-SH处于还原态。

四肽：

促胃酸激素。

五肽：

脑啡肽，内源性吗啡，与吗啡受体结合。

蛋氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheMet。

亮氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheLeu。

八肽：

α-鹅膏蕈碱，见P168图4-6，剧毒毒素。

九肽：

牛催产素，牛加压素（升高血压），见P167，两者只差两个氨基酸，但生理作用极不相同。

十肽：

短杆菌肽，见P532，为抗生素。

促黄体生成激素释放因子，见P551，为激素。

十六肽：

内啡肽，有镇痛作用。

二十四肽：

促皮质素（ACTH），治关节炎，已商品化。

二十六肽：

蜂素溶血肽，抗关节炎。

五十一肽：

胰岛素，降血糖。

以活性多肽研究为基础的药物研究：

血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂（ACEI）的开发是近代高血压治疗史上

的重大进展。

人体内存在的血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）为十肽，无活性，但在ACE作用下

转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）为八肽，具有收缩血管平滑肌作用，使血压升高。

ACE

DRVYIHPFHL（AngⅠ）DRVYIHPF（AngⅡ）。

ACEI可使ACE失活，使AngⅠ不能形成AngⅡ，从而降血压，研究Ang

Ⅰ活性部位，作用机理，进而设计并合成ACEI，已开发出二十多种降压药物，

如巯甲丙脯酸（Captopril）、依那普利（Enalapril）、赖诺普利（Lisonopril）等。

1.7蛋白质一级结构测定：

P168

测定蛋白质中共价键连接的全部情况，包括存在的链内、链间的二硫键位置，氨基酸数目、类型和顺序。

蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构，而三维结构决定其生物活性和功能。

蛋白质中氨基酸顺序是由基因决定的，是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。

蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史，具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。

如细胞色素C（P182），是一种含血红素的电子转运蛋白，存在于所有真核生物的线粒体中。

40多种物种的细胞色素C序列的研究揭示，在细胞色素C中含有的一百多个氨基酸残基，其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的（P182图4-16），这些不变残基对于细胞色素C的生物学功能至关重要，由此可根据细胞色素C序列的物种差异建立进化树（P183图4-17）。

来自任两个物种的细胞色素C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远。

（一）蛋白质测序

样品纯度应>97%，测分子量（允许误差10%）。

1.蛋白质分子中多肽链的数目：

测N-末端和C-末端残基的摩尔数。

寡聚蛋白要用变性剂将亚基拆开。

2.每一多肽链氨基酸组成：

鉴定N-末端残基和C-末端残基，定出氨基酸序列参考点。

3.按专一方式断裂成较小的肽片段：

可用酶或化学方法完成，并用多种断裂方法，将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。

4.侧各肽段氨基酸序列：

常用Edman降解法，用自动序列分析仪。

5.测定片段次序：

用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。

6.确定二硫键位置。

（二）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定

（1）N-末端分析

1二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：

Sanger反应。

2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂，与游离末端氨基反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质，再酸性水解生成DNP-氨基酸（黄色），提取分离后可进行鉴定和定量测定。

此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。

2丹磺酰氯（DNS）法：

有荧光，灵敏度高。

5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯（DNS），结构式见170。

3Eman降解

苯异硫氰酸酯（PITC）法：

Phenylisothiocyanate（PITC）能顺序从肽的N-端将氨基酸残基一个个切下来，还可用来测定氨基酸序列。

PITC与多肽链每反应一次，得到一个PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。

PTH（phenylthiohydantoin）：

苯乙内酰硫脲。

PTH-氨基酸可用TLC或HPLC快速测定，由此发展出氨基酸序列自动分析仪。

4氨肽酶法：

用外切酶，从N-末端逐个向里切。

最常用的是亮氨酸肽酶，适用于N-末端残基的氨基酸被封闭的肽（如环肽）；N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用焦谷氨酸氨肽酶。

（2）C-末端分析

①肼解法：

蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应，除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。

肼进攻肽键而不易与-COOH反应，肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。

②还原法：

用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇，肽水解后可分离、鉴定。

③羧肽酶法：

专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸，P171图4-7。

（三）二硫键断裂：

用变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，分子内部-S-S-露出，并用HSCH2CH2OH处理，则-S-S-变成2个-SH，再用碘乙醇保护-SH不被氧化，P172图4-8。

也可用过甲酸氧化，将-S-S-变成2个磺酸基。

（四）氨基酸组成分析：

可用氨基酸分析仪进行测定。

样品可用酸完全水解（6mol/LHCl），再用碱水解测Trp。

测出Asx和Glx，酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出。

P172表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。

（五）多肽链部分裂解成小肽段，分别测序：

现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段，需将蛋白质先裂解成较小肽段，分离后测序。

（1）酶裂解法：

常用的蛋白酶有以下几种（为内切酶）：

胰蛋白酶：

水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键，如Lys，Arg。

糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：

肽键羧基端为芳香族氨基酸，如Phe、Trp、或Tyr，以及疏水氨基酸Leu、Met或His。

胃蛋白酶：

特异性不太强，切点多，肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。

（2）化学裂解法：

溴化氰BrCN断裂羧基端为Met的肽键，反应见P175图4-10，生成肽酰高丝氨酸。

（六）肽段氨基酸序列测定

（1）Edman化学降解法：

每反应一次生成一个PTH-AA，层析分离、鉴定，剩下减少一个残基的肽链，又有新N-端参加下一轮反应。

由此进行氨基酸序列自动分析，进行几轮反应就能测出几个残基序列。

最低样品用量仅5pmol。

Edman降解现已有多种改进。

如DNS-Edman测序，可提高灵敏度；试剂的改进，用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏。

（2）质谱法：

电喷射电离（ESI），见P178图4-11。

使蛋白质离子解吸进入气相，15肽以下均可用。

（七）肽段在多肽链中次序确定

用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段，由于切口错位，可由重迭肽（两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段）