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从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌苏云金解析
从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌
——苏云金芽孢杆菌
崖城高级中学高一
(1)班龚彩秀
指导老师:
翟鸿武
一次偶然的机会让我在一本生物杂志上接触到苏云金芽孢杆菌(BacillusThuringiensis,Bt)当时的我觉得很神奇——它能杀死农作物害虫。
人类从刀耕火种以来,一直备受害虫的威胁,给人类的生活造成了多种危害,其中虫害是威胁农作物高产的主要原因之一,全世界每年因此损失约数千亿美元,每年世界上因虫害而造成的农产品损失估计为13%。
在我国,水稻每年因虫害减产10%以上,小麦减产近20%,棉花产量损失达20%~30%。
为了控制农林病虫害,人们不得不大量使用化学农药,但长期大剂量地使用化学合成的农药,致使多种害虫对化学杀虫剂产生了一定的抗性,因此不但不能有效地控制害虫,结果还面临着三大难题无法解决,①环境污染,残毒上升,人畜均遭毒害;②用药浓度不断提高,防治费用不断增加,不得不无休止地研制新农药;③杀伤天敌,破坏了生态平衡,引起害虫再猖獗和次虫害虫大爆发,导致自然界中恶性循环。
苏云金芽孢杆菌由于能在生长代谢过程中产生对多种农林害虫具有特异性杀虫毒力的生物活性蛋白,并能由此生产相应的微生物杀虫剂来用于害虫生物防治而受到国内外的广泛重视。
广泛的研究与应用实践证明,与化学农药等其他类型的杀虫剂相比,Bt杀虫剂具有杀虫特异性强,对人、畜及非目标昆虫无毒副作用;安全性能好,不污染环境,由于具有多种类型的杀虫晶体蛋白,昆虫难以产生抗性或产生抗性较缓慢;具较低的生产成本等优点。
目前已推广使用的表达Bt毒素基因的转基因植物都有较为显著的抗虫性能,在大田栽培中无需或只需喷洒少许化学杀虫剂,从而大大减少了对环境的污染。
因此苏云金芽孢杆菌作为新型生物农药解决了一个长期以来让无数劳动农民头痛的问题。
而对生物有着浓厚兴趣的我对它有种相识恨晚的感觉,而这次的“科技创新”活动让我坚定了对它认识的决心,在老师和同学们的帮助下,我开始了我的创新实验。
图一Bt生物杀虫剂
摘要:
从崖城镇到马丹村沿线的农田里取20个点,南滨农场20个点,水南村20点,每个点采土样1份,总共土样60份,使用最常规的菌株分离方法——无菌水分离法进行菌株分离,取0.1—0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中,在旋涡振荡器上振荡3min,将土粒打碎,然后放于200rpm摇床上振荡20min,75℃水浴锅中水浴17min,充分将非芽孢菌杀死,待稍静置后,选取10-2、10-3、10-4三个稀释度,分别吸取100ul菌悬液于BP平板上,涂布均匀,于37℃倒置培养,培养大概3天时间后,用肉眼观察,这时会发现在培养皿上出现许多形状、颜色、湿度、大小不同的菌落,将不同的菌落进行一一标号,而后一一制成片子,放到10X100倍油镜下进行显微镜观察,每个菌株的观察结果都进行拍照,并记录结果,最后对结果进行分析,确定是否苏云金芽孢杆菌。
关键词:
苏云金芽孢杆菌油镜伴胞晶体蛋白
前言:
认识苏云金芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌(BacillusThuringiensis,Bt)属于革兰氏阳性细菌,是目前世界上应用最广泛的微生物杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌的发现有上百年的历史,最初日本人石渡(Isheiwata)在1901年从病蚕尸体中分离出一株所谓猝倒细菌(sotto.bacteria)。
1911年ErnstBerliner在德国苏云金(Thuringia)的一个面粉厂的地中海粉斑螟患病幼虫中又分离得到这种产伴孢晶体(一种晶体蛋白,它是一种能杀死害虫的毒素。
)的芽孢杆菌,1915年定名为苏云金芽孢杆菌,一般称苏云金杆菌。
苏云金芽孢杆菌特征
形态特征
营养体为粗壮的直杆状,两端钝圆,通常成簇、分散形式排列,或以2-4个菌体组成短链。
菌体大小为1.2-1.8X1.8-3.5微米,以周生鞭毛运动,或无鞭毛不运动。
营养体生长到稳定期的后期,在其菌体一端或中央形成一个卵圆形的芽孢,大小依菌种不同而不同,芽孢囊不膨大。
生长至衰亡后期,芽孢囊破裂,芽孢被释放出来。
伴孢晶体通常位于菌体的另一端,其形态、大小与数目依菌种与菌株的不同而异,有菱形、长菱形、方形等形状,每个营养体可形成一至数个伴孢晶体。
培养特征
在牛肉膏蛋白胨培养基(BP它是用于细菌培养的最常用的培养基)上,苏云金芽孢杆菌可以形成暗白色菌落,表面干燥,不隆起,略带皱纹,边缘不整齐,其菌落特征也依菌种与菌株的不同而有所差别。
图二培养后的菌落
生态环境特征
苏云金芽孢杆菌在土壤、病死的昆虫、植被以及污水、尘土等基质上均有分布。
一些研究表明,不同菌种的苏云金芽孢杆菌在土壤中的分布表现出一定的地狱特性,且分布数量与土壤类型、pH值、土壤腐殖质、植被及其他微生物种群与数量有关。
杀虫机理
苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体蛋白进入到昆虫体内后,它们将与一些昆虫细胞膜上特定蛋白受体接合,使细胞膜上出现大量的孔道,从而破坏了细胞膜的选择性透性,使得一些大分子或细胞不需要的分子能自由通过细胞膜,破坏了细胞内外的离子浓度平衡,致使细胞正常生理代谢遭到破坏,最后细胞死亡,因此起到了杀死昆虫的作用。
实验目的:
1.培养学生的初步研究能力和创新能力,培养学生的动手能力。
2.培养学生要有实事求是、反复实验的科学态度,帮助学生掌握科学研究的基本过程培。
3.加强学生环境保护意识的培养。
4.初步了解从土壤中分离微生物大体思维和主要步骤。
实验步骤和实验过程:
一、采样
我从崖城镇到马丹村沿线的农田里取20个点,南滨农场20个点,水南村20点,每个点采土样1份,采样时,去除地表覆土,在地表下5~20厘米处取25克土壤,装在一个样品袋中,算作一个样品,贴好标签,总共为60份土样,这60份土样的潮湿程度、肥沃程度、周边环境都不一样,这样就保证了苏云金芽孢杆菌生活环境的多样性。
图三崖城农田采土样
二、样品土壤菌种分离
因为土壤中含有其他大量的细菌和其他微生物,所以我们要将大部分非芽孢细菌在高温下杀死,然后将剩下的芽孢杆菌进行进一步的分离,我采用的分离方法为无菌水分离法。
1、具体方法为:
取0.1—0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中,在旋涡振荡器上振荡3min,将土粒打碎,然后放于200rpm摇床上振荡20min,75℃水浴锅中水浴17min,充分将非芽孢菌杀死,待稍静置后,选取10-2、10-3、10-4三个稀释度,分别吸取100ul菌悬液于BP平板上,涂布均匀,于37℃倒置培养三天。
2、具体实验流程:
晒干土样
称取0.1-0.2g土样,倒入15ml灭菌的离心管
加入10ml灭菌水/每管,盖上盖子,摇匀
旋涡振荡器上振荡5min
200rpm摇床上振荡20min
75℃水浴锅中水浴20min,摇一下/10分钟以上步骤在实验室完成
以下步骤在无菌操作台内完成
1ml
1ml
1ml
9ml灭菌水9ml灭菌水9ml灭菌水
100ul
100ul
100ul
涂BP平板
123
37℃倒置培养3天
图四培养分离
三、镜检
1、将培养三天后的平板拿出来,这时我们会发现平板上会出现一块快圆形的菌落,它们的形状和颜色深浅不一,我将不同的菌落分别用标记出来(比如:
我在茄子地第30号土样中发现4种不同菌落,那么我就将它们分别标为Q30-1、Q30-2、Q30-3、Q30-4)方便后面的镜检和镜检结果记录。
2、将所有菌落进行标记后,我就对这些菌落进行镜检,所谓镜检就是将菌落放在显微镜下观察(采用10X100倍油镜观察)看是否产生了伴孢晶体蛋白,从而确定我所要找的苏云金芽孢杆菌。
镜检的主要实验步骤:
(1)、制片取与菌落相同数量的载玻片并与菌落一一对应在载玻片上标号,在载玻片上滴一滴无菌水,然后用接种环挑取少量菌体放入无菌水中,并涂均,风干。
(2)、固定风干后,将载波片在酒精灯微火上来回3-4次,使菌体能更好的固定在载玻片上。
(3)、染色用配好的碱性品红染色剂染色1-2分钟,然后用蒸馏水清洗2-3次,风干备用。
(4)、显微镜观察采用10X100油镜进行观察,对观察结果拍照,并记录结果。
图五制片图六显微镜观察
结果与讨论:
经过大概半个月时间的实验与观察,发现下面菌株能产生伴孢晶体:
其他
菌落
土壤类型
晶体形状
晶体蛋白的产量情况
备注
H11-2
黄瓜地
菱形
多
X16-1
香蕉地
菱形
少
Q28-3
茄子地
菱形
多
值得进行后面研究并出成品
Q39-2
茄子地
方形
一般
D53-1
豆角地
菱形
少
图七H11-2图八Q28-3
我将H-11-2、Q28-3的菌液涂抹到豆角、茄子和黄瓜等农作物的叶子上,两天后观察,发现在涂抹菌液作物的周边有昆虫死亡的现象,而在没有涂抹的作物周围没有昆虫死亡。
崖城是一个盛产瓜菜的地方,而这些瓜菜最终去向是被人们食用,化学农药对人体的危害很大,要是我们能将Bt杀虫剂取代化学农药,那么我们的瓜菜将成为真正的绿色食品,让人们买得放心,吃得安心,这样我们崖城的瓜菜销量将会突破新高。
参考文献
[1]张用梅.《球形芽孢杆菌及其杀蚊原理和应用》[M].北京:
科学出版社,1995
[2]罗绍彬,阎建平,陈宗胜.南方六省杀虫细菌资源调查初报[J].杀虫微生物,1991,3:
86289
[3]戈登RE,海恩斯WC,帕格CHN,等.芽孢杆菌属.蔡妙英,刘聿太,战立克等译.北京:
农业出版社,1983.
[4]喻子牛主编.苏云金杆菌.北京:
科学出版社,1990.
感谢
首先要感谢我们的生物老师翟鸿武老师的经心指导,其次,我们要感谢海南省热带农业资源利用开发研究所为我们的实验提供必需的试剂、仪器和指导,同时也要感谢学校领导、老师、学生的大量支持和关心。
在大家的帮助下我们的实验才得以顺利完成,在此,我们对他们致以最诚挚的谢意。
图八我们的实验团队
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